detectie van Trypanosoma brucei Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Samenvatting

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

Samenvatting

Trypanosoma brucei, een protozoa parasiet dat zowel Humane als Dieren Afrikaanse Trypanosomiasis (bekend als slaapziekte en nagana, respectievelijk) veroorzaakt, circuleert tussen een tseetseevector en een zoogdiergastheer. Het ontwijkt het immuunsysteem van de zoogdiergastheer door periodiek de dichte, variant oppervlakteglycoproteïne (VSG) die zijn oppervlak bedekt, te veranderen. De detectie van antigene variatie in Trypanosoma brucei kan zowel omslachtig als arbeidsintensief zijn. Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van het aantal parasieten dat is 'overgeschakeld' om een nieuwe VSG tot expressie te brengen in een bepaalde populatie. De parasieten worden eerst gekleurd met een antilichaam tegen de start-VSG en vervolgens gekleurd met een secundair antilichaam dat aan een magnetische parel is gekoppeld. Parasieten die de start-VSG tot expressie brengen, worden vervolgens gescheiden van de rest van de populatie door de parasieten over een kolom te laten lopen die aan een magneet is bevestigd. Parasieten die de dominante, start-VSG tot expressie brengen, worden vastgehouden in de kolom, terwijl de doorstroming parasieten bevat die een nieuwe VSG tot expressie brengen, evenals enkele contaminanten die de start-VSG tot expressie brengen. Deze doorstromende populatie wordt opnieuw gekleurd met een fluorescent gelabeld antilichaam tegen de start-VSG om contaminanten te labelen en propidiumjodide (PI), dat dode cellen labelt. Een bekend aantal absolute telperlen die zichtbaar zijn door middel van flowcytometrie, wordt toegevoegd aan de doorstromende populatie. De verhouding van parels tot het aantal verzamelde cellen kan vervolgens worden gebruikt om het aantal cellen in het hele monster te extrapoleren. Flowcytometrie wordt gebruikt om de populatie van switchers te kwantificeren door het aantal PI-negatieve cellen te tellen die niet positief kleuren voor de start-dominante VSG. De verhouding van switchers in de populatie kan vervolgens worden berekend met behulp van de flowcytometrie gegevens.

Inleiding

De protozoa parasiet, Trypanosoma brucei, is een verwekker van ziekten die de mens beïnvloeden (via Trypanosoma brucei gambiense en Trypanosoma brucei rhodesiense) en dieren (via Trypanosoma brucei brucei) gehele Sub-Sahara Afrika. Het is aan de zoogdiergastheer overgedragen via het speeksel van de tseetseevlieg vector. Zowel mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis leiden tot een ernstige economische last in endemische gebieden, en weinig drugs zijn beschikbaar of in ontwikkeling voor de behandeling van beide ziekten. Inzicht in de mechanismen van immune fraude is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor trypanosomiasis. Antigene variatie van het dichte, variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) jas die de parasiet bedekt, is een van de belangrijkste manieren waarop T. brucei ontwijkt de zoogdier antilichaam respons. Ongeveer 2000 varianten van de VSG-gen aanwezig in het genoom trypanosoom, maar slechts één wordt getranscribeerd op een bepaald moment uit een van ~ 15 expresSion sites. Switching van de VSG expressie kan plaatsvinden hetzij door het kopiëren van een VSG gen in de actieve expressie plaatsen of door transcriptionele activering van een eerder stille expressieplaats (besproken in ^1).

Hoewel veel werk is besteed aan het begrip van antigene variatie in T. brucei, de factoren die van invloed schakelfrequentie zijn nog steeds slecht begrepen. Studies tot op heden belemmerd door het feit dat hoewel omschakelen gebeurt stochastisch in vitro schakelfrequenties zeer laag, in de orde van 1 op ongeveer 10 ⁶ cellen ^2. Dit maakt het moeilijk te meten of een bepaalde factor verhoogt of verlaagt schakelfrequentie, omdat schakelen moeilijk te detecteren in de eerste plaats. Voorafgaand aan 2009, werkwijzen voor het isoleren overstappers in een bepaalde populatie waren langdurig en arbeidsintensief. Deze omvatten passeren van trypanosomen door de muizen ingeënt tegen de dominante VSG en dan oogsten van celleneen dag later ^3, en tellen honderden cellen door immunofluorescentie ^4,5. Een andere strategie is gebaseerd op selectie voor drug resistentie tegen switchers ⁶ isoleren. Omdat Afrikaanse trypanosomen gekweekt in vitro gewoonlijk bestaan uit een grote populatie expressie één belangrijke variant, en een veel kleinere populatie overstappers expressie alternatieve varianten wordt verwezen naar de belangrijkste variant in dit document als dominante vanaf VSG. Daarbij we geenszins willen impliceren dat deze belangrijke variant een grotere geschiktheid dan andere varianten in de populatie.

Hier beschrijven we een werkwijze die betrouwbaar het aantal trypanosomen expressie een niet-dominante VSG in een bepaalde populatie te meten 3 - 4 uur. Deze werkwijze is bijzonder bruikbaar wanneer men wil nagaan of een bepaalde genetische manipulatie of medicatie verhoogt het aantal geschakelde cellen in een populatie. In plaats van bevrijden de populatie van cellen die de dominant Neem VSG door middel van drugs of immunologische middelen, worden deze cellen geëlimineerd door eerst te coaten met magnetische korrels gekoppelde antilichaam tegen de dominante VSG en isoleren ze op een magnetische kolom. De geschakelde populatie wordt vervolgens verzameld in de doorstroom en opnieuw gekleurd met een fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG verontreinigingen identificeren. Kwantificering wordt bereikt door een bepaald aantal absolute tellen van kralen toevoegen aan elk monster zodat de verhouding van kralen cellen kan worden bepaald en gebruikt om het aantal overstappers kwantificeren de bevolking ^7.

Protocol

OPMERKING: Gedurende de procedure moet worden cellen op ijs bewaren. Koude media moeten ook overal worden gebruikt.

1. Sample Oogsten

1. Lister stam groeien 427 bloedstroom trypanosomen tot een dichtheid van 0,5-1.000.000 / ml. Het beste is om culturen te starten met een klein aantal parasieten. Spin down 50 x 10 ⁶ cellen / monster gedurende 10 min bij 1500 x g. Zorg ervoor dat u 1 x 10 ⁶ cellen te laten in de cultuur voor later te gebruiken als positieve en negatieve antilichaam controles.
   LET OP: Dit protocol kan ook gebruikt worden op trypanosomen geïsoleerd uit dierlijk bloed (zie bespreking voor details).
2. Pipet of giet het grootste deel van de bovenstaande vloeistof (laat ongeveer 750 ui). Overdracht van de cellen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
3. Spin cellen bij 4 ° C gedurende 4 min bij 5200 xg in een microcentrifuge en verwijder supernatant.

2. Magnetische Labeling

1. Resuspendeer cellen in 150 pi kweekmedium (HMI-9 with serum bijvoorbeeld) + primaire anti-VSG-antilichaam op de juiste verdunning.
   LET OP: De anti-VSG-antilichaam is in huis en worden gebruikt bij een verdunning van 1:50. Het is belangrijk om een ​​primair anti-VSG antilichaam dat niet is gelabeld met een fluorofoor gebruiken.
2. Vortex cellen met behulp van een vortex-adapter 60 op snelheid 6-8 in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Wassen met 800 - 1000 ul koud HMI-9 met serum.
3. Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 xg en zuig de supernatant. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en draaien zoals hierboven. Zuig het supernatant. Resuspendeer pellet in 100 pl HMI-9 met serum.
4. Voeg 110 ul van magnetische-geactiveerde celsortering (MSC) microkralen. Met anti-muis anti-konijn of anti-biotine kralen afhankelijk van de primaire anti-VSG antilichaam. Goed mengen. Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
5. Terwijl de cellen worden vortexen, het opzetten van een magnetische-geactiveerde kolom voor de scheiding / monster op een scheiding magneet. Zorg ervoor dat u een re hebbenceptacle (we een 15 ml centrifugebuis) onder de kolom doorstroom verzamelen. De proefopstelling in een koude kamer.
6. Voeg 2 ml van HMI-9 met serum aan premier kolom. Na priming plaats een 15 ml centrifugebuis onder de kolom doorstroom van elk monster te verzamelen.
7. Na 10 minuten incubatie in stap 2,4, voeg 800-1000 pl koud HMI-9 met serum. Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en herhaal verlaten 100 pi van het supernatant.
8. Flick de centrifugebuis krachtig en visueel te inspecteren de buis om ervoor te zorgen dat de pellet volledig geresuspendeerd. Voeg 1 ml van HMI-9 met serum en pipet op en neer om ervoor te zorgen dat cellen goed worden opnieuw gesuspendeerd.

3. Magnetische scheiding

1. Controleer of de kolommen worden voorbereid zoals boven beschreven. Toepassen cellen kolom. Verzamel doorstroming met cellen die de niet-dominante VSG. 1 ml medium + trypanosomen duurt meestal 6-7 min door de kolom stromen.
2. Wassen met 2 x 1 ml HMI-9 met serum en laat doorstroming in dezelfde buis als in stap 3,1.
3. Verdeel doorstroom (3 ml) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen.
   Opmerking: Deze kunnen later worden gecombineerd of half kunnen worden gebruikt om RNA te isoleren, etc.
4. Kolom verwijderen uit magneet. Voeg 3 ml HMI-9 met serum kolom en kolom dompelen in een 15 ml centrifugebuis met cellen die het uitgangspunt, hooggelegen VSG expressie te verkrijgen. Verwijder 300 ui geëlueerde materiaal voor latere analyse. Houd deze cellen op ijs.
5. Voor gebruik als een positieve en een negatieve controle, duurt ongeveer 1.000.000 cellen van het uitgangsmateriaal controlecultuur cellen groeien bij 37 ° C (die naar verwachting niet vaak wisselt) en pipet ze in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
   OPMERKING: Positieve controle cellen zullen worden gekleurd met fluorofoor gemerkte antilichaam in stap 4,1. Negatieve controlecellen remain onbesmet in de rest van het protocol.
6. Spin doorstroom monsters en positieve controles zonder antilichaam bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant.
   Opmerking: Een 300 pl aliquot van geëlueerde cellen kan worden gebruikt als een positieve controle voor anti-VSG kleuring.

4. kleuring om verontreinigingen en switchers identificeren

1. Resuspendeer doorstroom monsters en de controle cellen in 100 pl HMI-9 met serum + primair-fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG op het juiste verdunning.
   Opmerking: Het gemerkte anti-VSG-antilichaam is in huis en gebruikt bij een verdunning van 1: 1000. De fluorofoor gemerkt, kan anti-VSG uit dezelfde bron als het ongelabelde antilichaam in de MACS scheiding step.There moet 3 ml doorstroming monster in twee microcentrifugebuizen volgende stap 3,5.
2. Om alle doorstroming door flow cytometrie analyse, combineren de pellets in twee microcentrifugebuizen terwijl re-susafwachting van de monsters in 100 ui HMI-9 met serum + anti-VSG antilichaam. Goed mengen.
3. Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 800 - 1.000 III koud HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen.
4. Was de cellen met 1 ml HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant. Tijdens deze laatste rotatie, spin down de geëlueerde-monsters uit stap 3.4 en de negatieve controle monster.
5. Resuspendeer alle doorstroming en geëlueerd monsters: 148,5 ul HMI-9 met serum, 25 ul absolute tellen van kralen en 1,5 ul propidiumjodide kleuring oplossing (175 ui totaal). Resuspendeer positieve en negatieve controle antilichaam monsters in 175 ul HMI-9 met serum. Zorg ervoor dat het aantal absolute tellen van kralen / 25 ul voor de specifieke gebruikte partij op te nemen.
6. Ren alle monsters door middel van een flowcytometer en het verzamelen van gegevens. Dode cellen vlek als PI ^{+. Verontreinigingen vlekken als PI - VSG +. Switchers vlekken als PI - VSG - 8.}
7. Bereken schakelfrequenties met behulp van flowcytometrie data.
   LET OP: Voor instructies over hoe om te schakelen frequenties te berekenen, wordt verwezen naar de aanvullende bestand Flowcytometrie Calculations.docx en tabel 1.

Resultaten

De hier beschreven methode werd gebruikt om aan te tonen dat dubbelstrengs breuken in de VSG expressieplaats verhoogde het aantal overstappers in een populatie ^8. Hier tonen we representatieve resultaten uit een populatie van trypanosomen die op soortgelijke wijze zijn opgewekt om een ​​dubbele breuken aan de uitdrukking website te genereren. Vergelijken we deze trypanosomen die die niet zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs breuken gegenereerd. Figuur 1 toont...

Discussie

Wat experimentele techniek, is de meest kritische component van het protocol houden alle monsters koude. Trypanosomen zeer snel internaliseren antilichaam gebonden aan hun oppervlak ^9, maar dit proces is afhankelijk motiliteit, en heeft geen invloed op de bepaling zolang de cellen bij 4 ° C gehouden. Alle monsters moeten altijd worden bewaard op ijs, en pipetteren moet snel worden gedaan om de blootstelling aan de 25 ° C lab milieu te minimaliseren. Koud HMI-9 met serum moet beschikbaar zijn bij het begin van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a