Methodenartikel

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

DOI:

10.3791/54732

⸱

28 september 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erfelijke of de novo mutaties in kation-selectieve kanalen kunnen leiden tot plotselinge hartdood. Verandering in het plasmamembraantransport van deze multi-spanning transmembraaneiwitten, al dan niet met verandering in kanaalactivering, wordt vaak verondersteld om aanzienlijk bij te dragen aan dit proces. Het is daarom van cruciaal belang geworden om een methode te ontwikkelen om de verandering in de relatieve celoppervlakte-expressie van cardiale ionkanalen op grote schaal te kwantificeren. Hierin wordt een gedetailleerd protocol gegeven om de relatieve totale en celoppervlakte-expressie van cardiale L-type calciumkanalen CaV1.2 en membraan-geassocieerde subeenheden in tsA-201 cellen te bepalen met behulp van tweekleurige fluorescente cytometrie-assays. In vergelijking met andere microscopie-gebaseerde of immunoblotting-gebaseerde kwalitatieve methoden, zijn flowcytometrie-experimenten snel, reproduceerbaar en grootvolume-assays die kwantificeerbare eindpunten leveren op grote monsters van levende cellen (variërend van 104 tot 106 cellen) met vergelijkbare cellulaire kenmerken in een enkele flow. Constructies werden ontworpen om constitutief mCherry te expresseren aan het intracellulaire C-uiteinde (waardoor een snelle beoordeling van de totale eiwitexpressie mogelijk is) en om een extracellulair georiënteerd hemagglutinine (HA)-epitoop tot expressie te brengen om de celoppervlakte-expressie van membraaneiwitten te schatten met behulp van een anti-HA-geconjugeerd fluorescentieantilichaam. Om valse negatieven te voorkomen, werden experimenten ook uitgevoerd in gepermeabiliseerde cellen om de toegankelijkheid en juiste expressie van het HA-epitoop te bevestigen. De gedetailleerde procedure omvat: (1) ontwerp van getagde DNA (deoxyribonucleïnezuur) constructies, (2) lipide-gemedieerde transfectie van constructies in tsA-201 cellen, (3) cultivatie, oogst en kleuring van niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen, en (4) verwerving en analyse van fluorescente signalen. Bovendien worden de basisprincipes van flowcytometrie uitgelegd en wordt het experimentele ontwerp, inclusief de keuze van fluoroforen, titratie van het HA-antilichaam en controle-experimenten, grondig besproken. Deze specifieke aanpak biedt objectieve relatieve kwantificering van de totale en celoppervlakte-expressie van ionkanalen die kan worden uitgebreid om ionpompen en plasmamembraantransporters te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel geeft een betrouwbare test om de relatieve expressie van celoppervlak membraaneiwitten zoals ionenkanalen tot expressie gebracht in recombinante cellen met de aanwezige flowcytometrie techniek melden. Ionenkanalen porie-vormende membraaneiwitten die verantwoordelijk zijn voor het regelen van elektrische signalen door het poorten van de stroming van ionen door de celmembraan. Zij worden ingedeeld door de activatie mechanisme, natuur, en de selectiviteit van de ion soorten op doorreis in de poriën waar ze worden gelokaliseerd. Op cellulair en weefsel niveaus, de macroscopische ion fluxen door middel van ion kanalen zijn het product van biofysische (gating en permeatie), biochemische (fosforylering), en biogenese (synthese, glycosylering, mensenhandel en afbraak) eigenschappen 1. Elk van deze processen is uniek voor elk type ionenkanalen en is geoptimaliseerd om de fysiologische rol van het ionkanaal voldoen. Derhalve veranderingen in elk van deze verfijnde 'via deerfelijke of door genetische modificatie, vaak aangeduid als "channelopathy", kan schadelijk celhomeostase zijn. Het is belangrijk te benadrukken dat het leveren van de "juiste" hoeveelheid ionenkanalen aan het celoppervlak is essentieel voor celhomeostase. Zelfs kleine stijgingen (gain-of-functie) en kleine dalingen (verlies-van-functie) in ionkanaal activiteit hebben de potentie om een ​​ernstige pathologie over een leven leiden. Defecten in het celoppervlak levering van rijpe ionkanalen is een belangrijke determinant in talrijke kanalopathieën, zoals cystische fibrose (CFTR ionkanaal) 2 en hartritmestoornissen van het lange QT syndroom vorm (cardiale kaliumkanalen) 3.

Kanalopathieën worden geassocieerd met cardiale plotselinge dood 4. De huidige wereldwijde prevalentie van alle cardiale kanalopathieën wordt gedacht dat minstens 1 te zijn: 2,000-1: 3000 per persoon 5 en zijn verantwoordelijk voor ongeveer de helft van een plotselinge aritmische hartdood cases 6. Disfunctie bij cardiale spanningsafhankelijke natrium-, kalium-, calcium- en selectieve ionenkanalen zijn bekend een belangrijke rol spelen in dit proces. De L-type Ca V 1.2-voltage-gated calcium kanaal is vereist om gesynchroniseerd hartspier contractie te starten. De cardiale L-type Ca 1,2 V kanaal is een multi-subeenheid proteïne complex samengesteld uit het porievormende Ca V α1 subeenheid en Ca Vss en Ca V α2δ1 aanvullende subeenheden 7-12. Merk op dat de volledige set van hulp- subeenheden vereist om functionele Ca V 1,2 kanalen in het plasmamembraan en dynamische interacties veroorzaken tussen deze subeenheden zijn essentieel voor de normale elektrische functie van het hart 13 te ondersteunen. Ca V ß bevordert het celoppervlak expressie van ca 1,2 V kanalen via een niet-covalente hydrofobe interactie nanomolair 14. Co-expressie van de Ca V α2δ1 subunit with Ca V ß-gebonden Ca V α1 stimuleert piekstroom uitdrukking (5 tot 10-voudig) en bevordert kanaal activering op meer negatieve spanningen. Gain-of-function mutaties van het porievormende subeenheid Ca V 1,2 zijn geassocieerd met een vorm van ventriculaire aritmieën genoemd het lange QT syndroom 15 dat samen met puntmutaties in de drie subeenheden die het L-type Ca V 1,2 kanaal geïdentificeerd in individuen die lijden aan aritmieën van de korte QT syndroom vorm 16,17. Ion kanalen zijn membraaneiwitten die kunnen worden onderzocht vanuit een biochemisch perspectief (eiwit chemie) of met behulp van elektrofysiologische instrumenten (huidige genererende machines) en vaak met behulp van deze complementaire aanpak. Elektrofysiologie, met name whole-cell patch-klemming, is een geschikte benadering voor de functie van ionkanalen 15 verhelderen maar kan niet wijzigingen in proteïne transport lossen van veranderingen in hun biofysischeeigenschappen. Eiwitchemie is echter vaak beperkt gebruik door de relatief lage expressie van grote membraaneiwitten opzichte van kleinere oplosbare eiwitten. Robuuste high-throughput methoden met behulp van fluorescentie uitlezing moeten worden ontwikkeld om specifiek ingegaan op gebreken in eiwitten biogenese veroorzaken van veranderingen in het celoppervlak expressie van ionkanalen.

Flowcytometrie is een biofysische technologie gebruikt in cel tellen, sorteren, biomarker opsporing en protein engineering 18. Wanneer een monsteroplossing van levende cellen of deeltjes cytometer in een stroom wordt geïnjecteerd, worden de cellen gerangschikt in een enkele stroom die kan worden gesondeerd door de machine detectiesysteem (figuur 1). De eerste stromingscytometer akte in 1956 19 gedetecteerd slechts één parameter maar modern flowcytometers meerdere lasers en fluorescentiedetectoren dat de detectie van meer dan 30 fluorescerende 20,21 parameters mogelijk.Filters en spiegels (emissie optiek) richt de lichtverstrooiing of TL-licht van cellen aan een elektronisch netwerk (fotodiode en detectoren), die het licht proportioneel om te zetten in de intensiteit ervan. Digitale gegevens worden geanalyseerd met gespecialiseerde software en de eerste uitgang wordt weergegeven als puntenplot 21.

figure-introduction-1
Figuur 1:. Biofysische principes flowcytometrie sorteren Single cellen worden geduwd door een sproeier onder hoge druk in een stroom omhullingfluïdum die hen beweegt op een of meerdere laser afvraagpunten. De lichtbundel wordt afgebogen door de passerende cellen en verzameld in de voorwaartse richting (Forward Scatter, FCS) licht naar een fotodiode die het licht omzet in een signaal evenredig aan de grootte van de cel. Het licht wordt ook verzameld op een 90 ° hoek met de laser pad en naar detectors (ook wel fotomultipliers (PMT)).Dit licht wordt via dichroïsche spiegels die de detectie van het signaal zijwaartse verstrooiing (SSC), die de korreligheid in de cellen weerspiegelt mogelijk, en de fluorescente emissie als opgewonden fluorochromen in de cel aanwezig zijn. Drie detectoren (groen, geel en rood) worden weergegeven met verschillende golflengte banddoorlaatfilters, waardoor de gelijktijdige detectie van verschillende fluorochromen. De verschillende signalen worden gedigitaliseerd door een externe computer en omgezet in gegevens die worden geanalyseerd om de eigenschappen van de cellen te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.

De high-throughput capaciteit van flowcytometers werd benut om de relatieve membraan expressie van recombinant wild-type en de handel-deficiënte voltage-gated L-type Ca V 1.2 kanalen en bijbehorende subeenheden in levende cellen te kwantificeren. cDNA constructen coding voor de eiwitten werden dubbel gelabeld om gelijktijdig een extracellulair niet fluorescerende epitoop die door een ondoordringbare fluorescerend geconjugeerd antilichaam en een intracellulair fluorofoor die constitutief fluorescerende kan worden gedetecteerd. Zowel de extracellulaire epitoop, een extracellulaire lus van het eiwit geplaatst, en de intracellulaire fluorofoor, ingevoegd na de C-terminus, worden omgezet met het eiwit. In deze reeks experimenten werd het Ca V α2δ1 eiwit ontworpen om een extracellulaire hemagglutinine (HA) epitoop (YPYDVPDYA) gedetecteerd door een ondoordringbare FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) expressie geconjugeerd anti-HA en mCherry de intrinsieke intracellulaire fluorofoor. De relatieve celoppervlak expressie van het mCherry-Ca V α2δ1 HA-gemerkt eiwit te bepalen, werden recombinante cellen die het fusie-eiwit na transfectie geoogst en gekleurd met FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA-epitooplabel Antibody (figuur 2). FITC is een organische fluorescente verbinding die aanzienlijk kleiner is dan enzym verslaggevers en dus niet zoveel kans om te interfereren met de biologische functie. mCherry- Ca V α2δ1 HA-overexpressie in TSA-201cells, levert aanzienlijk 3-log toename van de FITC fluorescentie en fluorescentie mCherry twee-dimensionale plots 22. Aangezien de HA epitoop in het extracellulaire deel van het eiwit, de fluorescentie-intensiteit van FITC verkregen in aanwezigheid van intacte cellen weerspiegelen de relatieve index van het celoppervlak expressie van HA-gemerkt eiwit. De toegankelijkheid van de HA epitoop in de constructen systematisch gevalideerd door het FITC signaal nadat cel permeabilisatie. Deze maatregel dient ook om de genormaliseerde totale eiwitexpressie bevestigen aangezien de relatieve fluorescentie intensiteiten voor FITC in gepermeabiliseerde cellen geschat zijn kwalitatief vergelijkbaar met de relatieve fluorescentiewaarden for mCherry gemeten onder permeabel en non-gepermeabiliseerde voorwaarden 22,23. Het is belangrijk op te merken dat de intrinsieke fluorescentie spectrum wordt verschoven naar hogere waarden na permeabilisatie maar dat de enige waarde wordt gerapporteerd is de verandering in fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de controle construct. Relatieve veranderingen in de fluorescentie-intensiteit voor de test constructen worden geschat aan de hand van de ΔMean Fluorescence Intensity (ΔMFI) waarden voor elke fluorofoor (mCherry of FITC). Experimenten zijn ontworpen om de fluorescentie-intensiteit van de testconstruct opzichte van de fluorescentie-intensiteit van de controle construct tot expressie gebracht onder dezelfde omstandigheden gemeten experimentele variaties beperken de intrinsieke fluorescentie van het fluorofoor-geconjugeerde antilichaam. Twee membraaneiwitten met succes onderzocht met behulp van deze test: de porie vormende subeenheid van het L-type spanningsafhankelijke Ca calciumkanaal V 1,2 14,22 en een andere reeksexperimenten, de extracellulaire extra Ca V α2δ1 subunit 22,23. Het volgende protocol werd toegepast om de celoppervlak expressie van het Ca V α2δ1 subunit van het cardiale L-type Ca 1,2 V kanaal onder controle omstandigheden en na mutaties die de posttranslationele modificatie van het ionkanaal te bepalen. Onder gestandaardiseerde experimentele omstandigheden het celoppervlak fluorescentie van FITC verhoogt quasi-lineair met de expressie van cDNA dat codeert voor mCherry-Ca V α2δ1 HA-eiwitten (figuur 5 van referentie 22).

figure-introduction-2
Figuur 2:. Schematische weergave van de totale en het membraan etikettering in de flowcytometrie experimentele protocol De regeling schetst enkele van de belangrijkste stappen die nodig zijn om de relatieve totale en celoppervlak expressie van recombinante ionkanalen door fl kwantificerenow cytometrie. Cellen worden getransfecteerd met de twee merktekens constructie mCherry-Ca V α2δ1-HA in TSA-201 cellen (1) en gekleurd voor of na permeabilisatie (2). Multiparameter gegevens worden verkregen in een flowcytometer (3) voor multivariate analyse (4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dubbel Tagged DNA-constructen

  1. Plaats het HA-epitoop (YPYDVPDYA) in de linker van extracellulair Ca V α2δ1 tussen D676 en R677 door plaatsgerichte mutagenese (figuur 3B) 20. Gebruik Forward primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC en Reverse primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Subkloneren van het cDNA-sequentie van het gelabelde HA Ca V α2δ1 in het zoogdier pmCherry N1-expressievector ontworpen om het eiwit gefuseerd aan de N-terminus van mCherry tussen de SacI en SalI plaatsen (Figuur 3B) 20 tot expressie.
    LET OP: Passende kanaal functie moet worden getest met de controle construct met behulp van standaard elektrofysiologische methoden 24.

2.-liposoom-gemedieerde transiënte transfectie (30 min, Alle stappen worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap)

  1. Dag 1: Plate een half miljoen van de TSA-201 cellen (of HEKT) in35 mm kweekschalen met 2 ml Dulbecco's hoog glucosegehalte minimaal essentieel medium (DMEM-HG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS) kweekmedium. Aantal cellen met een standaard hemacytometer. Beoordelen cellevensvatbaarheid uit een fractie van het celmonster met behulp trypan blauw. Plaat genoeg cellen tot 90% confluentie bereiken op het moment van transfectie.
  2. Dag 2: Change kweekmedium met 2 ml verse voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium zonder PS.
  3. Voor elke transfectie monster, twee 1,5 ml buizen. In buis 1 verdunnen 4 ug DNA in 250 ui gereduceerd serum medium. In buis 2, meng 10 pl van het liposoom-gemedieerde transfectie reagens met 250 pl serum-gereduceerde kweekmedium. Meng voorzichtig de transfectiereagens voor gebruik.
  4. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Combineer de inhoud van de buis 1 en de buis 2, meng voorzichtig en incubeer ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Voeg de liposomen / DNEen complexen aan de gekweekte cellen en schud de cultuur schotel te mengen.
  7. Incubeer bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer gedurende 24 uur.

3. kleuring van cellen voor flowcytometrie (3 uur)

  1. Het voorbereiden van de Cel Samples
    1. Dag 3: Verwijder medium uit de kweekschaal voorzichtig en was de cellen met 400 ul voorverwarmde (37 ° C) 0,05% trypsine-EDTA 1x (ethyleendiaminetetra-azijnzuur).
    2. Voeg 400 ul trypsine-EDTA en incubeer de schaal bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer gedurende 5 minuten om cellen los te maken van de schaal.
    3. Stop de enzymdigestie door het toevoegen van 1 ml koud kweekmedium zonder PS en was alles uit de cellen van het oppervlak door pipetteren voorzichtig 4-5 keer. Vermijd over-spijsvertering en over-pipetteren om celdood te verminderen.
    4. Verzamel cellen in 1,5 ml buizen en plaats onmiddellijk op ijs. Gebruik ijskoude oplossingen en houd de cellen bij 4 ° C om de internalisatie voorkomenvan oppervlakte-antigenen. Verlaag verlichting fotobleken van het fluorescentiesignaal beperken.
    5. Centrifugebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig aspireren en gooi de supernatant.
    6. Resuspendeer de pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing 1x (PBS) om een ​​enkele celsuspensie te bereiden.
    7. Kort vortex de buizen heel voorzichtig en herhaal de stappen 3.1.5 en 3.1.6 aan kweekmedium volledig te verwijderen.
    8. Resuspendeer de pellet in 600 pi 1X PBS en stel de celconcentratie een minimum van 3 x 10 6 cellen / ml.
    9. Verdeel de cellen in twee nieuwe 1,5 ml buizen voor extracellulaire en intracellulaire kleuring. Onder meer passende controles om specifieke kleuring van niet-specifieke kleuring discrimineren.
      NB: De isotypecontroleantilichaam helpt bij de beoordeling van het niveau van de achtergrond kleuring en idealiter overeenkomen met elke primaire antilichaam de talrijke soorten, isotype en fluorofoor. Met isotype controle en geconjugeerd antilichaam tegelijkertijdeiwitconcentratie.

figure-protocol-1
Tabel 1: Flow-cytometrie experimenten controlemonsters voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen Elk experiment moet de volgende negatieve controles omvatten:. (1) niet-getransfecteerde cellen (zonder antilichaam met de isotype of het geconjugeerde antilichaam). (2) Getransfecteerde cellen met het eiwit van belang gesubkloneerd in een plasmide zonder constitutieve intracellulaire fluorescente fluorochroom (pCMV- Ca V α2δ1-HA) of met dubbel gelabelde constructie (pmCherry-Ca V α2δ1 en geïncubeerd zonder antilichaam met de isotype of het geconjugeerde antilichaam). Enkele kleur controles worden gebruikt voor de vergoeding van fluorochroom emissie overlap. Dezelfde controles worden uitgevoerd voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerd omstandigheden in elke reeks experimenten.

  1. Celoppervlak kleuring van Intactlevende cellen
    1. Aliquot 1 x 10 6 cellen / 100 ul in 1,5 ml buizen.
    2. Voeg de FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA antilichaam bij 5 ug / ml en vortex vóór incuberen van de cellen op een rocker platform (200 rpm) in het donker bij 4 ° C gedurende 45 minuten.
      OPMERKING: De optimale antilichaamconcentratie werd bepaald voorafgaande titratie-experimenten (Figuur 4).
    3. Verwijder de cellen van het donker en voeg 900 pl 1x PBS / buis. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    4. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml 1x PBS, vortex en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    5. Herhaal de wasbeurt (stap 3.2.4) twee keer om eventuele niet-gebonden antilichaam te verwijderen. Als een niet-geconjugeerd primair antilichaam gebruikt, geïncubeerd met het geschikte secundaire antilichaam.
    6. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 500 pi 1X PBS en breng de enkele celsuspensie in 5 ml flowcytometrie buizen. Houd de cels in het donker bij 4 ° C totdat het monster loopt.
    7. Run de monsters op een flowcytometer. Voor het beste resultaat, het analyseren van de cellen op de flowcytometer zo spoedig mogelijk en uiterlijk 24 uur na.
  2. Intracellulaire kleuring: Fixatie, Permeabilisatie en kleuring
    1. Aliquot 1 x 10 6 cellen / 100 ul in 1,5 ml en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    2. Gooi supernatant en resuspendeer cellen in 100 ul van fixatie-permeabilisatie oplossing direct uit voorraad leverbaar.
    3. Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 20 min.
    4. Voeg 100 ul van vers bereide 1x permeabilisatie-wasbuffer (10x verdunnen permeabilisatie-wasbuffer in gedestilleerd H 2 O). Vortex en sediment cellen met een tafel centrifuge bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    5. Zuig en gooi de supernatant.
    6. Herhaal stap 3.3.4 en 3.3.5.
    7. Add FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA antilichaam bij 5gg / ml in 100 gl van 1x permeabilisatie-wasbuffer en, vortex voor cellen te incuberen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De intracellulaire kleuring wordt uitgevoerd volgens dezelfde procedure als die welke voor het celoppervlak kleuring. Saponine-gemedieerde permeabilisatie is echter een snel reversibel proces, dus is het belangrijk om 1x PBS vervangen 1x Perm / Wash buffer om de cellen in de voortdurende aanwezigheid van saponine tijdens intracellulaire kleuring houden.
    8. Verwijder de cellen van het donker en voeg 100 ul permeabilisatie-wasbuffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    9. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 pl permeabilisatie-wasbuffer, vortex en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    10. Herhaal de wasbeurt (stap 3.3.9) nog een keer om eventuele niet-gebonden antilichaam te verwijderen.
    11. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 500 pi 1X PBS en breng de zondegle celsuspensie tot 5 ml flowcytometrie buizen. Houd de cellen in het donker bij 4 ° C totdat het injecteren van het monster in de flowcytometer.
    12. Run de monsters op een flowcytometer. Voer de vaste monsters op de cytometer zo spoedig mogelijk, doch uiterlijk binnen 1 week na de kleuring. Run de niet- gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen op dezelfde dag.

4. Flowcytometrie

  1. Flowcytometer Cell Sorter Daily Setup
    1. Schakel de flowcytometrie software. Voorafgaand aan het experimenteren, kalibreren en het instellen van de flowcytometer cel sorter om optimale prestaties te garanderen instrument (dwz laser en optica presteren op specificatie, de laser en de stroom cel goed zijn uitgelijnd) met behulp van instrument setup kralen.
    2. Gebruik de 100 micrometer mondstuk met 20 psi schede druk.
      Opmerking: Het mondstuk hoeft niet te worden gewijzigd op een bank flowcytometer.
    3. Stel de cytometer debiet volgens de fabrikantener specificatie. Buitengewoon hoge stroomsnelheden zullen gevoeligheid bij de detectie van veranderingen in fluorescentie verlagen.
    4. Selecteer blauw (488 nm te prikkelen fluoresceïne Isothiocayanate of FITC) en geel-groen (561 nm tot mCherry prikkelen) lasers. Verzamel FITC en mCherry fluorescentie niveaus met een 530/30 nm en met een 610/20 nm banddoorlaatfilter respectievelijk.
    5. Verwerven van de voorwaartse verstrooiing (FCS) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) dot plot voor ongekleurde cellen met behulp van lineaire schaal. Pas versterking elke detector om cellen te visualiseren in de linker kwadrant van de dot plot.
  2. Monster lezen van Intact Non-gepermeabiliseerde cellen
    1. Stel de P1gate voor levende niet-gepermeabiliseerde cellen door het afbakenen van een vrije vorm rond de cellen te analyseren uitzondering celafval en celaggregaten, aldus vermindert het fluorescentiesignaal op intacte cellen.
      LET OP: Leef / dead uitsluiting kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de poort plaatsing op levende cellen te vergemakkelijken. Stel 10.000 events op te nemenin het stoppen poort P1. Zet dit op een hoger aantal events als dat nodig is.
    2. Verwerven mCherry versus FITC twee-parameter contour plot met de uitgangswaarde autofluorescentie van ongekleurde cellen op te sporen. Gebruik bi-logaritmische schaal om negatieve waarden tonen en het verbeteren van de resolutie tussen populaties 25. Stel voltage elke detector om de ongekleurde negatieve cellen te midden van het onderste gedeelte van de eerste tien eenheden van de log fluorescentie-intensiteit plots.
    3. Acquire alle intact niet-gepermeabiliseerde monsters met behulp van in 4.1.5 en 4.1.6 gevestigde instellingen en het verzamelen van FSC, SSC en signalen in de fluorescentie detectoren.
    4. Exporteren en opslaan * .fcs bestanden te gebruiken voor analyse met flowcytometrie analyse software.
  3. Monster lezen van gepermeabiliseerde cellen
    1. Beweeg de P1 poort naar levende cellen in de gepermeabiliseerde monsters te selecteren en aan te passen FSC en SSC spanning als aangegeven in 4.1.5 en 4.1.6.
    2. Acquire alle gepermeabiliseerd monsters en het verzamelen van FSC, SSC eennd signalen in de fluorescentie detectors.
    3. Exporteren en opslaan * .fcs bestanden te gebruiken voor analyse met flowcytometrie analyse software.
  4. Gegevensanalyse
    1. Start de flowcytometrie analyse software en importeren * .fcs bestanden die zijn opgeslagen in 4.2.4 en 4.3.3.
    2. Klik op het eerste monster in de werkruimte venster weergegeven. Een nieuw venster vernoemd naar de buis ID-nummer wordt automatisch geopend. Start het gating proces in de plot van SSC versus FSC. Teken een poort (P1) met behulp van het pictogram Ellipse rond levende cellen en elimineren van alle vuil, dode cellen, of aggregaten die verschillende voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing dan levende cellen hebben
    3. Om de twee-parameter contour plot van de mCherry (y-as) versus FITC (x-as) fluorescentie-intensiteit van de levende cellen te tekenen, klikt u eerst op de x-as en kies de FITC-A kanaal en klik dan op de y -as en kies de PE-mCherry-A-kanaal. Klik op het icoon "Quad" om het kwadrant markering te plaatsen aan de rand van eenutofluorescent cellen in elk kanaal fluorescentie.
      LET OP: De rondom het FITC en mCherry positieve cellen poort is de P2 poort. De fluorescentie negatieve celpopulatie wordt aangeduid als de P3 gate. Zie figuur 5 voor de representatieve gating methode die wordt gebruikt in dit artikel.
    4. Selecteer P2 en P3 poorten en klik op het icoontje "Statistieken Add" in de oorspronkelijke workspace venster. Klik op "Count" (aantal positieve cellen) en klik op "Mean" (gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke fluorochroom) of "Median" (mediaan fluorescentie-intensiteit van elk fluorochroom) statistieken in de lijst met opties. Klik op het icoon "Statistieken toevoegen" weer. Al deze waarden worden automatisch overgezet naar de oorspronkelijke workspace venster.
      LET OP: De "Mean" wordt alleen gebruikt als de fluorescentie-intensiteit volgt een normale verdeling. In alle andere gevallen, klikt u op het tabblad "Median". MFI dus kan verwijzen naar gemiddelde fluorescentie Intensity of Median Fluorescence Intensity.
      OPMERKING: De volgende stap is om parameters en statistieken de poorten 'voor alle monsters gesondeerd door cytometer.
    5. In de werkruimte venster met de muis te slepen en neerzetten van de poorten en statistieken parameters op de lijn gemarkeerd alle monsters.
    6. Genereer een batchrapport tweedimensionale contour plots (mCherry vs FITC) en histogrammen (celtelling versus fluorescentie-intensiteit) voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen (Figuren 6A - B).
    7. Uit de gegenereerde in stap 4.4.4 statistieken, berekent het gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke fluorochroom voor de gekleurde cellen. Uit deze waarde af te trekken van de MFI-waarde bij ongekleurde cellen aan het oppervlak en de totale expressie van het eiwit van belang te kwantificeren.
    8. Rapporteer de ΔMFI waarden voor elke fluorofoor (mCherry en FITC) (Figuur 6C - D). Normaliseren van de ΔMFI gemeten voor de Ca V α2δ1 mutanten construeren ΔMFI de waarde verkregen voor FITC en mCherry de WT construct.
      OPMERKING: De absolute waarde van de fluorescentie-intensiteit sterk kunnen variëren afhankelijk van de partij antilichamen en de technische mogelijkheden van elke laboratoriumarbeider, vandaar de noodzaak om de fluorescentie-intensiteit van de mutant construct met de WT construct normaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een betrouwbaar protocol totale en celoppervlak van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201cells kwantificeren door een tweekleurige flowcytometrie-assay. Als voorbeeld, de relatieve celoppervlak totale eiwitexpressie werd berekend om Ca V α2δ1subunit. Om de tweekleurige flowcytometrie analyse uit te voeren, werd Ca V α2δ1 dubbel gelabeld aan een extracellulaire niet-fluorescerende HA epitoop dat door een anti-HA FITC-geconj...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit flowcytometrie gebaseerde bepaling werd met succes toegepast op de meting van de relatieve totale en celoppervlak niveaus van fluorescentie-gemerkt porie-vormende en geassocieerde subeenheden van spanningsafhankelijke calciumkanalen 14,22,26. Het is het beste gebruikt bij het onderzoek naar de effecten van genetische mutaties en vereist dus dat de intrinsieke fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-gemerkt gelabeld wildtype construct ten minste 10 tot 100 maal groter dan de fluorescentie-intensitei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de heer Serge SénÉchal en Dr. Jacques Thibodeau voor het delen van hun expertise en ons toegang verlenen tot hun flowcytometrie- en celsorteerplatform. Dit werk werd voltooid met de operationele subsidie 130256 van de Canadian Institutes of Health Research, een subsidie van de Canadian Heart and Stroke Foundation en ondersteuning van de "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" aan L.P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Q5 Site-Directed Mutagenesis KitNew England BiolabsE0554SKan worden vervangen door QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 mlSarstedt72-690-001
Tubes 15 ml Sarstedt 62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets VWR160001-192 
100 mm culture dishCorning430167Voor standaardkweek van HEKT-cellen.
35 mm culture dishFalcon353001Voor standaardkweek van HEKT-cellen.
Serologische pipette 1 mlSarstedt86.1251.001
Serologische pipette 5 mlSarstedt86.1253.001
Serologische pipette 10 mlSarstedt86.1254.001
Serologische pipette 25 mlSarstedt86.1285.001
Dulbecco's high-glucose mediumLife Technologies12100-046Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik.
Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, hitte-inactiveerd, US-oorsprongLife Technologies16140-071
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122
Lipofectamine 2000 Life Technologies11668-019Voor liposomale transfectie. Kan worden vervangen door calciumfosfaat transfectie.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik.
Trypsin-EDTA (1x) 0,05%, phenol roodLife Technologies25300-062
1.5 ml microtubesSarstedt72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1xFisherBP661-10Kan worden "zelfgemaakt".
Anti-HA FITC geconjugeerd antilichaamSigmaH7411
IgG1−FITC Isotype Control antilichaamSigmaF6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilisatie Solution KitBD Biosciences554714Fixatie/Permeabilisatie. Permeabilisatie/Wash oplossing, bewaar bij 4 °C.
HemacytometerFisher49105161
Trypan BlauwFisher15250061Om de celviabiliteit te beoordelen.
Gekoelde Microcentrifuge, 5430REppendorf A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorFisher370
Laboratory Platform RockerFisher545034
Water BathVWR89032-216
BD FACSARIA III BD Biosciences648282Flow cytometer.
FlowJo Software v10FlowJoFlowJo v10 DongleVoor gegevensanalyse.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982(2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cell Surface ExpressionTotal Protein ExpressionFluorescent Antibody StainingDNA TransfectiontsA 201 CellsmCherry TaggingHA Epitope DetectionPermeabilized CellsNon Permeabilized Cells

Gerelateerde artikelen