Niet-invasieve bepaling van de endotheelfunctie bij de mens kan worden bepaald door de flow gemedieerde dilatatie techniek. Hoewel duizenden studies deze techniek gebruikt, heeft geen enkele studie deze techniek uitgevoerd op niet-invasieve bij ratten. Het volgende artikel wordt niet-invasieve meting van de flow gemedieerde dilatatie in de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders van ratten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ultrasound Evaluatie van Flow-Mediated verwijding van de Brachial en Oppervlakkige dijbeenslagaders in Ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Arteriële vasodilatatie als reactie op toenames in wandschuifspanning is indicatief voor de vasculaire endotheelfunctie. Bij mensen kan de niet-invasieve meting van de endotheelfunctie worden bereikt door de flow-gemedieerde dilatatietechniek te gebruiken, die typisch wordt uitgevoerd in de brachiale of oppervlakkige femorale slagader. In het kort wordt een bloeddrukmanchet, geplaatst distaal van een ultrasone sonde, opgeblazen tot een suprasystolische druk, wat resulteert in ledemaatischemie. Na 5 min van occlusie wordt de manchet gedeflateerd, wat resulteert in reactieve hyperemie en toenames in wandschuifspanning die vasodilatatoire moleculen signaleren om te worden vrijgegeven vanuit het endotheel, wat vasodilatatie veroorzaakt. Ondanks de duizenden studies die flow-gemedieerde dilatatie bij mensen uitvoeren, hebben verrassend genoeg geen studies deze techniek niet-invasief bij levende ratten uitgevoerd. Gezien de recente verschuiving in focus naar translationeel onderzoek, zou het vaststellen van richtlijnen voor niet-invasieve meting van flow-gemedieerde dilatatie bij ratten en andere knaagdieren uiterst waardevol zijn. In het volgende artikel wordt een protocol gepresenteerd voor de niet-invasieve meting van flow-gemedieerde dilatatie in brachiale en oppervlakkige femorale slagaders van ratten, aangezien deze locaties het meest gebruikelijk zijn bij mensen.
Inleiding
Het vasculaire endotheel is een cellulaire monolaag die lijnen de lumen van de slagaders en is een belangrijke regulator van de vasculaire functie. Er zijn talrijke moleculen vrijgemaakt uit het endotheel die resulteren in modulatie van diameter bloedvat. Onder deze moleculen, stikstofmonoxide (NO), lijkt de primaire vaatverwijdende molecuul vrijgemaakt uit het vasculaire endotheel in reactie op stimulatie (bijvoorbeeld, insuline, acetylcholine, of veranderingen in shear stress) 1. In het vasculaire endotheel, wordt NO door endotheliale het enzym NO synthase (eNOS) en vervolgens vrijgemaakt uit endotheelcellen 2. NO diffundeert naar de vasculaire gladde spieren, waar het veroorzaakt ontspanning en verhoogde vaatdiameter 3.
Endotheeldisfunctie kan niet-invasief worden beoordeeld bij de mens met de flow-gemedieerde dilatatie (FMD) techniek 4,5. MKZ is voorgesteld om een functionele bioassay te vertegenwoordigen endotheel-afgeleideNO biologische beschikbaarheid bij de mens, en wordt gewoonlijk beoordeeld op de brachiale of oppervlakkige dijbeenslagader in reactie op reactieve hyperemie na een ~ 5 min occlusie 6. Reactieve hyperemie verhoogt laminaire afschuifkrachten die worden getransduceerd met de endotheelcellen 7, signalering vrijkomen van NO 8. Hoewel in de afgelopen jaren, het aandeel vaatverwijding geïnitieerd door de NO is besproken 9,10 MKZ is indicatief voor endotheel afhankelijke dilatatie en heeft consequent aangetoond dat cardiovasculaire gebeurtenissen te voorspellen 11-13.
Tot op heden zijn duizenden studies het MKZ toegepaste techniek voor niet-invasieve meting van de endotheelfunctie bij mensen. Gezien de recente verschuiving in focus translationeel onderzoek, zou richtlijnen voor de niet-invasieve meting van FMD in knaagdieren zeer waardevol zijn. Overeenstemming met een translationele benadering, werd dit protocol vastgesteld voor de meting van MKZ in arm en superficial femorale arteriën van ratten, zoals die sites worden meestal gemeten in mensen. Dit protocol resulteert in een robuust en herhaalbare MKZ respons bij ratten, maar meting van MKZ bij ratten is technisch veeleisend en kunnen moeilijk zijn voor andere onderzoekers om te repliceren zonder video demonstratie. Daarom zal de volgende voorwerp een werkwijze voor de niet-invasieve meting van FMD in de brachiale en oppervlakkige femorale arteriën van ratten tonen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures voldeden aan de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren 14 en werden goedgekeurd door de Universiteit van Utah en Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care en gebruik.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Plaats dier in anesthesie inductie kamer met 3% isofluraan in 100% zuurstof. Laat het dier in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli.
- Verwijder het dier uit de inductie kamer en plaats het op een verwarmde onderzoekstafel uitgerust met elektrocardiogram (ECG) elektroden. Handhaaf anesthesie op 3% isofluraan in 100% zuurstof. Brachial en oppervlakkige dijbeenslagader MKZ kunnen niet tegelijkertijd worden uitgevoerd. Daarom worden bereidingsinstructies voor elke meting hieronder.
2. slagader Voorbereiding
- Plaats het dier in rugligging en beperken de linker bovenste ledematen en elk onderste ledematen van de eeniMAL de onderzoekstafel met chirurgische tape.
- Restrain rechts bovenste ledematen van de dieren, zodat het onderste gedeelte van de bovenste ledematen enigszins verhoogd (~ 0,2-0,5 cm) boven het platform.
- Solliciteer ontharingsmiddel (bijv Nair) naar rechts bovenste ledematen van het dier om haar te verwijderen.
- Plaats een occlusie cuff (10 mm lumendiameter standaard vasculaire occlusie) rechts bovenste ledematen distaal van de elleboog. Laat de occlusie-inrichting niet rusten op het platform, aangezien de inflatie / deflatie de ledematen bewegen en verstoren echografie beelden.
- Stel het echoapparaat aan B-modus met behulp van de echo toetsenbord.
- Breng een kleine hoeveelheid ultrasoongel de bovenste ledematen van de dieren, proximaal van de occlusie cuff.
- Handmatig uitlijnen een ultra-hoge frequentie lineaire array transducer gekoppeld aan een stereotactische houder met de bovenste ledematen. De slagader moet zichtbaar 2-3 mm diep zijn.
- Om te bevestigen dat de slagader, niet de brachiale ader, wordtafgebeeld, overschakelen naar de PW-modus met behulp van de echo toetsenbord. De slagader zal pulsatiele bloedstroom in tegenstelling tot de naburige ader die continue bloedstroom hebben.
3. Oppervlakkige Femorale arterie Voorbereiding
- Plaats het dier in rugligging en beperken de bovenste ledematen en de linker onderste ledematen aan de onderzoekstafel met chirurgische tape.
- Restrain de juiste onderste ledematen van het dier naar een verhoogde positie (~ 0,5-1 cm) boven het platform met behulp van een pad (bv gevouwen papieren handdoeken).
- Solliciteer ontharingsmiddel (bijv Nair) naar rechts van het dier onderste ledematen om haar te verwijderen. Na ontharing moet de lies duidelijk zichtbaar op de bovenste binnenkant van de dijen zijn.
- Plaats een occlusie cuff (10 mm lumendiameter standaard vasculaire occlusie) proximaal aan de rechter enkel. Laat de occlusie-inrichting niet rusten op het platform, aangezien de inflatie / deflatie de onderste ledematen bewegen en verstoren echografie beelden.
- Stel de ultrasone machineB-mode.
- Een kleine hoeveelheid van ultrageluid gel aan de onderste ledematen van het dier, proximaal van de occlusie cuff.
- Handmatig uitlijnen ultrahoge frequentie lineaire array transducer die aan een stereotactische houder met de femorale ader, welke zichtbaar is door de huid. De oppervlakkige dijbeenslagader moet zichtbaar <1 mm diep zijn.
- Om te bevestigen dat de oppervlakkige dijbeenslagader, niet de lies, wordt afgebeeld, overschakelen naar de PW-mode. De slagader zal pulsatiele bloedstroom in tegenstelling tot de naburige ader die continue bloedstroom hebben.
4. basislijnfase
- Beeld optimaliseren de B-modus, vergelijkbaar met hoe het zou gebeuren bij mensen 15. Zorg ervoor dat een horizontale, longitudinale beeld van het schip met intima-media gevisualiseerd in beide wanden wordt waargenomen. Optimaliseer het beeld door iets aanpassen van de ultrasone sonde plaatsing die zoveel mogelijk van de slagader te waarborgen mogelijk is zichtbaar in de capture-venster.
- Als alternatief stellen echografie instellingen om een beter beeld te krijgen door het veranderen van de helderheid / contrast, focale zones, frequentie, dynamisch bereik, en de lijn dichtheid. Er zijn andere manieren om het ultrasone beeld optimaliseren, maar gedetailleerde beschrijving van deze vallen buiten het bestek van dit protocol.
- Na optimalisatie slagader beelden, zet ECG-gating alleen opnamen tijdens de R-golf zodat slechts één diameter frame verzameld zijn gedurende elke diastolische gedeelte van een hartcyclus weergeven.
LET OP: ECG-gating is beschikbaar op de echografie machine gebruikt in dit protocol door het selecteren van ECG-gating onder de optie fysiologische instellingen, maar deze functie is mogelijk niet beschikbaar op alle ultrasound machines. ECG-gating moet worden ingeschakeld nadat het beeld wordt geoptimaliseerd, omdat het moeilijk is om een beeld te verkrijgen bij lagere framesnelheden (bijv eenmaal per R-golf). Zonder ECG-gating, de combinatie van een hoge hartslag in ratten en vereiste van een hoge framesnelheidrate te vangen van de diastolische gedeelte van de hartcyclus staat alleen voor ~ 10-20 tweede clips. De logge grootte en de hoeveelheid gegevens in elke clip verhoogt de analyse last aanzienlijk. - Record 60 seconden van de baseline-gegevens met behulp van B-mode.
OPMERKING: De ultrasone machine neemt altijd echter niet alle beelden worden opgeslagen op de ultrasone machine, aangezien er een limiet aan het aantal frames dat per echografie clip kan worden opgenomen. De clip lengte (dat wil zeggen, het aantal frames) kan worden aangepast in de instellingen. Er wordt voorgesteld om ingesteld voor maximale aantal frames per clip. Wanneer de opname is aan het einde van een clip (dat wil zeggen, maximum aantal beelden bereikt), de opname voortgezet, maar de clip naar voren rolt vastleggen van de laatste frames. In dit geval worden frames die eerder buiten de maximale Afslagschakelaars werden gevangen vervolgens verwijderd. Hoewel deze complicaties bij de registratie verschillen tussen machines, kan een aanpassing van opnametijd nodig. - Switch naar PW-mode. Plaats de cursor in het midden van het lumen. Sample poorten worden automatisch met betrekking tot de cursor geplaatst, maar kan worden aangepast aan de breedte met de ultrasone toetsenbord. Handhaaf een insonatie hoek van ≤60 °.
- Pas de insonatie hoek door het veranderen van het Doppler stralingshoek. Maak fijne aanpassingen aan de hoek met behulp van de ultrasone toetsenbord. Als geen van deze bieden een hoek geschikt voor het meten, handmatig aanpassen van de ultrasone sonde door het kantelen van de slagader naar een meer optimale hoek. Als een aanpassing van de echografie hoek wordt uitgevoerd, te heroveren B-modus beelden.
- Neem 10 seconden snelheidsgegevens.
5. Occlusie Phase
- Pomp de vasculaire occlusie-inrichting met een luchtgevulde 10 ml spuit. Om de luchtdruk constant in de vasculaire occlusie-inrichting te houden, vouw de buis op zichzelf en plaats een bindmiddel clip op de gevouwen buis.
- Overschakelen naar PW-modus om manchet occlusie te bevestigen, zoals blijkt uiteen grote reductie in het bloed snelheid.
- Schakel over naar de B-modus en opnemen van gegevens in 60 seconden clips, totdat 04:45 min van occlusie.
- Overschakelen naar PW-mode. Een register bijhouden van de hartslag en de tijd van elke ultrageluid clip voor analyse.
6. hyperemic Phase
- Laat de manchet tijdens het opnemen in de PW-modus door het verwijderen van het bindmiddel clip van de gevouwen buis. Neem 5 seconden vóór en 5 seconden na cuff release.
- Schakel over naar de B-modus en opnemen van gegevens in 60 seconden clips tot 3 minuten na occlusie. Een register bijhouden van de hartslag en de tijd van elke ultrageluid clip voor analyse.
- Na voltooiing van MKZ verwijder het dier uit de onderzoekstafel en bewaken totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
7. Analyse
- Voor de analyse, export ultrasound zoals DICOM-bestanden naar een offline computer uitgerust met edge-detectie software, die het mogelijk maakt voor de onpartijdige af te schrikkenling van slagader diameter op elk frame. Analyse is mogelijk op de echografie-machine, maar het niet aan te raden, want het is zeer tijdsintensief en onder voorbehoud van onderzoeker vooringenomenheid.
- Analyseren van gegevens slagader diameter in 60 seconden segmenten tijdens de baseline en occlusie fase en in 10 seconden segmenten tijdens de hyperemic fase.
- Analyseer bloed snelheid gegevens met behulp van de flow-analyse mogelijkheden van de geautomatiseerde edge-detectie software. Bepaal gemiddelde bloed snelheid door het meten van 5 of meer opeenvolgende golfvormen van uniform uiterlijk tijdens de baseline en occlusie fasen. Bepaal gemiddelde bloed snelheid tijdens reactieve hyperemie bloed snelheden direct na cuff release. De golfvorm met de hoogste bloed snelheid wordt beschouwd piekplasmaspiegel velocity.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Flow-gemedieerde dilatatie werd uitgevoerd op de brachiale en oppervlakkige femorale slagader van 8 Wistar ratten. Plaatsing van een rat wordt getoond in figuur 1.
Representatieve ultrasone beelden van de oppervlakkige femorale slagader worden weergegeven in figuur 2.
...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie, een niet-invasieve meting van MKZ werd aangetoond in de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders van ratten. Vergelijkbaar met de mens 6, na een 5 min occlusie periode was er een snelle toename van bloedsnelheid (reactief hyperemie) waardoor schuiven toenemend op de slagaderwand waardoor de daaropvolgende vasodilatatie van de slagader. MKZ werd waargenomen in zowel de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders. Bovendien was er een sterke relatie tussen MKZ slagaders. Hoewel de piek af...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Alle dierlijke beeldvorming werd uitgevoerd in de Small Animal Imaging Core Facility, University of Utah.
Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (R21 AG043952, R01 AG040297, K01 AG046326, K02 AG045339 en R01 DK100505).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optioneel |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore chirurgisch tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatiecrème (bijv., Nair) | Algemene voorraad | ||
| Wattenstaafjes | Algemene voorraad | ||
| Ultrageluidgel | Algemene voorraad | ||
| Standaard vaatvernauwer, 10 mm lumendiameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml spuit met Luer-Lok tip | Algemene voorraad | Gebruikt voor occlusiemanchetapparaat | |
| Paperclip | Algemene voorraad | Gebruikt voor occlusiemanchetapparaat | |
| Hypodermische naald – 18 gauge | Algemene voorraad | Gebruikt voor occlusiemanchetapparaat | |
| Medium klemmenclip | Algemene voorraad | Gebruikt voor occlusiemanchetapparaat |
Referenties
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C. eNOS at a glance. J Cell Sci. 117, 2427-2429 (2004).
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070(2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
