Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare In Vitro Transactivering Bioassays

Samenvatting

Een protocol om te screenen op endocriene activiteit in organische extracten van watermonsters, inclusief behandelde afvalwaterafvoer en oppervlakte (ontvangende) water, werd aangepast met behulp van commercieel verkrijgbare divisie-geremde ("freeze and thaw") in vitro transactivatie bioassays.

Samenvatting

In vitro transactivatie bioassays hebben aangetoond belofte als de waterkwaliteit controle-instrumenten, maar hun goedkeuring en de wijdverbreide toepassing is gedeeltelijk gehinderd door een gebrek aan gestandaardiseerde methoden en de beschikbaarheid van robuuste, gebruiksvriendelijke technologie. In deze studie werden commercieel beschikbare-divisie gearresteerd cellijnen toegepast om kwantitatief screenen op hormonale activiteit van chemicaliën aanwezig in watermonsters interesse milieukwaliteit professionals. Een enkele, gestandaardiseerd protocol dat uitgebreide kwaliteitsborging / kwaliteitscontrole inbegrepen (QA / QC) controles is ontwikkeld voor Oestrogeen en glucocorticoïde receptor-activiteit (ER en GR, respectievelijk) met behulp van een cel-gebaseerde Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Monsters van de behandelde afvalwater effluent en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië (USA), werden geëxtraheerd met behulp van vaste fase extractie en geanalyseerd op hormonale activiteit met de gestandaardiseerde protocol. Achtergrond en de dosis-respons voor endpoint-specifieke verwijzing chemicaliën voldaan QA / QC-richtlijnen voor een betrouwbare meting noodzakelijk wordt geacht. De biologische screening respons voor oppervlaktewater monsters was grotendeels niet aantoonbaar. In tegenstelling effluent monsters van secundaire zuiveringsinstallaties had de hoogste meetbare activiteit, met een geschatte bioassay equivalente concentraties (BEQ) tot 392 ng dexamethason / l voor GR en 17 ng 17β-estradiol / L ER. De biologische respons voor een tertiaire effluent steekproef was lager dan die gemeten voor het secundair afvalwater, wat wijst op een lagere residu van endocriene actieve stoffen na geavanceerde behandeling. Dit protocol is gebleken dat in vitro bioassays transactivatie die commercieel verkrijgbaar benutten-divisie gearresteerd cell "kits", kan worden aangepast om te screenen op endocriene werking in water.

Inleiding

De huidige monitoring van de waterkwaliteit is gebaseerd op het vermogen om nauwkeurig en precies meten van de aanwezigheid van chemische contaminanten als een proxy voor de blootstelling aan wilde dieren en de mens. Dit kan echter chemisch-by-chemische monitoring en evaluatie paradigma geen gelijke tred met de steeds veranderende chemische universum dat we onder ogen zien. Als we meer over het lot en de gevolgen van synthetische en natuurlijke chemicaliën te leren, blijven we zoeken naar meetinstrumenten die pakken verwachte biologische effecten, en dat op hetzelfde moment immuun zijn voor veranderingen in de chemische productie, het gebruik en omgevingsfactoren ingang. Dergelijke hulpmiddelen zijn vooral van belang voor het begrijpen of onbekende of nieuwe chemische stoffen en omzettingsproducten, verdienen onze aandacht. Bovendien zijn complexe mengsels van chemicaliën aanwezig in het water slecht aangepakt door individuele chemische monitoring. Zo staan ​​we voor de uitdaging van de modernisering van de bestaande controle toolbox om beter aan te pakken deze problemen in het oppervlaktewater that ontvangen lozing van gezuiverd afvalwater effluent en stedelijke / regenwaterreproductie.

In de afgelopen jaren zijn bio-analytische technieken aangetoond belofte als screening instrumenten voor de beoordeling van de waterkwaliteit. In het bijzonder, in'vitro bioassays die reageren op chemische stoffen die werken via bekende, specifieke werkingsmechanismen ^1,2 zijn van groot belang voor het toezicht op het milieu gemeenschap ^3. Talloze onderzoeken hebben gebruikt in vitro bioassays om de hormonale activiteit van het drinken, oppervlakte- en afvalwater ^{4 -6} kwantificeren. Bovendien is een aantal bioassays doelmolecuulgewicht initiërende gebeurtenissen (bijvoorbeeld receptor activering) die mogelijk kunnen dienen schadelijke effecten via negatieve uitkomst pad analyses ^7,8.

De evolutie van bioscreening voor de beoordeling van de waterkwaliteit is relatief snel geweest, met honderden verschillende in vitro bioassay eindpunten zijn geëvalueerd op hunhulpprogramma ^9,10. Op dit moment zijn er slechts een handvol van de bioassays is aangetoond dat ze goede meetnauwkeurigheid (binnen laboratoria) te bereiken, terwijl het aantonen van de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen water kwaliteiten ^5,6. Voor gezuiverd afvalwater effluent in het bijzonder, heeft het optreden van oestrogenen en glucocorticoïden steroïden met succes verantwoord op basis van in-vitro-transactivatie assays ^11,12. De meeste studies tot op heden toegepaste bioassays waarvan cellijnen proprietary (en dus niet overal beschikbaar), vereisen voortdurende zorg en manipulatie, of beide. Als gevolg daarvan, de mogelijkheid om protocollen te standaardiseren, het uitvoeren van inter-laboratorium kalibratie oefeningen, en uiteindelijk tot deze screening technologie over te dragen aan de waterreserves gemeenschap blijft gehinderd.

Ten minste één leverancier van biologische in vitro testen doorgelicht door het Amerikaanse ToxCast programma is in de handel verkrijgbaar ¹³ in gemakkelijk te bevriezen en ontdooien gebruiken "4; formats. Deze cel-deling gearresteerd "kits" bleken robuust meten van de activiteit van chemische stoffen onttrokken water die verschillende niveaus van de behandeling ¹⁴ te zijn. Hoewel verkoper protocollen zijn beschikbaar om de bioactiviteit van afzonderlijke chemische stoffen of mengsels screenen, sommige moeten worden gewijzigd alvorens ze kunnen worden toegepast watermonsters. Gezuiverd afvalwater effluent ^15, regenwaterreproductie ^16, de ontvangende wateren ^17,18 en meer recentelijk gerecycleerd water ^19,20 zijn goede voorbeelden van waterige media, die van belang zijn voor de kwaliteit van het water gemeenschap.

Deze studie geeft een enkele, gestandaardiseerd protocol om de hormonale activiteit in watermonsters te meten met behulp van in de handel verkrijgbare,-divisie gearresteerd in vitro transactivatie bioassays. We hebben aangetoond robuustheid van het protocol door middel van een uitgebreide beoordeling van de achtergrond, de dosis responsiviteit en herhaalbaarheid van respons voor two eindpunten van bijzonder belang Estrogen and Glucocorticoid Receptor transactivatie (ER en GR, respectievelijk). Het protocol werd toegepast op het scherm monsters van gezuiverd afvalwater afvalwater en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië.

Protocol

1. verzamelen en verwerken Water Sample (Gewijzigd van Escher et al. ⁹⁾

1. Vul een schone 1 L amberkleurige glazen flacon met 1 g natriumazide en 50 mg ascorbinezuur naar de top met watermonster van belang. Store monster bij 4 ° C en het proces binnen 72 uur.
   OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig en moeten met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Gebruik beschermende kleding (oog- / gezichtsbescherming, handschoenen, kleding) en wegen in een goed functionerende rook-hood. Gebruik geen metalen spatel voor het wegen.
2. Passeert het monster door een 1,6 uM glasvezelfilter en vervolgens door een vooraf geconditioneerde vastefase-extractie (SPE) cartridge met een stroomsnelheid van 5-10 ml / min. Stel de druk van de vacuümpomp om de stroom te regelen.
3. Vacuüm drogen de patroon 15 min.
4. Elueer de cartridge 10 ml methanol, gevolgd door 10 ml aceton: hexaan (1: 1, v / v).
5. Concentreer eluaat ~ 1 ml onder een zachte stroom van zeer zuivere stikstof. solventuitwisseling door toevoeging van 500 pl dimethylsulfoxide (DMSO) en verdampen van het extract tot 500 pl.
6. Breng het extract om een ​​amberkleurige glazen autosampler flesje. Bewaar bij -20 ° C.

2. Bereid verdunningen van de Assay specifieke verwijzing Chemie en Water Extract

1. Bereid 9 verdunningen voor de kalibratie curve.
   1. Voeg een voorraadoplossing van de assay specifieke referentiestof in 100% DMSO. De eindconcentratie moet 2 uM 17β-oestradiol voor de test ER en 100 pM dexamethason voor het GR assay. Bewaar de voorraad oplossingen bij -20 ° C.
   2. Voeg 15 ul van de passende verwijzing chemische voorraad tot 285 pl assay medium in een steriele buis (buis # 1). Meng het monster door en neer te pipetteren.
   3. Voeg 200 ul van een oplossing van 5% DMSO in testmedium in 8 extra buizen (buizen # 2-9).
   4. Transfer 100 pi monster van de buis # 1 aan de buis # 2 tot en met bade # 9 een 3-voudige verdunningsreeks voeren. Elk verdund monster moet grondig gemengd worden met een pipet voor het nemen van een monster en toe te voegen aan de volgende buis.
2. Bereid een oplosmiddel controlemonster door 10 gl DMSO in 190 pl assay-medium.
3. Bereid vier verdunningen voor elk water extract.
   1. In de eerste buis, voeg 5 ul van water extract in 95 ul assay medium en meng. Voeg 50 ul van 5% DMSO in testmedium in drie andere buizen.
   2. Voer een 2-voudige verdunning van overdracht 50 pi oplossing van de ene buis naar de volgende.

3. Bereid de Cell Suspension om de FRET Bioassay gedragscode

1. Bereid de assay specifiek medium volgens de instructies van de fabrikant. Testmedium moet worden bewaard bij 4 ° C en opgewarmd tot 37 ° C in een waterbad vóór gebruik.
2. Neem een ​​flesje van ER of GR-divisie gearresteerd cellen uit de cryogene gratiszer en ontdooien van de cellen snel door het plaatsen van de flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 2 minuten onder zacht schudden. Ontsmet de flacon met 70% ethanol en plaats deze in een Klasse II biologische veiligheidskabinet.
3. Open de flacon met behulp van aseptische technieken en breng de cellen in 10 ml testmedium.
4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
5. Zuig het supernatant met een steriele glazen pipet en resuspendeer de celpellet in 6 ml testmedium.
6. Meng 5 ul van celsuspensie met 5 ul van een vitale oplossing vlek en voeg een monster in een telkamer.
7. Tel het aantal levende cellen met behulp van een lichtmicroscoop of geautomatiseerde celgetalmeter en schat de dichtheid van levende cellen in de celsuspensie. Verdun zonodig tot een uiteindelijke dichtheid van 550.000 levende cellen per ml testmedium verkrijgen.

4. Plaat cellen in een 96-well Black Wall Clear-bodemplaat en toe Verwaterd Water Extract

1. Maak een bordlay-out die een 9-punts assay specifieke kalibratie-curve, QA / QC monsters en meerdere verdunningen voor elk water extract bevat. Een voorbeeld van een 96-putjesplaat lay-out getoond in Figuur 1.
2. Voeg 90 ul testmedium het repliceren celvrije controleputjes.
3. Giet de celsuspensie in een steriel reservoir pipetteren en voeg 90 ul celsuspensie tot overige putjes met een multichannel pipet.
4. Voeg 10 ul van de verdunde monsters bereid in stap 2 de geschikte putjes. De eindconcentratie van DMSO per putje 0,5% mag maximum.
5. Bedek de plaat met een deksel en plaats deze in een _5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 16 uur.

Figuur 1:. Voorbeeld van een 96-well plaat Layout De multi-well plaat is ontworpen om een specifieke assay ijklijn 3 typen zijnQA / QC controles (media alleen, cellen in schone medium en cellen in DMSO spiked gemiddeld) en 4 verdunningen per water extract. Elke controle en verdunning van water extract wordt geanalyseerd in drievoud putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bereid de laden Solution en toevoegen aan elk putje

1. Na incubatie kan de plaat equilibreren tot kamertemperatuur. Hiervoor FRET bioassay stap 5,2 tot 5,6 moet bij afwezigheid van direct licht worden uitgevoerd.
2. Bereid een 6x loading oplossing volgens de instructies van de fabrikant.
3. Voeg 20 ul van de 6x beladingsoplossing aan elk putje.
4. Voeg 10 ul van cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje om de cytotoxiciteit van het verdunde extract water evalueren.
5. Seal de plaat met aluminium zelfklevende folie.
6. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.

6. Meet cytotoxiciteit en Endocriene Activity Response

1. Stel de microplaat lezer bottom-leesmogelijkheid de instructies van de fabrikant.
2. Voor de FRET transactivatie bioassay, meten fluorescentie in de blauwe (409/460 nm, excitatie (Ex) / emissie (Em) golflengte) en groen (409 Ex / 530 Em nm) kanalen.
3. Voor de cytotoxiciteit assay, meten fluorescentie bij 560 Ex / 590 Em nm.

7. Beoordelen van QA / QC Controles aan de kwaliteit van de gegevens bepalen

1. Vergelijk de gemiddelde fluorescentie van de ruwe celvrije (media) en cellen alleen (cellen in schone testmedium) controles. De media-enige achtergrondfluorescentie ten minste 25% lager dan de respons van de cellen alleen controle.
2. Verwerk de ruwe data FRET. Zowel 'blue' en groene datasets, trek de gemiddelde fluorescentie van de celvrije controleputjes van alle GSM putje met. Bereken deblauw / groen-verhouding voor elke experimentele ook.
3. Vergelijk blauw / groen-verhouding van cellen-only en cellen met DMSO controles. Fluorescentie waarden van deze controles moeten binnen de 15% relatieve standaardafwijking (RSD).
4. Plot de test specifieke kalibratiekromme blauw / groen-verhouding tegen het monster concentratie uitgedrukt als een log molecuulmassa (log M). Bereken de helling, ^R2 en log EC ₅₀ (50% Effect Concentration). Kalibratieparameters dient binnen het verwachte bereik in Tabel 1 vermeld.
5. Bereken de RSD voor drievoudige putjes. De variabiliteit onder replicaatbepalingen minder dan 20% bedragen.
6. Voor de cytotoxiciteit data (Ex 560/590 nm Em), trek de celvrije control gemiddelde (dwz media achtergrond) Uit celbevattende putjes.
7. Bereken de gemiddelde achtergrond fluorescentie afgetrokken voor elk monster. Zet de resulterende fluorescentie data als percentage van de DMSO-controle. Monster verdunningen mag nietvertonen meer dan 20% celsterfte in vergelijking met de cellen alleen DMSO en controles.

8. Analyses van gegevens

1. Bereken de test limiet van de Opsporing (LOD) als het minimum kalibratierespons plus twee standaarddeviaties van het gemiddelde van die reactie.
2. Voor monsters met een dosisrespons, leiden de EC ₅₀   van het water extract over de helling van een lineaire regressie van de kalibratiecurve tussen 10 en 50% effect concentraties van de referentiestof.
3. Bereken de Bioanalytical equivalenten (BEQ) volgens de formule: BEQ = EC ₅₀ referentiekader chemische / EG ₅₀ van watermonster.

Resultaten

In de huidige studie werden 4x 24 uur samengestelde monsters van gezuiverd huishoudelijk afvalwater effluent, 6 pak monsters van oppervlaktewater uit zoetwatersystemen in het zuiden van Californië en een veld leeg, bestaande uit ultrapuur water geselecteerd om dit protocol te illustreren. 3 van de 4 effluent monsters waren afkomstig van conventionele actief slib afvalwaterzuiveringsinstallaties ( "secundaire effluent"), en de vierde uit een geavanceerde waterzuiveringsinstallat...

Discussie

De goed gedocumenteerde potentie van oestrogenen uit de omgeving, zoals de 17β-estradiol (E2), warrants screening voor deze chemicaliën in ng / l concentraties ^23,24. In deze studie, de ER respons voor afvalwater afvalwater (BEQ range: 2,3-17 ng E2 / L) was iets hoger dan gerapporteerd voor secundair afvalwater van Australische RWZI's ^20, terwijl de BEQ voor oppervlaktewater (<0,5 tot 4 ng E2 / L ) waren binnen de gerapporteerde voor oppervlakte- en regenwater elders (<1 tot 11 ng E2 / L)...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit bevat ER division arrested (DA) cellen en LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit bevat GR division arrested (DA) cellen en LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0,4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Ook verkrijgbaar bij ThermoFisher
Corning 96-well zwarte wand, helder bodemplaat	Corning	3603	Afzonderlijk verpakt, steriele met deksel
Whatman glasvezelfilters, GF/A, 1,6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Aluminium verzegelingsfolie voor microplaat	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbinezuur	Fisher Scientific	A61-100	Ook verkrijgbaar bij Sigma-Aldrich
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Moleculaire graad
Oplosmiddelen (aceton, hexaan, methanol)	Fisher Scientific		HPLC-kwaliteit
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Chemisch is zeer giftig en moet met zorg worden gehanteerd. Gebruik beschermende kleding en weeg onder een afzuigkap. Ook verkrijgbaar bij EMD Millipore.
Automatische celteller of hemocytometer	Verschillende*		Leveranciers omvatten Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich en ThermoFisher.
Biologische veiligheidskast klasse II	Verschillende*
CO2 incubator	Verschillende*
Cryogene vriezer	Verschillende*		Vloeibare stikstofopslag is aanbevolen.
Fluorescentie microplaatlezer	Verschillende*		De lezer moet de mogelijkheid hebben om vanaf de bodem te lezen.
* Geen aanbevolen bron, de keuze van deze apparatuur hangt af van budget, gebruiksfrequentie en laboratoriumruimte.