Methodenartikel

Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

25.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54741

⸱

25 november 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het filtreren van watermonsters met een filtercartridge en het extraheren van omgevings-DNA (eDNA) zonder dat het behuizing hoef te worden geopend om de filter te verwijderen. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Samenvatting

Recente studies toonden aan dat het gebruik van omgevings-DNA (eDNA) van vissen geschikt is als niet-invasieve monitoringtool. De meeste van deze studies gebruikten schijfvezelfilters om eDNA uit watermonsters te verzamelen, hoewel een aantal microbiële studies in aquatische omgevingen filterpatronen hebben gebruikt, omdat de patroon het voordeel heeft dat deze grote watervolumes kan opnemen en over het algemeen gemakkelijk te gebruiken is. Hier bieden we een protocol voor het filtreren van watermonsters met behulp van de filterpatroon en het extraheren van eDNA uit de filter zonder dat het huis hoef te worden opengesneden. De belangrijkste onderdelen van dit protocol bestaan uit 1) het filteren van watermonsters (watervolumes ≤4 L of >4 L); (2) extractie van DNA op de filter met behulp van een rolschudder geplaatst in een voorverwarmde incubator; en (3) zuivering van DNA met behulp van een commercieel kit. Met het gebruik van dit en eerder gebruikte protocollen, voeren we metabarcoding-analyse uit van eDNA genomen uit een enorm aquarium (7.500 m3) met bekende soortensamenstelling, en tonen het aantal gedetecteerde soorten per bibliotheek van de twee protocollen als de representatieve resultaten. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Inleiding

Environmental DNA (eDNA) in het aquatisch milieu verwijst naar genetisch materiaal gevonden in de waterkolom. Recente studies toonden het nut van eDNA voor het detecteren van vissen uit verschillende aquatische milieus, zoals vijvers 1-3, 4-8 rivieren, beken 9 en zeewater 10-14. De meeste van deze studies gericht op de detectie van een enkele of een paar invasieve 1,4-6,8,14 en zeldzame of bedreigde diersoorten 3,9, terwijl sommige recente studies geprobeerd simultane detectie van meerdere soorten in lokale vis gemeenschappen 7,9, 12,13,15 en mesokosmossen 11,12.

De laatste benadering wordt genoemd "metabarcoding" en eDNA metabarcoding maakt gebruik van één of meerdere sets van PCR-primers aan een gen regio coamplify over taxonomisch diverse monsters. Daarna volgt bibliotheek preparaat met indexering en toevoeging adapter en de geïndexeerde bibliotheken geanalyseerd door high-throughput parallel sequencingplatform. Onlangs Miya et al. 12 ontwikkelde universele PCR primers voor metabarcoding eDNA van vissen (genaamd "MiFish"). De MiFish primers richten op een hypervariabel gebied van het mitochondriale 12S rRNA-gen (163-185 bp), die voldoende informatie bevat om vissen te identificeren taxonomische familie, geslacht en soort met uitzondering van enkele nauw verwante soortgenoten. Met het gebruik van deze primers in eDNA metabarcoding, Miya et al. 12 ontdekt meer dan 230 subtropische mariene soorten van aquarium tanks met bekende soortensamenstelling en koraalriffen in de buurt van het aquarium.

Terwijl het optimaliseren van de metabarcoding protocol natuurlijk zeewater tegemoet met verschillende niveaus van eDNA concentratie van vissen, hebben we gemerkt dat de MiFish primers af en toe niet in geslaagd om het doelgebied voor de latere uitwerking bibliotheek te versterken. Een van de meest voorkomende reden hiervoor mislukte PCR amplificatie gebrek aan voldoende hoeveelheden van de template DNA in kleine hoeveelheden water gefilterd (dwz 1-2 L). Hoewel eDNA concentratie van een bepaalde taxonomische groep onkenbaar is voor de versterking, filtratie van grote volumes water (> 1-2 L) zou een eenvoudige en effectieve manier om meer eDNA te halen op het aquatisch milieu met schaarse vis overvloed en biomassa, zoals open oceaan en de diepzee-ecosystemen.

Ten opzichte schijf vezelfilters gewoonlijk in een aantal vissen eDNA onderzoek 16, filterpatronen het voordeel opvang grotere waterhoeveelheden voor verstopping 17. Eigenlijk, een recente studie toonde groot volume (> 20 L) filtratie van de kust zeewater monsters met behulp van filter cartridges 18. Bovendien worden zij afzonderlijk verpakt en steriel en verschillende stappen van de experimentele workflow kan worden uitgevoerd in het filterhuis, waardoor de kans op besmetting door het laboratorium 19 verminderen. Het laatsteeigenschap is essentieel voor eDNA metabarcoding, waarbij het risico van verontreiniging blijft een van de grootste uitdagingen experimentele 20,21. Ondanks deze technische voordelen van de filter cartridges, is deze nog niet gebruikt in eDNA studies van vissen met twee uitzonderingen 8,15.

Hier bieden we een protocol voor filtratie van watermonsters met het filterpatroon en extractie van eDNA uit de filter zonder opengesneden de behuizing. We bieden ook twee alternatieve waterfiltratie systemen afhankelijk van de waterstand volumes (≤4 L of> 4 L). Om de prestaties van de nieuw ontwikkelde protocol en een eerder gebruikte protocol met behulp van een glasvezel filter in onze onderzoeksgroep 12,14,22,23 vergelijken, we voeren eDNA metabarcoding analyse van zeewater uit een enorme aquarium tank (7.500 m 3 ) met bekende soortensamenstelling en tonen het aantal gedetecteerde species afgeleid van de twee protocollen als representatieve resultaten. Dit protocol hzoals ontwikkeld voor metabarcoding eDNA van vissen, maar ook voor eDNA uit andere organismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Dit protocol heeft geen betrekking op water bemonstering en metabarcoding methoden. Water kan worden bemonsterd op verschillende manieren, afhankelijk van studiedoeleinden 16 en zie Miya et al. 12 voor meer informatie over de metabarcoding methoden waarbij MiFish primers. Merk op dat het monster erg koud water moet worden behandeld en gefiltreerd binnen enkele uren tot afbraak van eDNA voorkomen. Merk ook op dat dit protocol omvat het gebruik van een roterende schudder en een incubator, en deze moet groot genoeg zijn om de vroegere tegemoet te komen. Bovendien, een centrifuge die is geschikt zowel 15 ml en 50 ml conische buizen onontbeerlijk om de resterende vloeistof uit het filter na filtratie te verwijderen en aan geëxtraheerde DNA in de patroon verzamelen, respectievelijk.

1. Het verwerken van een schroefdop en een 1 L Plastic Bag

OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume> 4 L.

  1. Boor een gat door het midden van een schroef cap (bevestigd aan een wegwerp 1 L plastic zak) met dezelfde diameter (4,8 mm) als de buis uitsteekt vanaf een mannelijke luer-lock connector. Diagonale tang inkorten buis van de mannelijke luer-lock connector op de juiste lengte (ca. 3 mm) om verstopping van een kleine hoeveelheid water in de dop na filtratie voorkomen.
  2. Breng een lijm gespecialiseerd voor polyethyleen (PE) en polypropyleen (PP), dat zowel de bodem en het oppervlak van het mannelijke Luer-vergrendelende verbindingsorgaan en schroefdop, respectievelijk. Wacht een paar minuten voor een goede verlijming (zie de instructies van de fabrikant).
  3. Steek de mannelijke luer-lock connector in het gat van de schroefdop. Wacht tot volledige verlijming van de twee delen (gewoonlijk> 24 uur). Steriliseren de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik.
  4. Punch twee gaten aan de beide onderste hoeken van de 1 L plastic zak om het hangen van een mesh paneel (stap 3). Zorgen dat de diameter van de gaten groter is dan die van de pinnen van de mazen.

2. Montage van de Filtration System

  1. Attach hoog vacuüm slang aan de ingang van een aanzuigpomp en maak het andere uiteinde van de slang tot een verdeelstuk. Zorg ervoor dat de drie rode t-kleppen van het spruitstuk in de "uit-stand" (dwz, horizontaal).
  2. Het dragen van een schone set handschoenen, plaatst een vrouwelijke luer fitting en een vacuum connector aan de boven- en ondereinden van het vacuüm rubber slang voor filtratie, respectievelijk.
  3. Bevestig zorgvuldig de vrouwelijke luer fitting met een uitlaatpoort van de filterpatroon en bevestig de vacuum connector aan een silicone stopper.

3. Filtratie van watermonsters (≤4 L) met behulp van de Filter Cartridge

OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume> 4 L. Deze filtratie-systeem vraagt ​​om een ​​op zichzelf staande panel fof opknoping de plastic zak gevuld met 1 liter water. Een mesh paneel, meerdere tanden en een standaard voor het panel, alle verkrijgbaar bij online winkels, zou nuttig zijn voor het samenstellen van dit toestel. Autoclaaf de inlaat en uitlaat Luer caps voor het filter voor gebruik.

  1. Giet de 1 L bemonsterde water in de plastic zak en sluit de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector.
  2. Sluit zorgvuldig een inlaatpoort van de samengestelde filterpatroon met de mannelijke luer-lock connector van de plastic tas. Niet te strak de luer-lock connector; anders wordt het toestel zal lekken zodra het pompen begint. Zorg ervoor dat alle aansluitingen goed vastzitten voordat opknoping de plastic zak uit een mesh panel.
  3. hang voorzichtig de plastic zak met de filter cartridge uit twee tanden op de mazen en plaats een silicone stopper in een inlaatpoort van het spruitstuk.
  4. Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het verdeelstuk tot de filterpatroon droog, tduivin draai de rode t-klep naar de stand uit.
  5. Herhaal 3,1-3,4 stappen totdat de gewenste hoeveelheid water wordt gefilterd.
    OPMERKING: voor 1 liter water uit de subtropische koraalriffen, het duurt ongeveer drie minuten voor de filtratie.
  6. Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector.
  7. Cap beide uiteinden van de cassette met de inlaat en uitlaat luer caps.
  8. Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling.
  9. Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie.

4. Filtratie van het Water (> 4 L) Monsters met behulp van de Filter Cartridge

Opmerking: Sla deze stap over als het water filtratie volume ≤4 L. filtratie-systeem vereist een 10 L boek fles voorzien van een klep en een wegwerp 10-ml pipet tip. Een binnendiameter van 10 ml pipetpunt (15,0 mm) en een tapsheid van de tipend moeten passen aan een buitendiameter van de klep (15,0 mm) en de inlaatpoort van de filterpatroon, respectievelijk. Beide aansluitingen goed vastgehouden tijdens het filtreren in een wrijvingspassing. Steriliseer de pipet tip met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik.

  1. Breng de gewenste hoeveelheid bemonsterde water in de fles boek. Nauw plaats de 10 ml pipet tip in de klep van 10 L boek fles.
  2. Nauw plaats de uitlaatpoort van de filterpatroon in de pipetpunt uiteinde en steek de silicone stopper in de inlaatpoort van het verdeelstuk. Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het spruitstuk tot de filter cartridge droog is, zet de rode t-klep naar de stand uit.
    NB: Voor 10 liter zeewater uit de subtropische buitenste koraalriffen, het duurt ongeveer 30-40 min voor de filtratie.
  3. Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector. Cap beideuiteinden van de cartridge met de inlaat en uitlaat luer caps. Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling. Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie.

5. Winning van eDNA van de Filter

NB: In de stappen 4 en 5, maken we gebruik van een commerciële kit, grotendeels naar aanleiding van een protocol voor "met kern bloed" die door de kit. Voor de eenvoud beschrijven we de procedure voor de behandeling van een individu cartridge. In de praktijk wordt aanbevolen verwerking 8 (of het maximum aantal centrifuge) of minder filters tegelijk.

  1. Verwarm een ​​incubator op 56 ° C.
  2. Bereid een 2,0 ml buis door het snijden van de scharnierende dop van de buis. Gooi de dop.
    OPMERKING: Deze buis wordt gebruikt als een verzamelbuis voor de resterende vloeistof in het filter.
  3. Verwijder de inlaat (NOT uitlaat) Luer-dop van de filter cartridge en plaats de inlaatpoort into de collectie buis. Goed af, een verbinding tussen de patroon en verzamelbuis met een zelfsluitende film.
  4. Plaats de samengevoegde eenheid in een centrifuge adapter voor een 15-ml conische buis. Centrifugeer de cartridge bij 5000 xg gedurende 1 min om de resterende vloeistof in het filter te verwijderen.
  5. Verwijder de collectie buis van de filter cartridge en gooi de buis. Re-cap de inlaatpoort van de patroon.
  6. Maak een mengsel van 20 pl proteïnase-K-oplossing, 220 ul PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, niet door de kit) en 200 gl buffer AL.
    LET OP: De filter cartridge biedt plaats aan maximaal vier keer de omvang van het mengsel (. Ca 1,8 ml).
  7. Verwijder de inlaat dop en voeg het mengsel (440 pi) in de filter cartridge met een pipet tip. Plaats de pipet volledig in de inlaatpoort zodat de pipetpunt is zichtbaar in de cassette juist boven het membraan.
  8. Re-cap de inlaatpoort en plaats het filter autocartridge op een roterende shaker.
  9. Plaats de roterende schudder in de voorverwarmde incubator bij 56 ° C en zet de schudder bij een snelheid van 20 rpm gedurende 20 min.
  10. Tijdens de incubatie, bereiden een nieuwe 2,0 ml buis, het etiket van de buis op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen en plaats deze in een 50 ml conische buis.
    OPMERKING: De eerste (2,0 ml) en tweede buizen (50 ml) worden gebruikt voor het verzamelen van het geëxtraheerde DNA en voor het vasthouden van de buis 2,0 ml, respectievelijk.
  11. Na de incubatie, verwijder de inlaat dop en plaats de inlaat (niet uitlaat) poort van de patroon in de buis 2,0 ml in de 50 ml conische buis. Sluit de 50 ml conische buis met een schroefdop.
  12. Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 5000 xg gedurende 1 min naar het geëxtraheerde DNA uit de patroon verzamelen. Verwijder de filter cartridge en de 2,0 ml buis met behulp van gesteriliseerde pincet en de dop op de buis. Gooi de filter cartridge.

6. Zuivering van geëxtraheerd DNA

LET OP: We elueren eDNA met 100 ui buffer AE in plaats van 200 ul in de handleiding van de commerciële kit.

  1. Voeg 200 gl ethanol (96-100%) voor het geëxtraheerde DNA in 2,0 ml-buis van de bovenstaande stap (ongeveer 440 ui) en meng door vortexen.
  2. Pipet het mengsel in een spinkolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 1 min. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  3. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 ul buffer AW1 en centrifugeer gedurende 1 min bij 5000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  4. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 pl buffer AW2 en centrifugeer gedurende 3 min bij 20.000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  5. Bereid een nieuwe 1,5 ml buis (niet door de kit) en label de buis met een geschikte waterdichte pen voor sneldrogende en niet smerend labeling. Transfer de spin kolom to de 1,5 ml buis.
  6. Elueer het DNA door het toevoegen van 100 pi buffer AE naar het midden van de spinkolom membraan. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min.
  7. Gooi de spin-kolom en de dop op de buis. Bewaar de gezuiverde DNA bij -20 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is technisch moeilijk te isoleren en te kwantificeren alleen vis eDNA van de geëxtraheerde massa eDNA, omdat de MiFish primers coamplify het doelgebied van een aantal niet-vis gewervelde dieren, zoals vogels en zoogdieren, met PCR-producten van dezelfde grootte (ca. 170 bp ) 12. In plaats van het kwantificeren van vis eDNA, voeren we MiFish metabarcoding analyse van eDNA uit een aquarium tank met bekende soortensamenstelling met de twee verschillende methoden van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In veel metabarcoding studies met behulp van milieu monsters zoals water en bodem, post-filtratie behandeling van de filter cartridge is over het algemeen als volgt 24,25: 1) opensnijden of kraken van de behuizing met handgereedschap (slang mes of een tang); 2) verwijdering van het filter uit de patroon; en 3) het snijden van de filter in kleine stukjes met een scheermesje voor DNA-extractie. Om dergelijke omslachtige en tijdrovende procedures die gevoelig zijn voor besmetting in het laboratorium zijn, hebben...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund als basisonderzoek door CREST van de Japan Science and Technology Agency (JST) en door subsidies van JSPS/MEXT KAKENHI (Nummer 26291083) en de Canon Foundation aan M.M. De financiers hadden geen rol in de ontwerpstudie, gegevensverzameling en -analyse, besluit om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mesh panelIris OhyamaMPP-3060-BE
Metal prongIris OhyamaMR12F
Stand for the mesh panelNo brand4184-9507beschikbaar bij Amazon Japan
1 L plastic bag with screw capYanagiDP16-TN1000
Male luer-lock connectorISIS11620
10 ml pipette tipEppendorf0030 000.765
10 L book bottle with valveAs One1-2169-01
Sterivex-HV filterMilliporeSVHVL10RCaangeduid als "filter cartridge" in het hele document en gebruikt in het protocol
Male luer fittingAs One1-7379-04
Female luer fittingAs One5-1043-14  
Inlet luer capISISVRMP6
Outlet luer capISISVRFP6
High vacuum tubingAs One6-590-01
Vacuum connectorAs One6-663-02
Silicone stopperAs One1-7650-07
ManifoldAs One2-258-01
Aspirator-GAS-1As One1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation KitMO BIO14600-50-NFaangeduid als "optioneel kit" in het document
Tabletop CentrifugeKubotaModel 4000Maximale snelheid 6.000 rpm
Fixed-angle rotorKubotaAT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tubeKubota055-1280
RNAlater Stabilization SolutionThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992aangeduid als "zelfklevende film"

Referenties

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868(2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316(2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520(2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732(2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786(2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161(2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

WaterfiltratieDNA extractiemetabarcoding analyserotatieschudderincubatorprotocolLuer connectorvacu mfiltratiesoortdetectie

Gerelateerde artikelen