Methodenartikel

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

DOI:

10.3791/54727

⸱

27 oktober 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een eenvoudig protocol met behulp van alleen basislaboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden van een fusie-eiwit te genereren en zuiveren dat muis Myeline Oligodendrocyt Glycoproteïne bevat. Dit eiwit kan worden gebruikt om experimentele auto-immuunencefalitis te induceren die wordt aangedreven door zowel T- als B-cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiple sclerose (MS) is een chronische inflammatoire ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS), waarvan wordt aangenomen dat deze ontstaat als gevolg van auto-immuunreacties die zich richten op myeline. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende diermodel van auto-immuunziekten van het CZS en wordt meestal geïnduceerd via immunisatie met korte peptiden die immuindominerende CD4+ T-cel-epitopen van myeline-eiwitten vertegenwoordigen. Echter, B-cellen herkennen onbewerkt eiwit direct, en immunisatie met korte peptiden activeert geen B-cellen die het native eiwit herkennen. Aangezien recente klinische onderzoeken naar B-cel-depleterende therapieën bij MS een rol hebben gesuggereerd voor B-cellen bij het aansturen van de ziekte bij mensen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die B-cel-herkenning van auto-antigeen integreren. Daarom hebben we een nieuw fusie-eiwit gegenereerd dat de extracellulaire domein van de muisversie van myeline-oligodendroglie glycoproteïne (MOG) bevat, evenals N-terminale fusies van een His-tag voor zuiveringsdoeleinden en het thioredoxine-eiwit om de oplosbaarheid te verbeteren (MOGtag). Er werd een snedeplaats voor het tabaks ets virus (TEV) protease opgenomen om alle tag-sequenties te kunnen verwijderen, waardoor alleen de pure MOG1-125 extracellulaire domein overblijft. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol met alleen standaard laboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden zuiver MOGtag of MOG1-125 te produceren. Dit protocol genereert consistent meer dan 200 mg van het MOGtag-eiwit. Immunisatie met zowel MOGtag als MOG1-125 genereert een auto-immuunrespons die pathogene B-cellen omvat die het native muis-MOG herkennen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS is een menselijke ziekte gekenmerkt door chronische ontsteking en neurodegeneratie van het CZS die wordt gedacht te worden veroorzaakt door een auto-immuunreactie gericht myeline. Het verlies van myeline en axonen na verloop van tijd leiden tot een geleidelijke afname van de cognitieve en motorische functie 1. "Experimentele auto-immune Encefalomyelitis" is een overkoepelende term voor diermodellen van auto-immuunziekten gericht CNS myeline. Als menselijke MS, EAE wordt doorgaans gekenmerkt door infiltratie van immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en in sommige gevallen, demyelinisatie 2. De mate waarin een bepaalde EAE model lijkt op menselijke MS mede afhankelijk van de soort of stam gebruikt en de complexiteit van het onderliggende anti-myeline auto-immuunreactie.

Anti-myeline autoimmuniteit kan experimenteel worden geïnduceerd op verschillende manieren, maar de meest gebruikte methode tegenwoordig gebruikt om muizen te immuniseren met een korte peptide van aminozuren nabootsen van de immunodominante CD4 + T cel epitoop van een myeline-eiwit. Dit is het minimum vereiste om een ​​pathogene respons te induceren. Misschien is de meest voorkomende van deze is een 21 aminozuur peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG 35-55), die wordt gebruikt om EAE te induceren in C57BL / 6 muizen 3. Voor sommige experimentele doeleinden wenselijk of zelfs noodzakelijk om immuniseren met grotere eiwitantigenen en inderdaad zijn er verschillende voordelen aan deze via immunisatie met korte peptide. Ten eerste omdat MHC beperking korte peptiden gewoonlijk alleen effectief in een zeer beperkt aantal stammen, terwijl grotere eiwitantigenen die ofwel het gehele eiwit of een specifiek domein kan normaal worden voor de presentatie in verschillende soorten verwerkt meerdere inteelt muizenstammen of 4. Ten tweede, een groter eiwit antigeen kan induceren een meer complexe immuunrespons waarin meer soorten lymfocyten in antigenherkenning, plaats limiting antigeenherkenning aan CD4 + T-cellen. Bijvoorbeeld, B-cellen via hun B-cel receptor (BCR) communiceren rechtstreeks met geheel in plaats van verwerkte dierlijke eiwitten. Wij en anderen hebben aangetoond dat B-cellen geactiveerd door MOG 35-55 immunisatie niet herkent MOG eiwitten 5. Aangezien B-cellen werden onlangs aangetoond dat een pathogene rol spelen bij menselijke MS 6, EAE modellen die B-cellen bevatten bij auto pathologie steeds belangrijker.

Ondanks de voordelen van grotere eiwitantigenen EAE te induceren, blijven er enkele commercieel beschikbare bronnen voor dergelijke eiwitten. Inderdaad, terwijl korte peptiden zoals MOG 35-55 snel en tegen relatief lage kosten kunnen worden gesynthetiseerd, de commerciële mogelijkheden MOG eiwitten zijn beperkt en de kosten aanzienlijk te schaffen. Toch zijn er een aantal expressievectoren beschikbaar voor onderzoeksgroepen om MOG extracellulair domein te genereren (MOG 1-125) zelf. however, alle expressiesystemen die we hebben geïdentificeerd in de literatuur zijn gebaseerd op oudere technologie die sindsdien zijn vervangen door efficiëntere expressiesystemen 7. Daarnaast bieden de meeste zijn gebaseerd op ratten of mensen MOG 8. Voor sommige onderzoeken van auto-immuniteit bij muizen, een antigeen op basis van de muis MOG autoantigeen voorkeur. Tenslotte alle MOG-gebaseerde eiwitten die we hebben geïdentificeerd, commerciële of als expressievectoren, zijn fusie-eiwitten die additionele aminozuren aan de MOG 1-125 base. Deze omvatten een tag voor zuivering en meestal andere sequenties ook, waarvan vele een functie we konden identificeren.

Om deze beperkingen te pakken, genereerden wij een nieuwe fusie-eiwit op basis van de muis MOG extracellulaire domein gefuseerd aan een label met thioredoxine de bekende onoplosbaarheid van MOG eiwit 5 bestrijden. De tag sequentie bevat ook een 6xHis sequentie voor zuivering en een TEV protease kelAvage plaats dat zorgt voor de volledige verwijdering van tagsequenties, indien gewenst. Dit is de enige methode die we ons bewust van de zuivere MOG 1-125-eiwit te genereren. Om de productie van grote hoeveelheden eiwit te vergemakkelijken, de MOG 1-125 sequentie is codon-geoptimaliseerd voor bacteriële expressie en MOG tag fusie-eiwit werd in de pET-32 expressiesysteem ingebracht. Hier beschrijven we in detail het protocol te produceren en te zuiveren MOG tag eiwit en pure MOG 1-125, met behulp van niet-gespecialiseerde apparatuur beschikbaar voor de meeste immunologie laboratoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eiwit Inductie

OPMERKING: In de volgende stappen, BL21 Escherichia coli bacteriën die zijn getransformeerd met een PET-32 vector die de sequentie voor het MOG tag fusie-eiwit (zie referentie 5 en Figuur 1) worden gekweekt tot hoge dichtheden en worden vervolgens geïnduceerd om de MOG tag eiwit tot expressie brengen . Zie figuur 2 voor de algemene tijdlijn - er rekening mee dat de dagen zijn bij benadering en de plaatsvervangende stoppunten worden vermeld in het protocol. Als ab gezuiverde pET-32 MOG tag vector DNA, is het nodig om chemisch omzetten in competente BL21 E. coli bacteriën gebruikt ampicillineselectie, zoals goed beschreven 9. Succesvolle transformatie worden bevestigd door het zuiveren van DNA uit geselecteerde bacteriën onder toepassing van een standaard commerciële kit, gevolgd door digestie met de restrictie-enzymen AGE1 Sac1 en een 424 bp band produceren op een agarosegel 10.

  1. Inoculeer 5 ml steriel lysogenie bouillon (LB) bouillon (0,1 mg ampicilline / ml) met een BL21-MOG tag glycerol en incubeer deze overnacht bij 37 ° C, 200 rpm.
  2. Plaats twee 1 L Erlenmeyer kolven die 500 ml steriele LB kweekvloeistof in een 37 ° C incubator in voorbereiding op de volgende dag.
  3. Voeg 500 ul van 100 mg / ml ampicilline aan elk van de kolven met 500 ml LB uit stap 1,2 (eindconcentratie 0,1 mg / ml ampicilline). Transfer 1 ml van de overnacht kweek van stap 1,1 tot elk van de twee kolven van LB bouillon. Incubeer bij 37 ° C en 200 rpm gedurende 5 uur of tot een optische dichtheid van 0,6.
  4. Neem een ​​1 ml portie van een van de kolven en breng deze in een afzonderlijke 1,5 ml centrifugebuis. Pellet de cellen bij 16.000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof. Label de buis T 0 (pre-inductie) en vervolgens de bacteriële pellet in een -20 ° C vriezer voor toekomstige natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse (zie paragraaf 8 en Figuur 3).
  5. Voeg 0,5 ml van 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) aan elke kolf. Incubeer de kolven bij 37 ° C, 200 rpm gedurende 4 uur, vervolgens bij kamertemperatuur bij 75 rpm overnacht.

2. Oogsten MOG tag Protein

Opmerking: In dit stadium zullen de bacteriën hebben grote hoeveelheden MOG tag eiwit. Om MOG tag te oogsten, zijn bacteriën eerst gelyseerd in een Triton X-100 buffer, gevolgd door sonicatie. MOG tag wordt vervolgens vrijgelaten uit inclusielichamen en gedenatureerd met guanidine en imidazool, waardoor een ruw eiwit oplossing die het eiwit MOG tag.

  1. Neem een ​​1 ml portie van een van de overnacht kweken van stap 1,5 en overbrengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pellet de cellen bij 16.000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof. Label het bade T O / N (na inductie) zet dan de bacteriële pellet in een -20 ° C vriezer voor toekomstige SDS pagina-analyse (Figuur 3).
  2. Verdeel de culturen gelijkmatig onder de 250 ml flesjes compatibel met hoge snelheid centrifugeren en houd deze op ijs vanaf dit punt naar voren. Pellet de bacteriële cellen bij 22.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  3. Verwijder het supernatant. Bewaar de bacteriële pellets bij -20 ° C of ga verder met stap 2.4.
  4. Bereid lysisbuffer (0,1 mg / ml lysozym van kippeneieren, 0,1% Triton-X (v / v) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) door toevoeging van 60 pl Triton X-100 en 120 gl 50 mg / ml lysozym van kippeneieren stockoplossing aan 60 ml PBS.
  5. Resuspendeer en combineer alle bacteriële pellets uit stap 2,3 in een totaal van 30 ml lysisbuffer. Transfer dit volume om een ​​ronde ml buis bodem 50 in staat hoge snelheid centrifugeren. Zet deze tube in een 30 ° C waterbad gedurende 30 minuten. Tijdens de incubatietijd, schud de buistwee keer om de cellen te mengen.
  6. Na de incubatie, overdracht van de buis op ijs en ultrasone trillingen de oplossing bij 20 kHz, amplitude 70%, pols op 3 sec, pulse off 3 sec, en vijf pulsen per ronde. Sonificeer de oplossing voor in totaal zes rondes en laat de oplossing afkoelen op ijs tussenin rondes.
  7. Centrifugeer de oplossing bij 24.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en herhaal de stappen 2,5-2,7 keer. Bewaar de pellet bij -20 ° C of ga verder met stap 2.8.
  8. Bereid buffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazool, pH 7,9) door toevoeging van 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl en 0,01021 g imidazool een 100 ml bekerglas. Voeg H2O totdat het volume 28 ml bereikt pas de pH van de oplossing 7,9. Daarna breng de oplossing een 100 ml maatcilinder en voeg H2O totdat het volume 30 ml.
  9. Resuspendeer de pellet uit stap 2.7 in 30 ml buffer A en incubeer deze oplossing bij 4 ° C gedurende 3 uur. Gedurende deze periodeWeeg 17,2 g guanidine-HCl.
  10. Ultrasone trillingen van de oplossing op het ijs met dezelfde instellingen als in stap 2.6. Voeg vervolgens 17,2 g guanidine-HCl oplossing. Incubate dit op ijs gedurende 1 uur aan de MOG tag eiwit oplosbaar te maken.
  11. Centrifugeer de oplossing bij 24.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en bewaar het supernatant bij 4 ° C tot eiwitzuivering.

3. Protein Purification

OPMERKING: In de volgende stappen van de MOG tag eiwit door middel van 4 rondes van absorptie zal worden gezuiverd op opgeladen nikkel hars (via de His-tag) en elutie.

  1. Maak de volgende Buffers:
    1. Bereid buffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidine-HCl, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazool en 114,64 g guanidine-HCl in een 500 ml bekerglas. Voeg vervolgens H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de solution aan een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    2. Bereid elutiebuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazool, 6 M guanidine-HCl, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazool en 114,64 g guanidine-HCl in een 500 ml bekerglas. Voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de oplossing in een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    3. Bereid Strip buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA tot een 500 ml bekerglas. Voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de oplossing in een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    4. Bereid Charge buffer (0,1 M nikkel sulfaat). Voeg 5,257 g nikkelsulfaat een bekerglas van 500 ml en voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt (LET OP, niet omgaan met nikkelsulfaat buiten een zuurkast tot de nikkel sulfaat werd opgelost in H 2 O). Zodra de nikkelsulfaat is opgelost, breng de oplossing een 250 ml maatcilinder en voeg H2O totdat het volume 200 ml bereikt.
  2. Split 10 ml nikkel hars tussen twee conische 50 ml centrifugebuizen bestand tegen centrifugaalkrachten dan 4500 xg (5 ml per buisje).
  3. Laad en evenwicht de nikkel hars:
    1. Was de hars door het toevoegen van 40 ml H2O aan elke buis bevattende hars. Leg de buizen horizontaal op een rocker en laat ze ageren gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar Centrifugeer de buizen bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
    2. Verwijder het supernatant door pipetteren om te voorkomen dat verstoring van de pellet. Voeg 40 ml Betalende buffer aan elke buis. Breng de buizen op een rocker en laten roeren gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar Centrifugeer de buizen bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
    3. Verwijder het supernatant en voeg 40 ml buffer B aan de buizen. Overdracht van de buizen op een rocker en laat ze ageren gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar Centrifugeer de buizen bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C gooi de supernatanten.
  4. Optioneel: Neem 150 ul van het opgeloste eiwit verzameld in stap 2.11 en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Label de buis als voorincubatie en vries dit bij -20 ° C voor toekomstig SDS pagina-analyse (Figuur 3, ruwe MOG tag).
  5. Zuiver het MOG tag Protein:
    1. Breng de volledige hoeveelheid oplosbaar eiwit uit stap 2,11 (~ 40 ml, minus het kleine monster verwijderd in stap 3,4) aan de eerste buis (figuur 2, buis 1) die nikkel hars van stap 3,3, meng en zet horizontaal op een rocker bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    2. Centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar, de overdracht van de bovenstaande vloeistof naar de tweedebuis (figuur 2, buis 2) nikkel hars en incubeer zoals beschreven in de vorige stap. In de tussentijd verder met stappen 3-6 hieronder buis 1.
    3. Resuspendeer de nikkel hars in buis 1 in 40 ml elutiebuffer en plaats de buis horizontaal op een rocker bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
    4. Breng de bovenstaande met geëlueerde MOG tag eiwit in een ml fles 250 met het label 'gezuiverd MOG tag eiwit' en houd deze fles bij 4 ° C. Bij elke elutiestap, verzamel het resulterende supernatant in deze fles.
    5. Voeg 40 ml strip buffer nikkel hars en plaats horizontaal op een rocker gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    6. Centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, dan laadt u de nikkel hars zoals vermeld in stap 3.3.
    7. Eenmaal klaar, verder te gaan met de tweede buis zoals vermeld in stap 3.5. Een totaal van 4 rounds van absorptie van het opgeloste eiwit uit stap 2,11 op de geladen nikkel hars en elutie meeste van het eiwit alhoewel herstellen, indien gewenst, additionele eiwit kan worden teruggewonnen extra ronden van absorptie en elutie.
  6. Eenmaal vier (of meer) ronden van absorptie en elutie zijn voltooid, slaat de samengevoegde gezuiverde eiwit bij 4 ° C overnacht. Nikkel hars kan worden opgeslagen in 40 ml van een 20% ethanol oplossing bij 4 ° C totdat deze weer nodig is.

4. Meten eiwitconcentratie

Opmerking: alvorens verder te gaan is het noodzakelijk om de hoeveelheid gezuiverd eiwit MOG tag gegenereerd in punt 3. kwantificeren Deze waarde wordt gebruikt om het uiteindelijke volume op het eiwitconcentraat aan het eind van het protocol te bepalen. We beschrijven een standaard Bradford Assay hier. De concentratie van gezuiverd eiwit MOG tag wordt bepaald door de spectrale absorptie in serie diluted MOG tag eiwit aan een standaardkromme van runderserumalbumine (BSA) bij een bekende concentratie.

  1. Voeg 10x acetaatbuffer door toevoeging van 23 ml ijsazijn 8,2 g natriumacetaat in een 3 L bekerglas en voeg 1,9 L H 2 O het natriumacetaat lossen. Breng deze oplossing over een 2 L maatcilinder en voeg H 2 O totdat het volume bereikt 2 L. slaan dan in een 2 liter fles bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml van 1x acetaatbuffer door toevoeging van 100 pl 10x acetaatbuffer met 900 ui H2O
  2. Het opzetten van een 96-wells plaat verdunningen door het toevoegen van 30 ui 1 x acetaatbuffer putjes G2-8 en 60 pl G9. Voeg 48 pl 1x acetaatbuffer H2 en H3.
  3. Stel de eerste seriële verdunning van de BSA norm rij G als volgt: Voeg 216 ul van 1 x acetaat buffer en 54 pl van commercieel verkrijgbaar 2 mg / ml BSA standaard goed G1 en meng. Voeg 210 ul van goed G1 goed G2, meng,en voeg dan 180 ul van goed G2 om goed G3. Voeg 150 ul van goed G3 om goed G4, meng goed, en blijven deze trend van het toevoegen van 30 pi minder om elk volgend goed tot goed G8. (Zie tabel 1 voor lijsten equivalente verdunningsfactoren).
  4. Opgericht drievoudige monsters van elke verdunning door de overdracht van 10 pl en G1 putjes A1, B1 en C1 en 10 pl en G2 putjes A2, B2 en C2, enzovoort. Gebruik een multichannel pipet.
  5. Voor het instellen van verdunningen van MOG tag, voeg 60 ul van gezuiverd MOG tag eiwit uit stap 3,6 tot goed H1. Voeg 12 ul van goed H1 goed H2, meng goed, voeg dan 12 ul van goed H2 goed H3, meng (dit levert een 1x verdunning in H1, 1/5 verdunning in H2 en 1/25 verdunning in H3) .
  6. Opgericht drievoudige monsters voor de MOG tag verdunningen door het overdragen van 10 ul putjes H1-H3 rijen D, E en F, zoals beschreven in stap 4.4.
  7. Meng 2 ml eiwit assay kleurstofreagens concentraat met 8 ml H2O Voeg 200 ul van dit mengsel al voorgeladen putjes in rijen A, B, C, D, E en F, met een meerkanaalspipet, indien beschikbaar. Pop eventuele luchtbellen in de putjes met behulp van een naald vóór het lezen van het eiwit concentratie.
  8. Op 10 min van het toevoegen van de kleurstof reagens, meet de 595 nm absorptie van de putjes in rijen A, B, C, D, E en F.
  9. Gebruik rijen A, B en C om een ​​standaard curve waarin posities 1-9 overeen met 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 en 0 mg / ml BSA. Op basis van deze curve, het berekenen van de concentratie van MOG tag eiwit met behulp van de verdunning van MOG-tag die het beste past bij de standaard curve. Gewoonlijk zal er 200 tot 250 mg MOG tag eiwit van 1 liter bacteriekweek gebruik van het protocol beschreven.
    LET OP: Om MOG 1-125 gaan van hier naar de optionele sectie 7 die aan het eind van het protocol. Ga anders verder met deel 5.

5. dialyse

OPMERKING: Dialyse wordt uitgevoerd geleidelijk guanidine uit de oplossing die gezuiverd, gedenatureerd MOG-tag, waardoor het eiwit opnieuw te vouwen. Zorg moet worden genomen tijdens deze stap MOG zelf is zeer onoplosbaar is, en terwijl dit wordt verbeterd door de aanwezigheid van de tag thioredoxine, is het nog steeds gevoelig uit de oplossing te komen. Daarom hervouwen moeten geleidelijk worden uitgevoerd en bij een betrekkelijk lage concentratie MOG tag.

  1. Voordat dialyse Verdun het gezuiverde eiwit MOG tag met buffer B (buffer B kan als genoemd in stap 3,1) totdat de concentratie 0,5 mg / ml of minder, gebaseerd op het berekende punt 4 hoeveelheid MOG tag.
  2. Snijd ongeveer 30 cm SnakeSkin dialyse tubing en veilig ene uiteinde een vergrendeling hemostaat door vouwen het einde van de slangenhuid drie keer en klemmende het gevouwen einde met de hemostaat. Vul het slangenleer met verdundeMOG tag eiwit (tussen de 60 tot 90 ml van MOG tag eiwit per buis) en verwijder luchtbellen uit het snakeskin door ze uit het open einde forceren. Tenslotte sluit de andere einde van de buis met een tweede vergrendelinrichting hemostaat.
  3. Herhaal stap 5.2 tot extra secties van de dialyse tubing vullen totdat alle MOG tag eiwit in slangenhuid dialyse tubing overgedragen. Zorg ervoor dat er geen lekken zijn.
  4. Maak 1x acetaat met 4 M guanidine door weging uit 382,12 g guanidine-HCl en het toevoegen van 100 ml van 10x acetaat buffer in stap 4.1 naar een 2 L beker. Voeg 0,5 L H 2 O aan de beker en laat de guanidine-HCl op te lossen. Eenmaal opgelost, breng de oplossing om een 1 L maatcilinder en voeg H 2 O totdat het volume bereikt 1 L. Herhaal dit recept voor elke 2 snakeskins die nodig zijn.
  5. Voer dialyse als volgt: Vul een grote emmer (minimaal 10 liter) met 1 liter 1x acetaat buffer met 4 M guanidine uit stap 5.4. Plaats up to 2 delen van dialyse catheter met MOG tag in de emmer, waardoor er ruimte voor een magnetische roerstaaf draaien ongehinderd in de bodem. Doe de emmer in een 4 ° C kamer op een magnetische roer bord en zet hem aan tot een trage rotatiesnelheid (dwz niet hoog, net genoeg om de vloeistof te verplaatsen):
    Opmerking: Voer de volgende stappen om de hoeveelheid guanidine in de buffer geleidelijk af. Roer tijden worden gegeven als minima, maar kan 's nachts worden overgelaten. Dialyse zal een minimum van 3 dagen in beslag nemen, maar dit kan desgewenst worden uitgebreid. Regelmatig te controleren om ervoor te zorgen dat de slang intact is en dat de uiteinden goed gesloten zijn.
    1. Laat de emmer zitten en roer gedurende 4-5 uur.
    2. Voeg 1 liter 1x acetaatbuffer (100 ml 10x acetaat buffer en 900 ml H2O) elk segment.
    3. Herhaal stap 5.5.1 en 5.5.2 in totaal 3 keer voor een totaal van 4 liter buffer in de emmer.
    4. Gooi de helft van de buffer in de emmer en vul met 1 liter 1x acetaatbuffer (100 ml 10x acetaat buffer en 900 ml H 2 O, nee guanidine) en het opzetten van de slangen en roerstaafje.
    5. Herhaal stap 5.5.1 en 5.5.2 een keer (dat wil zeggen tot er een totaal van 4 L van buffer in de emmer).
    6. Tot slot, de plaats van de gehele 4 L volume in de emmer met 4 L verse 1x acetaat buffer en laat roer gedurende 4-5 uur. Voor het beste resultaat, doe deze stap op de dag van de eiwitconcentratie.
    7. Verwijder voorzichtig de dialyse buis met opgevouwen MOG tag en gooi emmer buffer.

6. Concentreren MOG tag Protein

LET OP: In de laatste stap wordt opgevouwen MOG tag eiwit geconcentreerd tot de werkende verwatering voor opslag. Zoals MOG tag is zeer onoplosbaar is, moet het niet meer dan 5 mg / ml. Deze concentratie is ongeveer equimolair met 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptide, die gewoonlijk wordt gebruikt om EAE te induceren bij muizen (gemengd 1: 1 met volledig Freund's adjuvant (CFA)). Tijdens het concentratieproces is het niet ongebruikelijk dat een kleine hoeveelheid eiwit uit de oplossing in de vorm van witte neerslag. Overmatige neerslag is echter een probleem.

  1. Bereken het uiteindelijke gewenste volume een MOG tag concentratie van 5 mg / ml, gebaseerd op het berekende punt 4 te bereiken.
  2. Bekleed een pan met aluminiumfolie en dek de aluminiumfolie met polyethyleenglycol (PEG) 3350 en PEG 8000 in een 1: 1 ratio. De PEG 3350 is opgenomen in dit mengsel als het kan helpen bij het concentreren voorkomen eiwit aggregatie en is een effectieve cyropreservative 11.
  3. Zet de slangenhuid buis (met MOG tag eiwit binnen) bovenop het aluminiumfolie en bedek met PEG 8000. Laat deze zitten bij kamertemperatuur en controleer het volume regelmatig tot het volume gelijk is aan of lager dan de geschatte uiteindelijke volume (berekend in stap 6,1), zal de werkelijke volume gemeten in de volgende stap. Als de pan wordtoververzadigd met water tijdens de concentratie proces, het opzetten van een nieuwe pan met aluminiumfolie en PEG 3350 en PEG 8000.
  4. Het uiteinde van de snakeskins met H2O en breng de MOG tag eiwit aan een aparte glazen fles met behulp van een serologische pipet. Houd het volume het eiwit wordt overgebracht naar zorgen volume correct is.
    1. Als het volume onder de veronderstelde eindvolume gereduceerd, voeg 1x acetaatbuffer tot het gewenste volume is bereikt. Als het volume hoger is dan de geschatte uiteindelijke volume, de overdracht van de MOG tag eiwit terug in de dialyse-buizen en blijven de concentratie (stappen 6,2-6,3).
    2. Verdeel de MOG tag eiwit bij 1,5 ml buisjes (0,5 ml per buis), de buizen bewaren bij -80 ° C totdat het nodig is. Om EAE induceren, meng dit volume 1: 1 met CFA.
  5. Run een SDS PAGE gel om de expressie van de MOG tag eiwit met behulp van de maatregelen die in 1 stappen monsters te bevestigen.4, 2.1, 3.4, en het gezuiverde MOG eiwit uit stap 6.4.

7. Het genereren van MOG 1-125 van MOG tag Met behulp van TEV Protease (optioneel)

Opmerking: Deze optionele stap verder vanaf het einde van stap 4. Als MOG 1-125 zonder extra tagsequenties nodig, kan de tag sequenties worden verwijderd met TEV protease (Figuur 4). Voor zover wij weten, is er geen ander expressiesysteem dat in staat is zuivere MOG 1-125. Er moet echter worden opgemerkt dat zonder thioredoxine tag, MOG 1-125 zeer slecht oplosbaar en kan problemen veroorzaken tijdens de zuivering en behandeling, en daarom verwijdert de tag als het absoluut noodzakelijk voor experimentele redenen. Verschillende stappen zijn nodig om pure MOG 1-125 genereren. MOG tag wordt eerst gedialyseerd in TEV protease-splitsing buffer. Na digestie met TEV protease, neemt het volume af te helpen bij latere zuivering steps, dan gedialyseerd in buffer B, en dan is de His-tag bevat tag volgorde wordt verwijderd met behulp van nikkel hars. Ten slotte wordt eiwit gekwantificeerd en zuivere MOG 1-125 geconcentreerd tot de eindconcentratie.

  1. Voeg 1 L 10x TEV splitsing buffer (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) door toevoeging van 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl en 26,5 g Tris naar een 2 L beker. Voeg H 2 O totdat het volume 990 ml bereikt vervolgens op pH 8 om de EDTA te ontbinden. Breng de oplossing een 1 L maatcilinder en breng het volume op 1 L met behulp H2O
  2. Verdun MOG tag eiwit van stap 3,6-0,5 mg / ml met behulp buffer B (dezelfde buffer in stap 3.1 beschreven), gebaseerd op de berekende hoeveelheid eiwit gedeelte 4. Breng 120 ml verdund MOG tag eiwit slangenhuid dialyseslang beschreven in stappen 5,2-5,3. Het volume kan worden opgeschaald echter het bedrag van de TEV protease nodig om alle van de MOG tag eiwit klieven zal STOFFE zijnntial.
  3. Volg de dialyse-protocol in stap 5.5 vermeld, met uitzondering van de plaats van de 10x acetaat buffer met 10x TEV decollete buffer in stap 7.1.
  4. Breng de MOG tag, nu TEV splitsing buffer, een nieuwe 250 ml glazen flesje en bewaken de toename van dialyse. Voeg 1 pl β-mercapto-ethanol per elke 2,85 ml MOG eiwit tag aan de fles toegevoegd. Voeg ten minste 1 mg TEV protease (TEV stock oplossing bij 5 mg / ml) per 50 mg eiwit MOG tag (TEV protease kan tot 01:10 TEV toegevoegd: eiwitverhouding MOG) en incubeer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht gedurende ten minste 72 uur.
    OPMERKING: Aan het einde van de TEV protease incubatie dient witte neerslagen te zien aan de onderkant van de glazen fles.
  5. Alvorens de eiwit dialyse tubing, voeg guanidine-HCl oplossing totdat de eiwitten oplossen om te voorkomen dat het eiwit precipiteert plakken aan de glazen fles. Transfer 150 pivloeistof over in een 1,5 ml microcentrifugebuis en label de buis als "MOG met TEV". Bewaar de oplossing bij -20 ° C voor toekomstig SDS-PAGE-analyse.
  6. Overdracht van al de vloeistof uit stap 7.5 in dialyseslang zoals opgesomd in stappen 5,2-5,3. Vul een grote emmer met 2 L H 2 O en plaats de dialyse buis in de emmer. Incubeer dit bij 4 ° C met licht 's nachts roeren. Deze stap is belangrijk te verdunnen de guanidine zodat de eiwitconcentratie te snel gaan en beginnen met het verwijderen van de EDTA-oplossing die stoort eiwitzuivering.
  7. Concentreer het eiwit in de dialyseslang zoals genoemd in stappen 6,2-6,3 (behalve alleen PEG 8000) zodat het eindvolume van de oplossing ~ 40 ml. Was de dialyse buis met H 2 O en verwijder eventueel resterende PEG 8000 nog aan de buis. Deze vermindering in volume maakt het mogelijk om alle gedigereerd eiwit passen in een 50 ml buis met nikkel resin, zoals beschreven in stap 3.5.
  8. Dialyseren de verteerde Protein om Buffer B:
    1. Vul een grote emmer met 1 liter buffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g imidazool, 573,18 g guanidine-HCl, pH 7,9).
    2. Plaats de snakeskins die gedigereerd eiwit uit stap 7.7 in de emmer samen met een roer magneet (zoals in meer detail in stap 5,5). Doe de emmer in een 4 ° C koude kamer op een roer plaat ingesteld op een langzame roer en laat de snakeskins te dialyseren voor 5 of meer uur.
    3. Leeg de emmer en vul het met een andere 1 liter buffer B en laat deze zitten in de 4 ° C koude kamer op een roer plaat ingesteld op een langzame roer en laat de snakeskins te dialyseren voor 5 of meer h.
  9. Voer zuivering van de MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in hoofdstuk 3, met als belangrijk verschil dat het gesplitste tag sequenties gebonden zal zijn door de nikkel-hars, waardoor MOG 1-125 in oplossing. Nogmaals, 4 rondes van zuiveringuitgevoerd op hetzelfde volume, maar in dit geval is het doel om de zuiverheid te verbeteren en niet zoveel eiwit herstellen mogelijk. Zie Figuur 4.
    1. Maak de eiwitzuivering buffers in stap 3.1 genoemde
    2. Laad beide buizen nikkel hars zoals beschreven in stap 3.3.
    3. Zuiver MOG 1-125 door het protocol beschreven in stap 3,5, de essentiële uitzondering dat het eluaat van de nikkel bevattende hars tag verwijderd (houd 150 pl van het eluaat in een 1,5 ml microcentrifugebuis toekomstige SDS-PAGE-analyse), terwijl de oplossing die MOG 1-125 wordt gehandhaafd als eindproduct.
  10. Meet de concentratie van MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in hoofdstuk 4:
    1. Het opzetten van de BSA norm curve verdunningen zoals beschreven in stap 4.2 en 4.4.
    2. Stel de verdunningen van MOG 1-125 zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6. Alternatief kan het nuttig zijn om een ​​groter bereik te genererenverdunningen (1 x, 1/2, 1/4 en 1/8, bijvoorbeeld). Pas volumes 1x acetaatbuffer en MOG 1-125 dienovereenkomstig.
    3. Voer de Bradford assay zoals beschreven in stap 4,7-4,9 en bereken de hoeveelheid MOG 1-125 gegenereerd. De verwachte opbrengst is ongeveer 4 mg of meer eiwitten.
  11. Refold MOG 1-125 door de geleidelijke afschaffing van de guanidine via dialyse, zoals beschreven in hoofdstuk 5.
  12. Concentreer MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in paragraaf 6. De eindconcentratie moet 2,24 mg / ml, met équimolaire hoeveelheden tot 5 mg / ml MOG tag.

8. SDS-PAGE gel te bevestigen MOG tag Productie en Zuiverheid

LET OP: Monsters genomen uit stappen 1.4, 2.1, 3.4 en 6.4 worden geanalyseerd door standaard SDS-PAGE om MOG tag productie en zuiverheid te bevestigen. Deze stap moet worden uitgevoerd na de laatste zuivering van een van beide MOG tag of MOG 1-125.

  1. Wordt 2x SDS-PAGE laadbuffer door toevoeging van 1,576 g Tris-HCl tot 2 ml H2O en stel de pH op 6,8. Voeg 0,4 g SDS in de Tris-HCl-oplossing en voeg H2O totdat het volume 7 ml bereikt.
  2. Voeg 0,2 g broomfenolblauw tot 10 ml H2O voeg 1 ml van deze aan de oplossing in stap 8,1. Tot slot, voeg 2 ml glycerol aan de 2x SDS-PAGE laadbuffer afmaken. Bij het opslaan deze oplossing bewaren bij 4 ° C en beschermd tegen licht gedurende maximaal 3 maanden.
  3. Ontdooi de bevroren monsters van bacteriën van stap 1,4 en 2,1 en de opgeloste MOG tag eiwit van stap 3,4 en 6,4 bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de zouten uit de gegevens die in stappen 3,4 en 6,4 oplossingen door toevoeging van 60 ul van elk eiwit ontzouten kolommen. Zuiver de eiwitten volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Voeg 20 ul van β-mercapto-ethanol 1 ml van de oplossing bereid in stap 8.2. Voeg 40 ul van dit beide bacteriaal pellets uit stap 8,3 en 60 ul ontzoute de eiwitten van stap 8,4 en incubeer deze bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
  6. Maak 1x SDS pagina running buffer door weging uit 5 g Tris, 28,8 g glycine en 1 g SDS. Voeg deze aan een 1 liter beker en voeg 500 ml H 2 O om alles op te lossen. Eenmaal opgelost, breng de oplossing om een 1 L maatcilinder en vul aan met H 2 O totdat het volume 1 L. bereikt
  7. Het opzetten van een 12% polyacrylamidegel in een gelapparaat voeg de 1x SDS-PAGE running buffer om de gel inrichting zodanig dat de loopbuffer net boven de bovenzijde van de putjes in de gel. Was de putjes van de gel eveneens 50 gl loopbuffer in de putjes vijf keer per.
  8. Belasting 10 pl proteïneladder in het eerste putje en voeg 10 ul van de gekookte oplossing van stap 8,5 afzonderlijke putjes. Voer de elektroforese bij 115 V gedurende 60 minuten.
  9. Verwijder de gel uit de inrichting en overbrengen naar een kleine container. Vul het ContaIner met 100 ml zuiver H2O en de container over te brengen naar een langzaam draaiende platform 8 min. Na 8 minuten, dump het water en was de gel tweemaal met H2O
  10. Dump H 2 O uit de kolf en voeg 100 ml van snelle vlek reagens om de container. Toestaan ​​dat dit op een langzaam draaiende platform zitten 's nachts, dek af met aluminiumfolie.
  11. Dump de snelle vlek reagens en voeg ongeveer 100 ml H2O aan de houder. Toestaan ​​dat dit op een draaiend platform te zitten voor 8 min. Dump de H 2 O en herhaal de H 2 O wassen tweemaal.
  12. Beeld de gel onder gebruikmaking van een beeldvormer voor Coomassie blauwe vlekken. Kijk voor een band rond 31.86 kDa (MOG tag eiwit) en een zwakkere band bij 63,72 kDa (MOG tag dimeren).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zodra de zuivering is voltooid, afgenomen in stappen 1,4, 2,1, 3,4, en het eindproduct van stap 6.4 moeten worden uitgevoerd op een eiwitgel (Figuur 3A). MOG tag moet eerst verschijnen als een 31.86 kDa band in de T O / N monster, maar niet T 0, en moet de enige band in de finale pure product. Om te testen of de MOG tag eiwit correct heeft gevouwen, kan de MOG tag eiwit worden gebruikt om MOG-eiwit specifieke B-celle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een protocol beschreven voor de productie van MOG tag eiwit en hoe zuiver MOG 1-125 van de MOG tag eiwit te genereren. Dit protocol is gebaseerd op zowel standaard His-tag eiwitten zuiveringswerkwijzen, en een eerder beschreven protocol voor het genereren van een oudere MOG-eiwitten 15. Hoewel het hier niet wordt beschreven, het primaire gebruik van de MOG tag eiwit is om EAE te induceren door middel van immunisatie met eiwitantigeen. Een protocol bes...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is de ontvanger van de Waugh Family MS Society of Canada doctoraalstudentenprijs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labDeze bacteriën zijn nodig om het MOGtag-eiwit te maken. Glycerolvoorraden van deze bacteriën zijn op aanvraag beschikbaar.
LB bouillon millerBioshopLBL407.1
Ampicillinebio basicAB0028Reconstitueer het poeder tot 50% ethanol/ 50% H2O bij 100 mg/ml. Bewaren bij -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Reconstitueer het poeder in H2O bij 1M en bewaar bij -20 °C.
Kikker-ei lysozymBioshopLYS702.10Reconstitueer in H2O bij 50 mg/ml en bewaar bij -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Fosfaat gebufferde zoutoplossinglife technologies20012-027Commerciële fosfaat gebufferde zoutoplossing is niet vereist, elke standaard door het laboratorium gemaakte fosfaat gebufferde zoutoplossing is voldoende.
NatriumchlorideBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoolBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272De kwaliteit moet groter zijn dan 98% zuiverheid.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
Nikkel (II) sulfaatBioshopNIC700.500
His bind resinEMD Millipore69670-3Bewaar in 20% ethanol 80% H2O bij 4 °C
Anhydrisch ethanolCommercial AlcoholsP016EAANVerdun met water indien nodig.
Glacial azijnzuurBioshopACE222.1
Natriumacetaat trihydraatBioshopSAA305.500
runderserum albumine standaardbio-rad500-0206
Bio-rad eiwit assay kleurstof reagent concentreerbio-rad500-0006
Etheendiaminetetra-azijnzuur, dinatriumzout dihydraatFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysebuisThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlDit reagens mag niet buiten een afzuigingskast worden gehanteerd.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015Het produceren van uw eigen TEV protease kan worden gerealiseerd met (https://www.addgene.org/8827/) en gezuiverd zoals in referentie 17
Polyethyleenglycol 3350BioshopPEG335.1
polyethyleenglycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp platte bodem 96 welplaatebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Eon microplate spectrometerBiotek11-120-611Dit apparaat gebruikt de Gen5 dataanalysesoftware.
Gen5 dataanalysesoftwareBioTek
natriumdodecylsulfaatBioshopSDS001
bromofenolblauwBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Eiwitdesalting kolommenThermoscientific89849
GlycineBioshopGLN001
voorgevormde 12% polyacrylamide gelbio-rad456-1045
Snelle kleurstof reagentEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 Gebruikt samen met gel dock EZ imager voor coomassie blauwe vlekken
Eiwit ladderbio-rad1610375

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470(2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EiwitzuiveringNikkelharschromatografieDialysebuisconcentratieFlowcytometrie analyseB celactivatieEAE inductiemodelMOG tag eiwitStandaard laboratoriumapparatuur

Gerelateerde artikelen