Methodenartikel

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

11.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54698

⸱

4 november 2016

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

In dit artikel

Samenvatting

Vele experimentele systemen zijn gebruikt om de mechanismen reguleren T cel ontwikkeling en functie van een immuunrespons begrijpen. Hier een genetische benadering met behulp van retrovirale transductie wordt beschreven, dat is economisch, tijd efficiënt, en nog belangrijker, zeer informatieve bij het identificeren van de regelgeving paden.

Samenvatting

De ontwikkeling en functie van helper-T-cellen moeten strikt gereguleerd zijn om een geschikte immuunrespons te induceren die specifieke pathogenen elimineert en tegelijkertijd auto-immuniteit voorkomt. Veel benaderingen met behulp van verschillende modelorganismen zijn gebruikt om de mechanismen die de ontwikkeling en functie van helper-T-cellen controleren te begrijpen. Studies met muismodellen zijn echter zeer informatief gebleken vanwege de beschikbaarheid van genetische, cellulaire en biochemische systemen. Eén genetische benadering bij muizen, gebruikt door veel laboratoria, omvat retrovirale transductie van primaire helper-T-cellen. Dit is een krachtige aanpak vanwege de relatieve eenvoud, waardoor het toegankelijk is voor bijna elk laboratorium met basisvaardigheden in moleculaire biologie en immunologie. Daarom kunnen meerdere genen in wild type of mutante vormen gemakkelijk worden getest op functie in helper-T-cellen om hun belangrijkheid en werkingsmechanismen te begrijpen. We hebben deze aanpak geoptimaliseerd en beschrijven hier de protocollen voor de productie van hoogtitreer retrovirussen, isolatie van primaire muis helper-T-cellen en hun transductie door retrovirussen en differentiatie naar de verschillende helper-subsets. Ten slotte wordt het gebruik van deze aanpak beschreven bij het onthullen van mechanismen die door microRNA's (miRNA's) worden gebruikt om paden te reguleren die de ontwikkeling en functie van helper-T-cellen controleren.

Inleiding

De immuunrespons moet sterk gereguleerd zijn om infecties te elimineren, maar aanvallen op eigen weefsel te voorkomen die tot auto-immuniteit leiden. Helper-T-cellen spelen een essentiële rol bij het reguleren van de immuunrespons, en er is veel moeite geleverd om hun ontwikkeling en functie te begrijpen (geïllustreerd in verschillende recente reviews 1-3). Er zijn echter nog veel vragen en er zijn veel benaderingen gebruikt om de mechanismen die de ontwikkeling en functie van helper-T-cellen beheersen te bestuderen. Deze varieerden van het gebruik van in vitro celcultuursystemen tot hele dieren. Celcultuursystemen, vooral die met gebruik van cellijnen, bieden het voordeel van gebruiksgemak en de mogelijkheid om grote hoeveelheden materiaal te genereren voor geavanceerde biochemische analyses. Ze hebben echter last van hun beperkte vermogen om de werkelijke omstandigheden die optreden in een immuunrespons na te bootsen. In tegenstelling daarmee bieden experimenten met hele dieren het voordeel van relevantie, maar ze kunnen last hebben van moeilijkheden bij manipulatie en de mogelijkheid om nauwkeurige controles uit te voeren, naast hun hoge kosten en ethische implicaties. Niettemin vereist de overgrote meerderheid van de huidige studies naar helper-T-cellen nog steeds het gebruik van experimenten met hele dieren die primaire T-cellen omvatten, vanwege het onvermogen van cellijnen om de exacte stappen die in het hele dier optreden te dupliceren. Daarom is het essentieel om kosteneffectieve benaderingen te gebruiken die zeer informatief zijn.

Genetica is een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling en functie van helper-T-cellen te bestuderen, maar traditionele methoden die gen-knockouts of transgenen omvatten, zijn tijdrovend en duur, dus vaak buiten het bereik van kleine laboratoria. Retrovirale transductie biedt echter een krachtige, snelle en kosteneffectieve genetische benadering om de mechanismen van specifieke genproducten te bestuderen. Daarom wordt het vaak gebruikt in artikelen die de ontwikkeling en functie van helper-T-cellen bestuderen.

We hebben een procedure voor retrovirale transductie van helper-T-cellen geoptimaliseerd. Het maakt gebruik van het pMIG (Murine stamcelvirus-Internal ribosoom entry site-Groen fluorescent eiwit) retrovirale expressievector, waarin het gen van belang kan worden gekloond en daardoor kan worden geëxpresseerd vanuit de retrovirale lange terminale herhaling (LTR) 4. Bovendien is er stroomafwaarts van het ingevoegde gen van belang een interne ribosoom entry-sequentie (IRES) gevolgd door het groen fluorescent eiwit (GFP) gen, zodat getransduceerde cellen gemakkelijk kunnen worden gevolgd door hun expressie van GFP. De vector is oorspronkelijk afgeleid van de Murine Stamcel Virus (MSCV) vectoren, die mutaties bevatten in repressor bindingsplaatsen in de LTRs waardoor ze resistent zijn tegen silencing en dus hoge expressie geven in veel celtypen, inclusief helper-T-cellen 5,6. Productie van retrovirus met een hoog titer vereist een eenvoudig tijdelijke transfectieprotocol van menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen met de MIG vector en een helper virus vector die de retrovirale GAG, Pol en Env genen tot expressie brengt. Hiervoor werkt de pCL-Eco helper virus vector 7 goed bij het produceren van hoog titer replicatie incompetente retrovirussen.

Hier worden deze protocollen voor retrovirale productie en transductie van primaire muis T-cellen beschreven, naast enkele van onze resultaten die deze aanpak gebruiken om miRNA-regulatie van genregulatie te bestuderen die helper-T-celdifferentiatie controleert. miRNA's zijn kleine RNA's van ongeveer 22 nucleotiden in lengte die post-transcriptionele genregulatie reguleren door middel van het targeten van homologe sequenties in eiwitcoderende boodschapper-RNA's en het onderdrukken van translatie en het induceren van boodschap onstabiliteit 8,9. miRNA's spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van gen-regulatie. Ze zijn essentieel in de vroegste stadia van ontwikkeling, aangezien embryo's die geen miRNA's kunnen produceren in een zeer vroeg stadium sterven 10. Bovendien zijn miRNA's later belangrijk bij de ontwikkeling van veel weefsels. Men denkt dat ze functioneren door de expressie van genen vereist voor ontwikkelingsprogramma's te verfijnen 1. In helper-T-cellen spelen miRNA's meerdere rollen en zijn ze vereist voor de ontwikkeling van regulatorische T-cellen (Treg) 11-14. We gebruikten retrovirale transductie als een middel om de mechanismen van miRNA-regulatie van Treg-differentiatie te ontleden 15. Door dergelijke studies werden belangrijke individuele miRNA's bepaald door retroviraal-gemedieerde overexpressie. Vervolgens werden relevante genen geïdentificeerd die door deze miRNA's worden gereguleerd om de moleculaire paden geregeerd door miRNA's in helper-T-celdifferentiatie te begrijpen.

Protocol

Alle muis werkzaamheden in deze protocollen werd uitgevoerd overeenkomstig de Dieren Scientific Procedures Act, UK onder het dier Project License 70/6965.

1. retrovirale Productie

Vóór procedure alle vereiste goedkeuringen voor het produceren van genetisch gemodificeerde organismen en het gebruik van retrovirussen in zoogdiercellen.

  1. Groei van HEK 293T cellen
    1. Groeien HEK 293T cellen op 10 cm weefselkweekplaten in HEK 293T medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden / ml penicilline 0,1 mg / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine) . Voor algemene cel passage, split cellen 01:10 bij het bereiken samenvloeiing door het verwijderen van medium en pipetteren de cellen van de plaat met verse HEK 293T medium.
      LET OP: De cellen moeten samenvloeiing te bereiken in 2-3 dagen. 293T HEK cellen hechten losjes aan de plaat zodat trypsine is niet vereist.
    2. 24 uur voorafgaand aan transfectie, split een confluent plaat van cellen 1:10 een 10 cm plaat (één plaat per transfectie) zodat de volgende dag de cellen -50% confluent.
  2. Transfectie door calciumfosfaatprecipitatie
    1. Ongeveer 1 uur voorafgaande aan transfectie medium verwijderen van cellen en wordt voorzichtig 9 ml vers medium HEK 293T cellen loskomen van de plaat te voorkomen.
    2. Bereid 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS 2x) en een verse 2,5 M CaCl 2-oplossing zoals beschreven in Tabel 1. Ontdooi DNA voorraden. Voor de meest efficiënte transfecties gebruikt prep plasmide DNA kwaliteit.
    3. In 6 ml met ronde bodem en 15 ml conische buis voeg 5 ug retroviraal DNA (pMIG) 4, 5 ug Helper virus DNA (PCL-Eco) 7 en H 2 O tot 420 pl. Voeg 80 ul van 2,5 M CaCl2 waardoor het uiteindelijke volume op 500 pl.
      Opmerking: Dit samen met de volgende stap (toevoeging van 2x HBS) kan op regelmatige bank zolang algemene sterile techniek wordt gebruikt.
    4. Voeg langzaam 500 ui 2x HBS druppelsgewijs aan bovengenoemde DNA mengsel onder zachtjes wervelen zodat de oplossing continu gemengd en het CaPÛ4 neerslaat zelfs grotere kristallen.
    5. Verwijzing naar een weefselkweek kap en voeg langzaam het CaPÛ4 DNA mengsel (1 ml) druppelsgewijs aan het 9 ml medium voor de cellen onder voortdurend en voorzichtig schudden de plaat. Opnieuw wees niet te cellen los te maken van de plaat. Plaats de cellen terug in de incubator.
      LET OP: Op dit punt zal de capo 4 neerslag gemakkelijk zichtbaar onder een microscoop als kleine kristallen over de grootte van de bacteriën. Deze worden gemakkelijk waargenomen na 30-60 min wanneer de kristallen een kans om naar de bodem van de plaat hebben.
  3. Het verzamelen van virus in kweeksupernatanten.
    1. De volgende dag (ergens 12-24 uur na transfectie) verwijder het medium en voeden de cellen met 10 mlvers HEK 293T medium opnieuw zorg dat u de cellen niet los van de plaat.
      LET OP: Deze verdunt uit lymfocyten remmende stoffen die de HEK 293T cellen scheiden in het medium tijdens de transfectie.
    2. In de avond van de tweede dag (~ 24 uur na transfectie) voeden cellen met 3,5 ml vers HEK 293T medium. Zorg ervoor dat de plaat in de incubator is dat precies waterpas staat, zodat de ene kant niet droog wordt overgelaten.
    3. Verzamel medium ~ 12 uur later (bewaar bij 4 ° C) en voer met 3,5 ml vers medium HEK 293T. Herhalingsbundel 2 keer op ongeveer 12 uur na zodat ongeveer 10 ml medium wordt verzameld. Dit is het virus voorraad.
    4. Spinnen achtergebleven HEK 293T cellen en celresten door centrifugeren bij 600 g gedurende 5 min. U kunt ook filteren met een 0,45 pm, lage eiwitbinding, spuit filter. WINKEL virus bij 4 ° C, en voor de beste titers gebruikt binnen een dag of twee, als de titer langzaam afnemen bij 4 ° C. Niet frEEZE, omdat dit de titer aanzienlijk afneemt.

2. Isolatie van Primary naïeve CD4 + T-cellen

  1. Isolatie van leukocytcellen
    1. Euthanaseren muizen door cervicale dislocatie, CO 2 stikken, of andere humane protocol aangepast aan de regels van de instelling handling dier.
    2. Ontleden vers gedood muizen en verwijder de milt en de gewenste lymfeklieren 15. Plaats de organen in putjes van een 6 well weefselkweek plaat met R10 medium (RPMI medium met 10% door warmte geïnactiveerd FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,1% β-mercaptoethanol) . Gebruik een celkweek kap voor dissectie van muizen en alle latere manipulaties kans op besmetting in kweken te minimaliseren.
      LET OP: Houd de R10 medium koude en uit te voeren alle downstream zuivering stappen bij 4 ° C.
    3. Plaats een 70 micrometer celkweek zeef in een 50 ml conische buis met ongeveer 5 ml medium R10. Gebruik één zeef voor de milt en lymfeknopen van maximaal drie muizen.
    4. Voeg milt en lymfeknopen de cel zeef en macereren met het einde van een 5 ml spuit zuiger. Spoelen met 1-2 ml van R10 medium.
    5. Transfer cellen om een ​​15 ml conische buis en breng het volume tot 14 ml met R10. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi supernatant door het gieten van het af met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet.
    6. Voeg 2 ml koude (4 ° C) red cell lysis buffer (tabel 1) aan elke buis. Meng gedurende 3,5 min, het bijhouden van de buis op ijs.
      OPMERKING: De timing van erytrocyten lysis kritisch dood van lymfocyten voorkomen. Daarom zal de precieze timing van elke partij Red cellysebuffer moeten worden geoptimaliseerd.
    7. Voeg ≈12-13 ml R10 medium. Onmiddellijk centrifuge en gooi supernatant als in stap 2.1.5. Voer de wasstappen 2x meer verstandh R10 medium om resten erytrocyten lysisbuffer uit de cellen te verwijderen en de dood van lymfocyten voorkomen.
    8. Aantal cellen in een hemocytometer verdunning 1:20 in trypan blauw om de opbrengst van levensvatbare cellen te bepalen. Verwacht ongeveer 8-10 x 10 7 cellen per muis.
  2. Isolatie van CD4 + T-cellen via magnetische partikels Kit te verwijderen CD8 + CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klasse II + en Ter-119 + cellen.
    1. Aliquot 8-10 x 10 7 cellen uit stap 2.1.8 per 15 ml conische buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet. Resuspendeer de cellen in elke buis in 100 pl door hitte geïnactiveerd FBS en voeg 100 ul antilichaam mengsel uit de set. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals.
    2. Terwijl de bovenstaande cellen incuberen, bereid de parels.
      1. Resuspendeer kralen in de flacon door vortexen gedurende> 30 sec vervolgens over 1 ml korrels per 8-10 x 10 7 cellen bereid een 15 ml conische buis. Voeg 2 ml van R10 medium per ml van kralen en meng.
      2. Plaats de buis in de magneet voor 1 min gooi het supernatant. Verwijder slang van de magneet en resuspendeer kralen in 4 ml medium R10. Deze hoeveelheid korrels is voldoende voor twee incubaties.
    3. Was de cellen aan het eind van het antilichaam incubatie (stap 2.2.1) door toevoeging van 10 ml per buis R10 medium. Voorzichtig goed mengen onder zwenken van de buis en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet. Resuspendeer cellen in 1 ml medium R10.
    4. Voeg 2 ml van de gewassen korrels uit stap 2.2.2.2 (½ bedrag voor ieder buisje) aan elke buis antilichaam behandelde cellen en incubeer 30 minuten bij 4 ° C onder zachtjes mengen van een roller.
    5. Resuspendeer de cel-kraal mengsel door voorzichtig pipetteren 5 maal met een pipet met een smalle tip opening. Vermijd schuimvorming. Plaats de buis in de kralen magneet voor 2 min breng de supernatant dat de negatief geselecteerde cellen naar een nieuwe buis. Houd deze cellen, aangezien zij de CD4 + populatie.
    6. Herhaal negatieve selectie nog een keer. Spin cellen uit stap 2.2.5 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet het supernatant in stap 2.2.3 en resuspendeer in 1 ml medium R10. Volg de stappen 2.2.4 en 2.2.5 opnieuw. Na de laatste magnetische bolletje selectie, de telling van de cellen om het herstel te bepalen (typische opbrengst 15-20 x 10 6 cellen per 10 8 leukocyten).
  3. Isolatie van naïeve CD4 + T-cellen (CD25 - en CD62L hoog) gebruiken Cell Separation Columns
    1. Centrifugeer CD4 + T-cellen bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer in 150-200 glR10 medium per 10 8 cellen. Voeg 2 pl voorraad gebiotinyleerd CD25 monoklonaal antilichaam (kloon 7D4). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals.
    2. Was de cellen door toevoeging van 10 ml celscheidingskolom buffer (tabel 1). Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder zoveel supernatant mogelijk en een schatting van de omvang van de buffer / cellen die overblijven. Resuspendeer tot een eindvolume van ongeveer 90 ui per 10 7 cellen.
    3. Voeg 20 ul van Streptavidine kralen per 10 7 cellen en meng met zachte flicks. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    4. Terwijl de cellen worden incubatie, bereiden het medium cel scheiding (MS) kolommen voor de handmatige aanpak. Elke kolom MS behoudt 10 7 cellen, en aangezien CD25 + cellen gewoonlijk voor ongeveer 10% van de totale CD4 + cellen gebruikt per kolom 1 10 8 CD4 + T-cellen. Voeg 500 gl celscheidingskolom buffer aan de kolomen laat doorstromen. Herhaal 2 keer.
    5. Einde cellen / parel incubatie, wassen cellen door toevoeging van 10 ml celscheidingskolom buffer en centrifugeren bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 500 gl celscheidingskolom buffer per 10 8 cellen, maar nog steeds 500 pi als er minder cellen.
    6. Toepassen 500 gl cellen / kralensuspensie aan de kolom en verzamel de doorstroom. Geef deze over de kolom nog 1 keer en het verzamelen van de stroom door nogmaals. Spoel de kolom 3 maal met 500 pi celscheidingskolom buffer, toevoegen van elk van deze stromen door spoelingen van de verzamelde cellen. Dit zijn de CD25 - cellen. Tellen cellen om de opbrengst te bepalen.
    7. Als Tregs (CD25 + cellen) gewenst, te isoleren als volgt.
      1. Verwijder de kolom uit de afscheider en houd deze boven een open universele buis en zorg ervoor dat de steriliteit te behouden. Snel pipet 500 pi buffer celscheiding op de colUMN en stevig spoelen van de positieve fractie, met behulp van de met de kolom geleverd zuiger.
      2. Herhaal de spoelprocedure nog 2 keer. Passeer de positieve fractie over een verse kolom cel scheiding MS en gooi deze flow-through. Stevig spoelen van de positieve cellen drie keer wanneer voor en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C Resuspendeer cellen in 1 ml medium en R10 tellen om de opbrengst te bepalen.
    8. CD62L hoge T cellen gecentrifugeerd CD25 - - T-cellen die hierboven in stap 2.3.6 bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° en resuspendeer in 150-200 pi R10 medium per 10 7 cellen CD25 verkrijgen. Voeg 5 ul leverbaar CD62L gebiotinyleerd monoklonaal antilichaam (kloon MEL-14) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals als voorheen.
    9. Voer wassen, Streptavidine kraal binding, en de voorbereiding celscheidingskolom zoals beschreven voor Treg isolatie protocol (2.3.7). Deze keer gebruikde kolom grote celscheiding (LS) met een capaciteit van 10 8 cellen heeft.
      1. Sinds CD62L high T-cellen typisch vertegenwoordigen ongeveer 60-70% van de CD25 - cellen, gebruik 1 LS celscheidingskolom per 10 8 cellen. Voeg cel / bead mengsel LS celscheidingskolom zie stap 2.3.6 - ditmaal Werp het laatste kolom doorstroom en spoelt. Verzamel de CD62L high T-cellen, zoals beschreven in stap 2.3.7 voor de CD25 + cellen collectie.
      2. Centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C Resuspendeer cellen in 1 ml R10 en tel de opbrengst te bepalen. Verdun tot 0,75-1 X10 6 cellen per ml in medium R10.
  4. Analyseer zuiverheid van de cellen door Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
    1. FACS kleuring strategie
      1. Voor cellen pre en post alle stadia van isolement, vlek met CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (helper en cytotoxische T-cellen), en MHCII-PE (MHC klasse II tot expressie brengen).
      2. Voor cellen voor en na CD25 isolatie, vlek met CD4-FITC en CD25-PE (Tregs ten opzichte van andere helper T-cellen).
      3. Voor cellen voor en na CD62L isolatie vlek met CD4-FITC, CD62L-PE en CD44-APC (naïeve versus geheugen en effector helper T-cellen).
    2. Voor elke analyse plaats 10 5 cellen in een put van een 96 well U-bodemplaat. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het medium en was de cellen eenmaal met 200 pi DPBS. Centrifuge zoals hierboven en giet DPBS.
    3. Voeg 50 ul per putje DPBS en 0,5 pi van elk antilichaam (zoals in 2.4.1) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker te bleken fluorescentie merkteken voorkomen.
    4. Was de cellen 2x met DPBS als in 2.4.2 en onmiddellijk te analyseren op een flowcytometer met behulp van protocollen en richtlijnen die specifiek zijn voor het instrument bij de hand.
      NB: Na de laatste isolatie stap van een goede voorbereiding, 90-95% van de cellenzijn CD4 + CD25 - CD62L hoge T-cellen.

3. Retrovirale transductie van geactiveerde CD4 + T-cellen en hun differentiatie in specifieke T-helper-subsets

  1. retrovirale Transductie
    OPMERKING: Retrovirale integratie en expressie van genen vereist celdeling. Daarom moeten T-cellen worden geactiveerd O / N.
    1. Terwijl het isoleren van de naïeve T-cellen, jas een 24 well weefselkweek plaat met anti-CD3 en anti-CD28-antilichamen verdund in DPBS. Voeg 250 ul per putje. Gebruik anti anti-CD3 bij 1 ug / ml. Met anti-CD28 bij 2 ug / ml, als cellen uiteindelijk zullen worden onderscheiden onder Th0, Th1, Th2 en iTregs omstandigheden. Met anti-CD28 bij 10 ug / ml voor Th9 en Th17 omstandigheden. Incubeer 2 uur bij ~ 37 ° C in een weefselkweek incubator.
    2. Vlak voor het kweken van de cellen, verwijder de antilichaam-oplossing en was de plaat met ~ 250 ul van DPBS per goed op unbou verwijderennd antilichaam. Wees voorzichtig niet te laten de plaat uitdrogen, zodat het verwerken van een maximum van 6 wells tegelijk. Verwijderen DPBS wassen en voeg 1 ml van naïeve CD4 + T-cellen in R10 medium bij 0,75-1 x 10 6 cellen per ml. Cellen te activeren O / N (14-16 uur).
    3. De volgende dag, centrifuge cellen in de plaat bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 30 ° C om de cellen hechten aan de bodem van de putjes.
    4. Verzamelen en opslaan van de medium zorg dat u de cellen niet te verdringen en te vervangen door 1 ml virus kweeksupernatant bereid van het virus productie protocol. Laat de cellen uitdrogen, zodat het verwerken van een maximum van 4 wells tegelijk.
      1. Aan elk putje voeg 1 pl van 8 mg / ml polybreen en 10 gl 1 M HEPES pH 7,5 virus opname bevorderen en significante alkalisering in de omgeving CO 2 in de daaropvolgende centrifugatie voorkomen. Centrifugeer cellen in plaat bij 900 xg gedurende 90 min bij 30 ° C
  2. Differentiatie van cellen in Specific subsets
    1. Haal het virus kweeksupernatant en vervangen door 1 ml van het medium boven in fase 3.1.4 door, aangezien IL-2 en andere T-cel groeifactoren. reagentia aangegeven in Tabel 2 en kweekcellen 3-4 dagen om cellen differentiëren tot specifieke subsets voegen.
  3. Analyse van Cellen
    1. Voor intracellulaire kleuring van cytokinen behandelen cellen met 1 ug / ml van zowel Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine gedurende 4 uur. Gedurende de laatste 2 uur van de stimulatie, voeg 1 ug / ml Brefeldine A.
    2. Resuspendeer cellen van de bodem van elk putje op en neer te pipetteren meerdere malen. Breng circa 10 5 cellen om een 96 putjes U bodemplaat (meestal 100 pl van de 1 ml van de cultuur van de Th-cellen) voor fixatie en kleuring.
    3. Voor GFP kleuring vast cellen met 100 pi 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende precies 5 min, een langere incubatietijd verbleekt het GFP eennd interfereren met Foxp3 kleuring. Was de cellen door toevoeging van 100 gl DPBS aan elk putje en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten. Giet het supernatant.
      Let op: Paraformaldehyde is giftig. Omgaan in een zuurkast met de huid en oogbescherming.
    4. Fixeer de cellen opnieuw met 100 ul 1x Fixation buffer gemaakt van de Foxp3 kleuring kit (1 volume van Fixation buffer tot 3 volumes verdunningsmiddel). Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur of als alternatief incuberen bij 4 ° C gedurende 16 uur.
    5. Na fixatie doorlaatbaar cellen door toevoeging van 100 pi permeabilisatie buffer van dezelfde kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten.
    6. Voor antilichaam kleuring, verwijder fixatie / permeabilisatie buffer en voeg 50 ul van verse permeabilisatie buffer. Voeg de vereiste antilichaam verdund in permeabilisatie buffer bij 0,5 ul per 50 ul buffer per monster. Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur in het donker naar het bleken van de griep te voorkomenorescent label.
    7. Voeg 150 ul permeabilisatie buffer en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten. Gooi de permeabilisatie buffer en voeg 200 ul DPBS. Analyseren op een flowcytometer met behulp van protocollen en richtlijnen die specifiek zijn voor het instrument bij de hand.
      LET OP: Zorg ervoor dat u de juiste knoppen voor cytokine kleuring omvatten, zoals kleuring met isotype controle antilichamen, het analyseren van niet-geactiveerde of Th0 geactiveerde cellen, etc.

Resultaten

Het succes van deze experimentele systeem vereist zeer zuivere populaties van T-cellen en hoge titer retrovirus preparaten. Representatieve resultaten worden hier als voorbeelden van succesvolle experimenten. Figuur 1 toont de gebruikelijke zuiverheid van pre- en post geselecteerde populaties in elke fase van de naïeve helper-T-cel isolatieprotocol. Figuur 2 en 3 illustreren de analyse van retrovirus productie tot GFP expressie in de getransfecteerde HEK 293T-cellen (figuur 2) en getransduceerde T-cellen (Figuur 3). Transfectie efficiënties van HEK 293T cellen aanzienlijk variëren met verschillende retrovirale constructen, maar vaak niet correleert met het niveau van retrovirus productie waargenomen met het aantal GFP + -T-cellen. Ook kan het aantal GFP + -T-cellen variëren naargelang de polarisatieomstandigheden. Bovendien is de mean expressieniveau van GFP en het ingebrachte gen kan variëren afhankelijk van het aantal viruskopijen geïntegreerd, het effect van de integratieplaats transcriptie en post- transcriptionele regulerende mechanismen die de virale transcriptie.

Tenslotte Figuur 4 toont enkele typische resultaten die we met helper T celdifferentiatie zijn waargenomen wanneer de miRNAs miR-15b / 16 overexpressie worden gebracht. Deze resultaten tonen enkele van de variabiliteit die zich kunnen voordoen binnen een individueel experiment zo waar effecten moeten worden gestaafd met statistische analyse van meerdere herhaalde experimenten met verschillende bereidingen van helper T-cellen. In deze experimenten kan Th2 responsen moeilijk waar te nemen in de C57BL / 6 regel hier gebruikt omdat zij gevoelig zijn voor Th1 responsen. Evenzo kan IL-9 kleuring moeilijk boven de achtergrond te detecteren. Daarom is het noodzakelijk om isotype controles te doen en het opzetten van een goede compensatie voor de juiste ga ervoor te zorgenting van cytokine-expressie. In onze resultaten hebben we gevonden dat miR-15b / 16 verbetert iTreg inductie door remming van de mTOR signaleringsroute door middel van het onderdrukken van de expressie van de componenten Rictor en mTOR 15. miR-15b / 16 kan soms beïnvloeden Th0, Th1 en Th17 differentiatie in individuele proeven, maar er is geen significant effect wanneer in meerdere herhaalde experimenten onderzocht. In tegenstelling miR-15b / 16 overexpressie heeft aanzienlijk onderdrukken Th9 differentiatie (zie referentie 18).

figure-results-1
Figuur 1. Typische zuiverheid van helper T-cellen in elke fase van isolatie. Representatieve flowcytometrie resultaten van de vermelde antigenen zijn vanaf de poort aangewezen in de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) plots levende cellen. (A) voor en na de CD4 negatieve selectie. Expressieprofielen van CD4,CD8a en MHCII getoond. Hieruit blijkt de verrijking van helper T-cellen en het verlies van cytotoxische T-cellen en MHC klasse II tot expressie brengen. Een goede reiniging moet leiden tot ~ 90% CD4 + T-cellen in dit stadium. (B) CD25 selectie. Aan de linkerkant zijn de expressie profielen van CD4, CD8a en MHCII, en aan de rechterkant zijn de CD4 en CD25 expressie profielen voor en na selectie. Op dit punt> 95% van CD25 negatief geselecteerde cellen moeten CD4 + CD25 -. (C) CD62L selectie. CD4, CD8a en MHCII expressie profielen worden getoond op de linkerzijde. Rechts de expressieprofielen van CD62L en CD44 worden getoond voor en na de CD62L geselecteerde cellen met CD4 en CD62L expressieprofiel post geselecteerde cellen. Na CD62L selectie vrijwel alle geheugencellen (CD44 +) worden verwijderd waardoor een sterk verrijkt bevolking van naïeve helper T-cellen die 10-15% effectorcellen (CD62L laag) bevat. Voor iedereenFACS profielen, gelijkwaardige instellingen en schalen voor een specifieke parameter werden overal onderhouden. Getallen vertegenwoordigen het percentage cellen in een gated populatie. De lichte daling van de grootte van de cellen na de eerste selectie is vermoedelijk te wijten aan mechanische stress tijdens het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Analyse van retrovirus-getransfecteerde HEK 293T-cellen. GFP expressie wordt weergegeven in HEK 293T cellen die hetzij getransfecteerde of getransfecteerd en na afname van virale kweeksupernatanten werden geanalyseerd. GFP analyse werd uitgevoerd op levende cellen van het hek aan de FSC en SSC perceel in het eerste paneel. Getallen vertegenwoordigen het percentage GFP + cellen in het omheinde gebied. typische transfection rendementen liggen tussen 30-90%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Analyse van retrovirus getransduceerde helper T-cellen. GFP expressie wordt weergegeven in retroviraal getransduceerde helper T cellen na differentiatie Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 en Treg polarisatieomstandigheden drie dagen. Analyse werd afgesloten op levende en geactiveerde cellen aangegeven in het paneel FSC / SSC. Transductie efficiëntie varieert tussen 10-75%, afhankelijk van het construct en polarisatieomstandigheden. Ook de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van GFP expressie kan variëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Effect van miR-15b / 16 overexpressie op helper T-cel differentiatie in verschillende polarisatie omstandigheden. Vertegenwoordiger cytokine profielen worden getoond op de GFP + populatie van cellen uit figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Tabel 1:. Buffers die in deze protocollen Klik hier om deze tabel te downloaden als een Excel-spreadsheet.

HelperT cel polarisatieomstandigheden
Th0 anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th1 recombinant-IL-12 20 ng / ml
anti-IL-4 5 ug / ml
Th2 recombinant IL-4 40 ng / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th9 recombinant TGF-β 2,5 ng / ml
recombinant IL-4 40 ng / ml
anti-IFN-γ 10 ug / ml
Th17 recombinant TGF-β 2,5 ng / ml
recombinant IL-6 50 ng / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IL-2 5 ug / ml
Tregs recombinant TGF-β 2,5 ng / ml
recombinant IL-2 5 ng / ml

Tabel 2: Helper T-cel subgroep polarisatie omstandigheden.

Discussie

Retroviraal gemedieerde overexpressie van genen is een krachtige manier te functioneren in helper T-cellen te analyseren, omdat de ontwikkeling en functie vaak wordt bepaald door het expressieniveau van sleutelregulatoren. Echter voorzichtige interpretatie van de resultaten vereist omdat expressieniveaus aanzienlijk boven het endogene gen veel artefacten kunnen introduceren. Daarom moet deze techniek worden gecombineerd met anderen om de relevantie van werking gecontroleerd. Bijvoorbeeld, overexpressie moet worden aangevuld met een verminderde expressie via siRNA of gen knockouts indien beschikbaar. Met miRNAs, we aangevuld overexpressie experimenten met die van het blokkeren door het gebruik van virussen die kunstmatige miRNA richten op sites die als competitieve remmers fungeerde voor een miRNA 15 overexpressie. Retrovirale getransduceerde cellen kunnen ook worden gebruikt bij biochemische assays met RNA- en eiwitanalyse. Echter een belangrijke beperking van deze experimenten is de efficiëntie van transductie resUlting in een gemengde populatie van getransduceerde en getransduceerde cellen. Daarom zullen deze assays waarschijnlijk vereisen sorteren van de GFP + populatie. Tenslotte moet in vitro differentiatie assays worden gecombineerd met in vivo experimenten, en een manier waarop dit kan worden bereikt is door adoptief overbrengen van de getransduceerde T-cellen in muizen en na hun differentiatie en hun effect op de immuunrespons.

Een van de belangrijkste beperkingen van dit systeem is de grootte van het RNA genoom die kan worden verpakt in het capside retrovirale. In onze ervaring, de maximale grootte inzetstuk voor MIG retrovirale systeem dat goed virus productie geeft is 3-3,5 kb. Daarom kan groter genen niet worden geanalyseerd met het systeem omdat zij geven slechte virustiters. De meeste genen zijn kleiner dan deze grootte zodat dit systeem is bruikbaar voor een groot aantal genen studies.

Met retrovirale transductie, verschillende alternatieven binnen deze protocols zijn gebruikt. Veel onderzoekers hebben verpakkende cellijnen die stabiel de retrovirale genen (bijvoorbeeld referentie 16) drukken toegepast. Echter, hebben we de hoogste titers middels standaard HEK 293T cellen met co-transfectie van de PCL-Eco helpervirus vector verkregen. Isolatie van naïeve helper-T-cellen kunnen ook worden bereikt door celsortering plaats van de magnetische bolletje en celscheiding kolom protocol, maar dit vereist toegang tot een cel sorteerder en de kosten voor soort tijd zijn meestal hoger dan de kraal reagentia. Tenslotte zijn er variaties op activeringsomstandigheden gebruikt voor helper T-cellen differentiëren tot de verschillende subgroepen. Bijvoorbeeld, TCR stimulatie van de cellen te lang voor de blootstelling aan Treg inducerende omstandigheden kunnen hun inductie 16 remmen. Dit kan een probleem zijn omdat retrovirale expressie celdeling geïnduceerd door stimulatie van cellen vereist. Toch hebben we een efficiënte Treg inductie gebruik van dit protocol met O / N activ gevondenatie voorafgaand aan retrovirale transductie.

Binnen deze protocollen, succesvolle toepassing vereist verschillende factoren. Hoge titer retrovirus voorbereidingen nodig efficiënte transfectie van de HEK 293T cellen, zodat een hoge kwaliteit van DNA en nauwkeurig voorbereid 2x HBS zijn belangrijk. Bovendien, de celdichtheid van de HEK 293T cellen moet ongeveer 50% op het punt van transfectie zijn omdat goede expressie van het getransfecteerde DNA vereist dat de cellen actief groeien, en dit zal worden stopgezet indien de cellen te dun of dik. Cellen op het optimale dichtheid tijdens transfectie moet samenloop bereiken op enig moment tijdens het virus verzameling stappen, maar ze zullen blijven produceren van hoge titer virus voorraden helemaal door tot de laatste collectie. Efficiënte differentiatie van de helper T-cellen vereist goede kwaliteit cel zodat ervoor dat geïsoleerde cellen om de zuiverheid in figuur 1. Ook de kwaliteit van de cellen is afhankelijk van de muizen frOM waarin ze werden geïsoleerd. Voor deze studies hebben we gebruik 6-8 weken oude C57BL / 6 muizen. Oudere muizen minder naïeve cellen, en andere stammen kunnen verschillen in hun differentiatie. Bijvoorbeeld BALB / c muizen gevoeliger voor Th2 responsen dan C57BL / 6-muizen 17 zoals hierboven vermeld, C57BL / 6 T-cellen kan moeilijk zijn om een Th2 respons induceren. Bovendien kan elk van de differentiatie weer licht verschillen van lab tot lab, en het effect van overexpressie kan alleen zichtbaar in sub-optimale condities worden zo cytokine concentraties in de diverse polarisatieomstandigheden moet worden getitreerd. Tenslotte effecten van de tot overexpressie gebrachte gen of polarisatieomstandigheden op celproliferatie kan het transductierendement zodat het effect meten van het gen van belang kan vereisen optimalisatie van de timing en de concentratie van polariserende reagentia beïnvloeden. Het optimaliseren van al deze factoren moet leiden tot informatieve resultaten met dit systeem.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdig belang bij de publicatie van dit werk.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) subsidie (BB/H018573/1) en een BD Biosciences subsidie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
Penicillin Streptomycin oplossingSigmaP4333
L-GlutamineSigmaG7513
β-mercaptoethanolSigmaM3148
DPBSSigmaD8537
MIG vectorAddgenePlasmid 9094
pCL-Eco vectorAddgenePlasmid 12371
Cell strainerBD Falcon352350
Magnetic beads mouse CD4 cell kit Invitrogen (Dynabeads)11415D
Streptavidin Beads Miltenyi Biotech130-048-102
MS cellscheidingskolommenMiltenyi Biotech130-042-201
LS cellscheidingskolommenMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenylated MAb BD Biosciences85059clone 7D4
CD62L Biotenylated MAb BD Biosciences553149clone MEL-14
Polybrene (Hexadimethrine Bromide)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85clone 145-2C11 
Anti-CD28eBiosciences16-0281-85clone 37.51 
Anti-IL-4BD Biosciences559062clone 11B11
Anti-IFN-gammaBD Biosciences559065clone XMG1.2
Anti-IL-2BD Biosciences554425cloneJES6-5H4
Recombinant IL-12 p70eBiosciences14-8121
Recombinant IL-4BD Biosciences550067
Recombinant TGF-betaeBiosciences14-8342-62
Recombinant IL-6eBiosciences14-8061
Recombinant IL-2eBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
IonomycinSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldehydeSigma16005Paraformaldehyde is giftig, dus gebruik geschikte voorzorgsmaatregelen bij het hanteren 
Foxp3 kleuringsbufferseteBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041clone GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80clone 53-6.7 
Anti-MHCII PEeBiosciences12-0920 clone HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82 clone PC61.5 
Anti-CD62L PEeBiosciences12-0621-82clone MEL-14 
Anti-CD44 APCeBiosciences17-0441clone IM7 
Anti-IFN-gamma FITC eBiosciences11-7311-81clone XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435clone 11B11
Anti-IL-9 PE of APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104clone RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502clone TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC of PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 clone FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
Dextrose/GlucoseSigmaG7021
HEPES, vrije zuurSigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
Dinatrium EDTASigmaD2900000
KHCO3Sigma237205
 CaCl2 SigmaC5670

Referenties

  1. Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
  2. Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
  3. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454(2013).
  4. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
  5. Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
  6. Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
  7. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  8. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  9. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  10. Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
  11. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  12. Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
  13. Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
  14. Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
  15. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
  16. Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
  17. Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
  18. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).

Herprints en machtigingen

Tags

Primaire murine T-cellenT-celisolatievirusproductieceldifferentiatieflowcytometriemagnetische beadscelscheidinggenexpressie
Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.