Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

Summary

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Abstract

Het National Institute of Health ImageJ is een krachtige, vrij beschikbare software voor beeldverwerking suite. ImageJ heeft uitgebreide deeltjes algoritmes die effectief kan worden gebruikt om verschillende biologische deeltjes tellen. Bij het tellen van een groot aantal van de cel monsters, de hemocytometer presenteert een knelpunt met betrekking tot de tijd. Ook het tellen van membranen van migratie / invasie assays met de ImageJ plugin Cell Counter, hoewel nauwkeurige, is bijzonder arbeidsintensief, subjectief en berucht voor het veroorzaken van pols pijn. Om aan deze behoefte te pakken, ontwikkelden we twee plugins in ImageJ voor de enige taak van geautomatiseerde hemocytometer (of bekende volume) en migratie / invasie cel tellen. Beide plugins berusten op het vermogen om hoge kwaliteit microfoto verkrijgen met minimale achtergrond. Ze zijn gemakkelijk te gebruiken en geoptimaliseerd voor snelle telling en analyse van grote aantallen individuen met ingebouwde analyse-instrumenten kalibratie tellingen helpen. Door de kernbeginsels Cell Counter met een geautomatiseerde telling algoritme en na telling analyse Dit verhoogt het gemak waarmee migratie assays zonder verlies aan nauwkeurigheid kan worden verwerkt.

Introduction

In vitro celtelling is een belangrijke basistechniek in uiteenlopende weefselkweek experimenten. Het nauwkeurig bepalen van het aantal cellen in een cultuur essentieel voor experimentele reproduceerbaarheid en standaardisatie ^1,2. Celtelling kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer en met behulp van verschillende geautomatiseerde methoden, elk met hun eigen voordelen en nadelen ^3,4,5. De meeste geautomatiseerde werkwijzen voor celtelling behoren tot een van twee klassen, die de Coulter-principe gebruikt of flowcytometrie. Coulter tellers profiteer van cellen elektrische weerstand naar cel aantal en de grootte te ....

Protocol

1. samengestelde microscoop en Camera Setup (Cell Concentration Calculator)

1. Verhoog de helderheid lamp volledig met het licht instelknop, over te schakelen naar de 4x objectief, en zorgen voor fase contrast filters worden geselecteerd.
   OPMERKING: omgekeerde fase contrast microscoop voor weefselkweek met een donkere achtergrond, bijvoorbeeld PhP fasecontrast, kan worden gebruikt volgens standaard procedures microscoop en camera.
2. Binnen de software van de microscoop, reeks opname-instellingen op de standaardwaarden.
   OPMERKING: Raadpleeg de microscoop handleiding om de locatie van deze instellingen te vinden.
   1. Stel, &#....

Results

Cell Concentratie Calculator

Figuur 1 toont het totale proces van CCC kalibratie en telbare beeldacquisitie. Figuur 1A en 1B tonen de P-vierkant beeld kalibratie en berekening van de P-square lengte in pixels. CCC bepaalt celconcentratie in een bepaald volume met de formule:

Discussion

Kritische Stappen, problemen oplossen, en beperkingen

De aard van geautomatiseerde rekenmethoden, bijzonder diegenen van deeltjesanalyse, vereist de wiskundige mogelijkheid om deze deeltjes te bepalen. Bijgevolg is de nauwkeurigheid van beide Cell Concentratie Calculator en migratie test teller is majorly afhankelijk van het trouw, dat wil zeggen, hoe nauw het opgenomen beeld lijkt op de cel monster of migratie assay membraan. Het is daarom van het grootste belang om microscoop en de bijbehoren.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required