Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zika Virus (ZIKV) is een opkomende pathogeen die is gekoppeld aan foetale ontwikkelingsstoornissen afwijkingen zoals microcefalie, oogafwijkingen en verminderde groei. ZIKV is een RNA-virus van de familie Flaviviridae. ZIKV wordt voornamelijk overgedragen door muggen, maar kan ook worden verspreid door de moeder van de foetus verticale transmissie en seksueel contact. Tot op heden zijn er geen betrouwbare behandeling of vaccin keuzemogelijkheden bij besmet met het virus te beschermen. De ontwikkeling van een reproduceerbare effectieve Zika infectieus virus celkweeksysteem is cruciaal voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van ZIKV replicatie en geneesmiddel en vaccinontwikkeling. In dit opzicht is een protocol beschrijft een zoogdierlijke cellen gebaseerde in vitro Zika viruskweek voor virusproductie en groei analyse hier vermeld. Details betreffende de vorming van plaques door Zika virus op een cel monolaag en plaque-test voor het meten van virale titer worden gepresenteerd. Virale genoom replicatie kinetieken dubbelstrengs RNA genoom replicatory tussenproducten worden bepaald. Deze cultuur werd gebruikt om platform scherm tegen een bibliotheek van een kleine set van cytokinen resulteerde in identificatie van interferon-α (IFN-α), IFN-β en IFN-γ als krachtige remmers van virale groei Zika. Kortom, een in vitro infectieuze Zika viruskweek en div virologische assays worden aangetoond in deze studie, die in potentie de onderzoeksgemeenschap veel baat verder ophelderen van de mechanismen van virale pathogenese en de ontwikkeling van virale virulentie heeft. Antivirale IFN-alpha kan verder worden geëvalueerd als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandelingsoptie voor Zika virusinfecties in zeer riskante bevolking, met inbegrip van geïnfecteerde zwangere vrouwen.
Inleiding
Zika Virus (ZIKV) is een belangrijke menselijke pathogeen geassocieerd met microcefalie en slechte zwangerschapsuitkomsten 1,4. ZIKV behoort tot de verzameling van medisch relevante flavivirussen die neurologische gebreken zoals Dengue, West Nile, en St. Louis encefalitis virussen kunnen veroorzaken. De belangrijkste wijze van virale transmissie van de mug vector Aedes aegypti, en bovendien heeft seksuele overdracht ook gemeld 5,6. ZIKV is uitgegroeid tot een grote wereldwijde gezondheidsprobleem als gevolg van de uitbreiding van de geografische spreiding van de mosquito vector en de sterke correlatie met aangeboren afwijkingen. ZIKV we....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Een schematisch overzicht van de workflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Cellen
- Gebruik Vero cellen voor Zika virusproductie en analyse van de virale replicatiecyclus.
- Bereid volledige groei medium dat 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 eenheden / ml) en 10 mM HEPES.
- Cultuur Vero cellen met het gespecificeerde volledige groeimedium bij 37 ° C met 5% CO2.
2. Zika Virus Production
- Oogst de Vero cellen bij 80% celdichtheid behulp 0,25% trypsine in T-75 kolf en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een Zika virusstam (PRVABC59; GenBank KU501215) van de Aziatische genotype werd gebruikt in deze studie 12. Vero cellen bij 80% confluentie werden gebruikt voor het onderzoeken van de novo Zika virusinfectie. Virale productie en daaropvolgende virologische karakterisering werd een vroege passage (P3) Zika virus toegepast. De virale plaques werden waargenomen op de tweede dag van de infectie. Zika virale nakomelingen afgegeven uit de aanvankelijk geïnfecteerde cel vers.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een gestroomlijnde protocol voor het kweken Zika virus in vitro gepresenteerd. Kritische stappen met inbegrip van, het identificeren van optimale eindpunten voor de uitbreiding van het virus cultuur, het meten titer, en kwantificeren van genoom replicatie werden verstrekt. Zika virus is een menselijk pathogeen, dus, terwijl de behandeling van infectieuze middelen, bioveiligheid procedures moeten strikt worden opgevolgd. Een aap niercellijn, Vero, werd gebruikt voor het aantonen van verschillende viro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Aaron Brault en Dr. Brandy Russell van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA bedanken voor het verstrekken van de Zika-virusstam PRVABC59. We danken Nicholas Ten van Yale University voor het copy-redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award aan V.A.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Referenties
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
