Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Samenvatting

Een methode om eiwitdiffusie in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) wordt beschreven. In dit artikel wordt het gebruik van antilichamen voor fluorescentielabeling geïllustreerd.

Samenvatting

Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een krachtige techniek voor het bestuderen van diffusie van moleculen in biologische membranen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. FCS kan de moleculaire concentratie en diffusiecoëfficiënt van fluorescent gelabelde moleculen te kwantificeren in het celmembraan. Deze techniek heeft het vermogen om de moleculaire diffusie eigenschappen van moleculen in het plasmamembraan van immuuncellen in normaal staand (dus zonder processen die het resultaat tijdens het werkelijke meettijd). FCS is geschikt voor het bestuderen van de diffusie van eiwitten die tot expressie op niveaus kenmerkend voor de meeste endogene eiwitten. Hier, wordt een eenvoudige en robuuste methode om de diffusiesnelheid van celmembraaneiwitten op primaire lymfocyten bepalen aangetoond. Een effectieve manier om metingen aan antilichaam-gekleurde levende cellen en veel voorkomende waarnemingen na de overname uitvoeren, worden beschreven. De recente ontwikkelingenin de ontwikkeling van stabiele foto-fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt door het conjugeren van het antilichamen van belang kleurstoffen die niet uitgebreid hebben bleken tijdens de metingen bestemmen. Bovendien maakt dit de detectie van langzaam diffunderende entiteiten die een gemeenschappelijk kenmerk eiwitten aanwezig in celmembranen. De analyse procedure om de concentratie en verspreiding parameters moleculaire extraheren uit de gegenereerde autocorrelatie bochten is gemarkeerd. Samengevat wordt een basisprotocol FCS metingen ontvangen; Het zal door immunologen met verstand van confocale microscopie doch zonder andere ervaring van technieken voor het meten van de dynamische parameters, zoals moleculaire diffusiesnelheid.

Inleiding

Veel immuuncellen functies afhankelijk moleculaire diffusie en interacties binnen membranen. Biologische membranen zijn complex en vele factoren die belangrijk zijn voor de functie van immune cellen kan de snelheid van translationele diffusie van eiwitten beïnvloeden binnen celmembranen ¹ kan zijn. We hebben onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen, lymfocyten behoren tot het aangeboren immuunsysteem vertonen differentiële diffusie van twee onderzochte eiwitten op de celmembraan afhankelijk van de toestand van NK-celactivering ^2.

Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een techniek die in staat kwantificeren moleculaire diffusiesnelheid in biologische membranen. Rapporteert de gemiddelde diffusiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen in een vast volume, meestal de focus van een confocale microscoop. Het is gebaseerd op de meting van de fluctuaties in fluorescentie die optreden bij moleculaire beweging ineen systeem in stabiele toestand. FCS is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de diffusie van fluorescerende kleurstoffen en proteïnen, zowel in oplossing als in lipide membranen. Andere uitvoerparameters die de diffusiesnelheid kan ook indirect worden bestudeerd op deze manier (bijvoorbeeld conformationele veranderingen in eiwitten of interacties van moleculen over celmembranen) ^{3, 4.} FCS onderscheidt zich in vergelijking met andere technieken vanwege de hoge gevoeligheid, waardoor de mogelijkheid van één molecuul detectie. Het werkt goed voor moleculaire concentraties in het nanomolair tot millimolair bereik, die typisch is voor endogene expressieniveaus van de meeste eiwitten ^5. Bovendien kan FCS een benadering van het absolute aantal eiwitten in de bestudeerde volume te geven, terwijl de meeste andere technieken alleen relatieve informatie over eiwit expressie levels geven. Andere methoden om moleculaire diffusie tarieven te meten binnen membranen omvatten fluocerend herstel na fotobleken (FRAP), enkel deeltje tracking (SPT), meervoudige pinhole FCS en beeldcorrelatie methoden. FRAP en beeldcorrelatie methoden zijn ensemble technieken, die over het algemeen geen informatie over het absolute aantal moleculen ¹⁰ te geven. Vergeleken met SPT, de doorvoer van FCS hoger met betrekking tot karakterisering van de gemiddelde bevolking. De analyse is ook minder veeleisend aangezien de gemiddelde diffusiesnelheid van de aanwezigheid in het laserfocus moleculen wordt gemeten in plaats van de snelheid van enkele moleculen. Ook, tenzij gespecialiseerde microscopen zijn verkrijgbaar ^11, SPT kan geen informatie over de concentratie te geven, omdat standaard SPT etikettering zeer laag mogelijk te maken voor de identificatie van enkele moleculen moet zijn. Anderzijds, FCS vereist de moleculen onder studie mobiel. Het zal gewoon niet vermeende immobiele fracties of moleculen bewegen heel langzaam op te sporen. De diffusiesnelheid van moleculen dieverblijf op de focus langer dan ongeveer een tiende van de overname tijd zal niet correct worden weergegeven in FCS metingen ^{3, 12.} Daarom diffusiecoëfficiënten opgenomen door FCS meestal sneller dan diffusiesnelheden gerapporteerd door technieken zoals FRAP en SPT, waarbij de nagenoeg in immobiele en zeer traag fracties rekening mee gehouden worden. SPT zal ook een meer gedetailleerde beschrijving van de variabiliteit van de diffusie-tarieven binnen de moleculaire bevolking dan FCS wil.

FCS kwantificeert de fluctuatie van fluorescentie-intensiteit in de tijd binnen de opgewonden volume. Bij membraan metingen, vertaalt het verlichte oppervlak van het membraan. In deze paper, maken we gebruik van het feit dat dergelijke fluctuaties worden veroorzaakt door moleculen vertonen Brownse diffusie en zijn dus bewegen in en uit de excitatie volume. Er zijn ook verschillende andere mogelijke bronnen voor de schommelingenties in het fluorescentiesignaal, zoals knipperen of de aanwezigheid van een triplet toestand in de fluoroforen, milieueffecten binding-ontbinding van ligand, of beweging van het gehele celmembraan. Deze vermeende foutbronnen rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een FCS experiment om de resultaten ^{12, 13} te interpreteren. Typisch, laterale diffusie tarieven in biologische membranen zijn laag als gevolg van verdringing en interacties, zowel tussen membraaneiwitten en tussen eiwitten en het cytoskelet. Historisch gezien is de toepassing van FCS in membranen is dus belemmerd door het gebrek aan foto-stabiele fluoroforen, die nodig zijn om het bleken tijdens de verlengde looptijden door het excitatie brandpunt ¹⁴ te voorkomen. Echter, vandaag, zijn er tal van mogelijkheden voor geschikte foto-stabiele kleurstoffen. Significante verbeteringen in detectoren en andere hardware ook toestaan ​​dat de detectie van fluorescerende proteins en kleurstoffen van lagere helderheid. Hier, een basisprotocol voor de toepassing van FCS met knaagdiermodellen primaire lymfocyten, waarbij het eiwit van belang wordt gemerkt met een fluorescent gelabeld antilichaam, beschreven. Een benadering van de autocorrelatie krommen teneinde de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire dichtheid extraheren passen wordt ook getoond. Het protocol is gericht op het wordt gemakkelijk gevolgd door immunologen zonder eerdere ervaring van technieken om de verspreiding van moleculen te bestuderen. Er is echter een basiskennis van confocale microscopie verwacht (om deze basiskennis te krijgen, zie referentie ^15). Dit protocol kan betrekkelijk gemakkelijk worden aangepast aan andere suspensiecellen, beide cellijnen en primaire cellen. Voor gevorderde gebruikers FCS, meer verfijnde analyse methoden bestaan, waarvan sommige worden beschreven in de bespreking.

Protocol

1. kleuring voor FCS

1. Isoleer muriene NK-cellen van milt lymfocyten met behulp van magnetische kralen labeling, volgens het protocol van de fabrikant ^16. Gebruik 2-3 x 10 ⁵ cellen per monster voor de volgende stappen.
   OPMERKING: negatieve selectie de beoogde celpopulatie verrijken, waarbij het onaangetast, zodat de cellen kunnen worden gelabeld met primaire antilichamen alleen. Zie referentie ² voor meer informatie over cel isolatie van muizen ^2.
2. Voor muriene cellen die Fc-receptoren blokkeren de Fc-receptoren met het antilichaam kloon 2.4G2 bij 5 ug / ul in 25 ui fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1% foetaal runderserum (FBS) per monster. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Bereiding van antilichaam mengsel.
   1. Gebruik antilichamen direct geconjugeerd aan een foto-stabiele fluorofoor. Als twee antilichamen tegen twee verschillende eiwittengebruikte gebruik fluoroforen die goed gescheiden emissiespectra de overspraak te minimaliseren (bijvoorbeeld, opgewekt door de 488 en 633 lasers ^2, later in het protocol aangeduid als de "groene" en "rode" lasers en fluoroforen, respectievelijk hebben ).
      NB: Als commerciële antilichamen die zijn gemerkt met een foto-stabiele fluoroforen zijn niet beschikbaar voor de geselecteerde biomarkers, conjugaat niet-gemerkte antilichamen tegen de fluoroforen volgens de instructies van de fabrikant. Zie Materialen tabel voor de antilichamen gebruikt in deze studie.
   2. Bereid een antilichaam mengsel door verdunning fluorescent gelabelde antilichamen tegen het eiwit of de eiwitten van belang in PBS + 1% FBS. Voeg het antilichaam mengsel aan elk monster tot een eindvolume van 50 ul per monster. Incubeer op ijs gedurende 45 minuten in het donker.
      OPMERKING: Optimaliseren van de concentratie van de antilichamen vooraf te waarborgen dat het antilichaam wordt gebruikt bij een verzadigingsconcentratie, typisch1-10 ug / ml.
4. Na incubatie was de cellen door toevoeging van 250 pi PBS en centrifugeer ze op 150 g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant.
5. Herhaal stap 1.4.
6. Resuspendeer de cellen in 200 pl PBS + 1% FBS. Blijf op ijs en in het donker tot overname.
   OPMERKING: Muizen NK cellen kunnen worden bewaard op ijs tot 10 uur.

2. Voorbereiding van de Microscope Chambered dekglaasje Slides

LET OP: Gebruik chambered dekglaasje dia's of gerechten met het deksel glasdikte dat de microscoop is geoptimaliseerd voor, ofwel # 1 of # 1.5. Indien de microscoop niet is gepositioneerd op een bepaalde dikte, of indien het bekend, de microscoop kraag ring moet worden geoptimaliseerd voor de dekglaasje dikte ^17.

1. Verdun poly-L-lysine met gedestilleerd water in een 1:10 verhouding. Voeg 200 gl verdunde poly-L-lysine om de kamers en incubeer gedurende 20 minuten.
2. Verwijder depoly-L-lysine door afzuigen en laat de kamer lucht drogen met zonder deksel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20-30 minuten.

3. Het starten van de FCS System

Opmerking: Dit protocol betreft een specifiek microscoopsysteem en software (zie Materialen / Reagentia tabel), hoewel andere microscopie opstellingen en software ook worden gebruikt.

1. Zet de confocale laser scanning microscoop met de FCS correlator. Open de software in de "Expert mode". Selecteer de 40X water immersie lens.
2. Onder het tabblad "Acquire", druk op de "Config" en "Scan" om de "Configuration Control" en de "Scan Control" windows (windows A en B in figuur 1, respectievelijk) te openen. Onder het tabblad "Confocor", druk op "Measure" om het venster "Measurement" (venster C in figuur 1) te openen.
3. Maak een map aan de FCS te reddenafmetingen. Start een nieuwe beeldbank door te klikken op "Nieuw" onder het tabblad "Bestand".
4. Met behulp van de "Laser" knop, zet de halogeenlamp en de relevante lasers voor opwindende de fluoroforen (bijvoorbeeld 488 nm voor de "groene" excitatie laser en 633 nm excitatie voor de "rode" excitatie laser).
5. Kies geschikte excitatie en emissie filters en de bijbehorende detektoren te activeren.
   1. Geef de instellingen voor het vastleggen van beelden, met inbegrip van de excitatie laser, excitatie en emissie filters, lichtpad en detectoren te worden gebruikt, in het venster "Configuration Control".
   2. Ook geeft u de desbetreffende instellingen voor de FCS metingen in het venster "Measurement", onder het tabblad "System Configuration". Gebruik als overeenkomstige instellingen mogelijk voor beeldvorming en FCS.
   3. Activeer de detectie kanalen voor FCS opnames door het vakje "Ch1" voor de groene channel en "Ch2" voor het rode kanaal in het venster "waardering".
      OPMERKING: De instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor het fluorofoor (en), zoals in een standaard confocale beeldvorming experiment. In de daaropvolgende experimenten, kan dezelfde FCS instellingen worden hergebruikt door het openen van een oude FCS-bestand, met behulp van de "Confocor" pull-down menu aan de bovenkant van de user interface, en te kiezen voor "Open het bestand." Druk op "Hergebruik" in het venster opkomende overname. Op dezelfde manier kan beeldacquisitie instellingen worden geladen door het openen van een opgeslagen afbeelding en drukken "Hergebruik."
6. Wacht tot de laser stabiel voordat FCS metingen. Dit kan tot 30 minuten voor gas lasers, terwijl diode lasers sneller te stabiliseren. Pas de pinhole tijdens het wachten.

4. Pinhole Adjustment

1. Bereid 0,2-0,5 uM oplossingen fluoroforen en fluorescente kleurstoffen volgens de excitatie- en emissiespectra van de labels op de antilichamen. Defluoroforen moet hebben geweten diffusiecoëfficiënten ^{18, 19.}
2. Liep 50 ul druppel van oplossing met de fluorofoor geëxciteerd door de groene laser in het midden van een putje in een chambered dekglaasje dia. Doe een druppel gedestilleerd water op de objectieve 40X water en de positie van de dia. Druk op de "Vis" knop om zichtbaar licht te beginnen en gebruik het oculair te vinden en zich richten op de fluorofoor druppel.
   LET OP: Gebruik dezelfde dia als voor later cel metingen, aangezien vermeende kleine variaties in de dikte van het glas tussen de dia's de microscoop uitlijning kan beïnvloeden.
3. Leg de focus zowel in de vloeistof druppel (10-100 urn van de bodem).
4. In het venster "Measurement", selecteert u het tabblad "Acquisition". Druk "huidige positie" in het "posities" (venster C in figuur 1).
5. Ga terug naar het tabblad "System Configuration" in hetzelfde venster. Een hoge power voor de groene laser.
   OPMERKING: Een hoog laservermogen verwijst naar de verzadigende vermogen (dat wil zeggen, heeft het fluorescerende signaal niet lineair toeneemt wanneer het laservermogen verder wordt verhoogd). Rond 1 mW systeeminstellingen macht, of 5-10% van de maximale laservermogen, is meestal genoeg.
6. Test de stabiliteit van het signaal door te drukken op "Start." Dit zal een apart venster met de tijd trace en autocorrelatie curve voor de huidige meting te openen. Controleer of de fluorescerende signaal hoog stabiel in de tijd, en tonen schommelingen in de kHz plaats van Hz.
7. Selecteer de knop "O Adjust" in het venster "waardering". Controleer of de juiste detectiekanaal (Ch1 of Ch2) wordt geselecteerd. Druk op "AutoAdjust X." Indien de resulterende curve een duidelijke maximum vertoont, of het maximum is aan de rand, markeer de "grove" optie en druk op "AutoAdjust X" weer. Wanneer het resulterende scherm in de x-richting is beëindigd, doen de same om Y door te drukken "AutoAdjust Y."
8. De-selecteer "grof" en wisselen tussen het aanpassen van X en Y door te drukken "AutoAdjust" totdat beide duidelijke maxima en de waarden veranderen niet tussen de metingen.
9. Als cellen worden gemerkt met twee verschillende fluoroforen, naar een kamer waar rode fluorofoor oplossing toegevoegd. Kies een hoog laservermogen voor de rode laser en herhaal de stappen 4,6-4,8 voor de rode excitatie en detectie-kanaal.
   LET OP: Als X en Y waarden afwijken tussen de kanalen in systemen waarbij slechts één pinhole wordt gebruikt voor zowel de detectie kanalen, selecteert u tussenliggende waarden en druk op OK om de wijzigingen te accepteren. Hier, voor de 488 nm laser met maxima bij X = 79 en Y = 189 en 633 nm laser met maxima bij X = 80 en Y = 188, waarden X = 80 en Y = 189 geselecteerd. De combinatie van de 488 nm en 633 nm lasers voor excitatie van de twee antilichamen gemerkt met fluoroforen bekrachtigd door 488 nm of 633 nm is een goede keuze, omdat hetrisico voor cross-talk wordt geminimaliseerd als de emissiespectra elkaar niet overlappen ^2.

5. Meet de looptijd van de Vrije Fluorofoor

OPMERKING: Bij het bepalen van de doorgangstijd door het brandpunt (TauD) van een fluorofoor met een bekende diffusiecoëfficiënt, de grootte van het detectievolume, en derhalve het gebied van het celmembraan dat binnen de focus, kan worden berekend. De berekening van TauD wordt beschreven in stap 7.2.

1. Met behulp van dezelfde oplossingen voor de pinhole aanpassing, stelt de overname tijd tot 30 seconden x 2 herhaalt onder het tabblad "Acquisition" in het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C).
2. Start een meting door te klikken op "Start" in het venster "Measurement" (Figuur 1, venster B).
   1. Voer een laservermogen reeks per excitatielaser en de overeenkomstige fluorofoor in oplossing beginnend op of nabijverzadigen van de macht en het verminderen van de helft voor elke meting. Verander het laservermogen in het tabblad "System Configuration" van het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C). Druk op de knop "Start" om een ​​meting te starten.
      OPMERKING: Neem het laservermogen voor de komende celmetingen in het onderste bereik (gemeten bij 16, 8, 4, 2 en uW vermogen voor de doelstelling) ^20. Systeem laserinstellingen het algemeen hoger dan de uitgang excitatie- en kunnen grotendeels variëren afhankelijk van de microscoop en de kwaliteit van de aanpassing. In dit systeem, de bovengenoemde vermogensbereik overeen met ongeveer 60-500 uW systeeminstellingen macht. Het is aangeraden om een ​​power meter te gebruiken om het vermogen te meten voor het doel dat de eerste keer dat een nieuwe microscoop gebruikt. De huidige maximale vermogen van de laser is te vinden onder de "Info" knop van het venster "waardering".
   2. Noteer de tellingen per molCule (CPM, eenheid: kHz) van elkaar laservermogen meting.
   3. Als twee detectie kanalen worden gebruikt, controleer het venster met de autocorrelatie curve voor cross-talk. Gebruik een oplossing die alleen groene fluoroforen gedetecteerde FCS autocorrelatie in de rode detectiekanaal en een oplossing met slechts rode fluoroforen om detectie beoordelen in het groene detectiekanaal meten. Als vuistregel, houdt de gedetecteerde uit het "verkeerde" fluorofoor dan 5% van het specifieke signaal van de juiste fluorofoor CPM.
   4. Controleer dat de waarden schalen lineair met de laservermogen gebruikt. Verzadiging van CPM bij de hoogste laservermogen (dat wil zeggen, iets lagere waarden dan verwacht van een lineair verband) is aanvaardbaar.
      OPMERKING: CPM moet ruim boven 10 de hoogste laservermogen voor bijna alle microscoopsystemen en gemeenschappelijke fluoroforen en kan aanzienlijk hoger gevoelige systemen. De eerste keer dat een nieuwe antilichaam geconjugeerd fluorescerend wordt gebruikt, voert eenFCS meting van het antilichaam vrij diffunderen in oplossing de verwachte CPM kwantificeren. Vóór de meting, laag de meetkamer met 200 pl poly-L-lysine geënt met polyethyleenglycol (verdund tot 0,5 mg / ml in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de vloeistof met een pipet en laat de kamer naar de lucht drogen. Sla de voorraad oplossing in de koelkast (tot 2 weken) en het poeder voorraad in de vriezer. Bij de microscoop verdunnen antilichaam tegen 1-10 ug / ml in PBS. Volg de stappen 4,2-4,4 en 6,7 in dit protocol. Als het oppervlak is gecoat met een kleefvrije oplossing, zullen antilichamen interactie met het glasoppervlak en wordt snel uitgeput uit de oplossing.

6. celmetingen

1. Voeg 125 ul van cellen in PBS + 1% FCS van het antilichaam-gelabelde celsuspensie (stap 1.5) en 150 ul van transparante Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI) in een putje van een 8-well chambered dekglaasje dia. Leave de cellen in het donker bij meettemperatuur gedurende ten minste 20 minuten voordat FCS metingen.
   Opmerking: Dit is om de cellen te laten bezinken en hechten aan de bodem van de putjes en de cellen en oplossing in evenwicht komen de meettemperatuur.
2. In het venster "Scan Control" (Figuur 1, venster B), stel zoom 1 en start een snelle XY scan door op de "Fast XY" knop. Verander het laservermogen zodat deze zo laag mogelijk terwijl de cellen nog duidelijk zichtbaar. Het beeld op een knoopcel van gemiddelde helderheid, waarbij het membraan duidelijk omschreven en er geen fluorescerend signaal in het cytoplasma. Zoom in totdat de cel omvat het grootste deel van het beeld.
3. Selecteer een nieuwe cel als de huidige cel beweegt of displays ranken, profielen, of extreem heldere vlekken. Houd dezelfde zoom en laservermogen voor alle cellen gevangen tijdens hetzelfde experiment.
   LET OP: Een verstoorde membraan kan ook een teken van de komende apo zijnptosis.
4. Richten op de bovenkant van de celmembraan. In het tabblad "Acquisition" van de "waardering" venster (Figuur 1, venster C), selecteert u een positie voor FCS-meting door het activeren van "Crosshair." Of selecteer het tabblad "LSM Beeld", markeer de wilde meetpunt beeld lsm in en druk op de "positie toevoegen."
   Opmerking: het gebruik van het celmembraan wordt niet beïnvloed door fluorescerende antilichamen of fluoroforen aspecifiek gebonden aan het poly-L-lysine. Het is echter belangrijk te vergewissen dat de cel niet bewegen tijdens de meting (zie de resultaten).
5. In het tabblad "Acquisition" van het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C), stelt u het aantal herhalingen tot 6-10, met de "Meet Time" vastgesteld op 10 sec per herhalen.
6. Ga terug naar het tabblad "System Configuration" van het venster "waardering". Stel het laservermogen voor de FCS-meting onder de "Laser button ". Voor de doelstelling, het gebruik laag vermogen voor mobiele metingen, in het gebied tussen 1 en 10 uW ^20.
   LET OP: De aanbevolen waarden zijn een trade-off tussen de signaaldetectie en photodamage aan cellen. Zie stap 5.2.1 NB het percentage laservermogen deze waarden komen overeen.
7. Start een FCS-meting door te drukken "Start" in de "waardering" window (raam C). Als de cel bleekmiddelen aanzienlijk het begin van de meting, zoals gedetecteerd door een afname van de intensiteit sporen met meer dan 30% gedurende de eerste 10 seconden (een voorbeeld wordt getoond in Figuur 3A, onderste paneel), naar een andere cel en lagere het laservermogen voor toekomstige metingen.
   1. Als het signaal verloren gaat, past u de focus in de Z-richting. Nadat de meting is voltooid, gebruikt het venster "Scan Control" (Figuur 1, venster B) om te controleren of de cel nog steeds gecentreerd en dat de celmembraan gemeten. Als the cel is verhuisd, gooi de meting.
   2. In de autocorrelatie venster waarin de meting wordt weergegeven, handmatig individuele herhalingen dat zoomen manoeuvres, bleken, grote clusters of andere artefacten (zie voorbeelden in figuur 3) bevatten verwijderen. Doe dit door ze te markeren, de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor "Verwijderen." Sla het laatste bestand in .fcs formaat. Bewaar ten minste vier herhalingen per cel.
8. Eventueel krijgen een beeld van de cel aan het middendeel (het hele omtrek van het membraan zichtbaar) in het venster "Scan Control". Leg het beeld na de FCS-meting bleken te voorkomen. Druk op de "Single" knop om het beeld vast te leggen starten.
9. Bij gebruik van de FCS aandacht positionering "positie toevoegen", klik op "Remove position" alvorens over te gaan naar de volgende cel.
10. Veranderen in een nieuwe aliquot van celsuspensie na maximaal 2 h gemeten aan de cellen levensvatbaar blijven throughout het experiment.

7. FCS Analyse

1. Open de .fcs bestanden in een software met een curve fitting vermogen (zie Materialen / Reagentia Tafel voor de software die wordt gebruikt in dit protocol).
   LET OP: De FCS-software die wordt geleverd met de microscoop is een goede plek om vertrouwd te raken met elementaire montage te worden, maar extra software nodig is om te passen tweedimensionale membraan diffusie.
2. Bepaal eerst de grootte van de excitatie- volume door analyse van het vrije fluorofoor metingen. Breng een 3-dimensionale vrij diffusie bocht naar autocorrelatie bochten ^21.
   (Vgl. 1)
   LET OP: Definitie van parameters: N = gemiddeld aantal fluorescerende entiteiten in het brandpunt volume, τ (Tau): correlatie tijd τ _D (TauD): de gemiddelde verblijftijd in het brandpunt volume, T 1: kans voor de fluoroforen om in de triplet toestand, τ T: relaxatietijd de singlet-triplet toestand overgangen, S: verhouding van hoogte tot diameter breedte van de focale volume.
   1. Extract TauD, is de looptijd van moleculen om de focus te brengen.
   2. Gebruik de waargenomen TauD gepubliceerd diffusiecoëfficiënt (D) van fluoroforen worden gebruikt voor de kalibratie ^{18, 19} aan de pinhole radius (ω) berekenen.
      (Vgl. 2)
3. Analyse van de autocorrelatie bochten op celmembranen.
   1. Het deel van de kromme die moleculaire diffusie visualiseren, selecteert de tijd beginnen voor de steilste helling van de autocorrelatie curve en eindigend na de bocht convergentie van 1 (bijvoorbeeld 0,001 tot 5 s voor muizen oppervlaktereceptoren zie figuur 4).
   2. Genereer een gemiddelde autocorrelatie curve van de individuele herhalingen opgeslagen in stap 6.7.2.
   3. Monteer een 2-dimensionale membraan diffusie curve aan elke gemiddelde autocorrelatie curve met behulp van Vergelijking 3 ^3.
      (Vgl. 3)
      OPMERKING: Belangrijke uitvoerparameters zijn: N is het gemiddelde aantal moleculen die binnen de opgewonden membraanoppervlak. Herberekenen om dichtheid (N / um ^2). τ _D (TauD): de gemiddelde verblijftijd in het concentratiegebied, beperkt door de twee-dimensionaliteit van het membraan (s). Herbereken de gemiddelde verblijftijd van een diffusiecoëfficiënt ⁽² um / sec) via de bepaalde pinhole radius (ω) en Vergelijking 2. T1 is de kans op fluoroforen om in de triplet toestand. De helderheid (CPM) wordt berekend door de gemiddelde totale intensiteit van de meting door N.
   4. Als er een goede pasvorm niet wordt bereikt bij de eerste poging, verander de startwaarden en / of de boven- en ondergrens voor de variabelen tot this wordt bereikt.
      LET OP: Typisch upper-ondergrens voor eiwit diffusie prijzen voor primaire celmembranen 10-500 msec voor TauD, 0-100% voor de T1, en 0,1-5 msec voor TauT1. Selecteer startwaarden voor de montage in het midden van deze intervallen. Het deel van de kromme die fluorescentie fluctuaties afgeleid van diffusie is gewoonlijk tussen 1 ms en 1 seconde (zie figuur 4). Afhankelijk van de fluorofoor er soms een tweede werkwijze aanwezig zijn, die tot autocorrelatie op kortere tijdschaal dan de parameter diffusie. Dit wordt veroorzaakt door een voorbijgaande donkere toestand (triplet) of knippert (zo vaak voorkomen voor fluorescerende eiwitten). Een triplet toestand wordt verantwoord in vergelijking 3, en het gepresenteerde model moet dus ook zorgen voor een goede pasvorm in deze situaties.

Resultaten

Een typisch resultaat wordt een autocorrelatie curve met een looptijd in het traject van 10 msec tot 400 msec voor membraaneiwitten genereren. Het aantal moleculen kan variëren van 0,5 tot ongeveer 200 urn per ² voor endogeen tot expressie gebrachte eiwitten. Controleer zorgvuldig of de CPM is niet lager dan verwacht. Dit kan betekenen dat er een invloed van het achtergrondsignaal. Als een vuistregel dient de CPM signaal op cellen die wordt geaccepteerd voor analyse niet minde...

Discussie

Dit protocol FCS kan worden gebruikt voor de beoordeling van de moleculaire dynamica van oppervlaktemoleculen op alle soorten immuuncellen (muizen, mensen of andere soorten). FCS maatregelen tijdruimtelijke moleculaire dynamica omlaag naar single-molecule resolutie in levende cellen. De moleculaire dichtheid, evenals de diffusiesnelheid en clustering dynamiek van de eiwitten van belang, kan worden gewonnen uit de autocorrelatie krommen.

De fluorescerende labeling is van cruciaal belang voor ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negatieve selectie van NK-cellen
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Verhit in geïnactiveerde
Phosphate Buffered Saline	-	-	Zelf gemaakt
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparant medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Voor het blokkeren van Fc-receptoren.
Anti-Ly49A antilichaam			Monoklonaal antilichaam gemaakt in huis en geconjugeerd in huis aan Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antilichaam	BD Pharmingen	558915	Geconjugeerd in huis aan MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescente kleurstof voor antilichaam conjugatie.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Verdund in gedistilleerd water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) gegraft met polyethyleenglycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Verdund in PBS (pH 7.4) tot 0,5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Bekende diffusiecoefficient: 3,3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Bekende diffusiecoefficient: 4,4 × 10−10 m2/sec 20
Confocale microscoop	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab met curve fitting toolbox	Matlab	Versie R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 putjes, 1,0 borosilicaatbodem