Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de

20.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

23 augustus 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Samenvatting

Zika Virus (ZIKV) is een opkomende pathogeen die is gekoppeld aan foetale ontwikkelingsstoornissen afwijkingen zoals microcefalie, oogafwijkingen en verminderde groei. ZIKV is een RNA-virus van de familie Flaviviridae. ZIKV wordt voornamelijk overgedragen door muggen, maar kan ook worden verspreid door de moeder van de foetus verticale transmissie en seksueel contact. Tot op heden zijn er geen betrouwbare behandeling of vaccin keuzemogelijkheden bij besmet met het virus te beschermen. De ontwikkeling van een reproduceerbare effectieve Zika infectieus virus celkweeksysteem is cruciaal voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van ZIKV replicatie en geneesmiddel en vaccinontwikkeling. In dit opzicht is een protocol beschrijft een zoogdierlijke cellen gebaseerde in vitro Zika viruskweek voor virusproductie en groei analyse hier vermeld. Details betreffende de vorming van plaques door Zika virus op een cel monolaag en plaque-test voor het meten van virale titer worden gepresenteerd. Virale genoom replicatie kinetieken dubbelstrengs RNA genoom replicatory tussenproducten worden bepaald. Deze cultuur werd gebruikt om platform scherm tegen een bibliotheek van een kleine set van cytokinen resulteerde in identificatie van interferon-α (IFN-α), IFN-β en IFN-γ als krachtige remmers van virale groei Zika. Kortom, een in vitro infectieuze Zika viruskweek en div virologische assays worden aangetoond in deze studie, die in potentie de onderzoeksgemeenschap veel baat verder ophelderen van de mechanismen van virale pathogenese en de ontwikkeling van virale virulentie heeft. Antivirale IFN-alpha kan verder worden geëvalueerd als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandelingsoptie voor Zika virusinfecties in zeer riskante bevolking, met inbegrip van geïnfecteerde zwangere vrouwen.

Inleiding

Zika Virus (ZIKV) is een belangrijke menselijke pathogeen geassocieerd met microcefalie en slechte zwangerschapsuitkomsten 1,4. ZIKV behoort tot de verzameling van medisch relevante flavivirussen die neurologische gebreken zoals Dengue, West Nile, en St. Louis encefalitis virussen kunnen veroorzaken. De belangrijkste wijze van virale transmissie van de mug vector Aedes aegypti, en bovendien heeft seksuele overdracht ook gemeld 5,6. ZIKV is uitgegroeid tot een grote wereldwijde gezondheidsprobleem als gevolg van de uitbreiding van de geografische spreiding van de mosquito vector en de sterke correlatie met aangeboren afwijkingen. ZIKV werd voor het eerst geïsoleerd in 1947 uit een sentinel rhesus aap in de Zika bos, Oeganda en de eerste menselijke geval werd gemeld in 1952 7,8. Personen die besmet raken met ZIKV aanwezig met milde symptomen zoals koorts, huiduitslag, hoofdpijn, conjunctivitis, en spier / gewrichtspijn geworden. Geïnfecteerde zwangere vrouwen kunnen ZIKV doorgeven aan de zich ontwikkelende foetus 1. ZIKV infectie is ook gekoppeld aan Guillain-Barre syndroom, een perifere zenuw auto-immune stoornis 9 demyelinisatie.

De Zika virale genoom bestaat uit een positieve sense, enkelstrengs RNA-molecuul dat ongeveer 10,8 kilobasen in lengte. De structuur van het genoom is georganiseerd als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR, met niet-coderende regio (NCR) flankeren een eiwit coderend gebied 6. Een enkele polyproteïne (3419 aa) vertaald dat co- en post-translationeel gesplitst in 10 kleinere peptiden. Zowel de 5'NCR en 3'NCR RNA stam-lus structuren spelen een cruciale rol bij de aanvang van de virale genoom vertaling en replicatie. De structurele elementen van het genoom bestaan ​​uit de capside, membraan en envelopeiwitten. De niet-structurele eiwitten zijn essentieel voor genoomreplicatie.

Op dit moment zijn Zika virusstammen gegroepeerd in drie genotypes: West-Afrikaanse, Oost-Afrikaanse en Aziatische 6,10-13. Het is voorgesteld dat de Oost-Afrikaanse afkomst verspreid naar West Afrika en Azië, waar later verder ontwikkeld 12. De Aziatische genotype is verantwoordelijk voor de huidige uitbraken in de Amerika's. Zika virus kan worden gekweekt in zowel mug en zoogdiercellen. Primaire dermale fibroblasten, ongerijpte dendritische cellen, corticale neurale progenitorcellen en Vero-cellen zijn gevoelig voor virale infectie Zika 10,14,15. Zowel type I als type II interferonen is aangetoond dat groei ZIKV in huidfibroblasten 15 beperken. De doelstellingen van deze studie zijn om een ​​stapsgewijze gedetailleerde protocol voor de productie en het testen van de Aziatische genotype ZIKA virusstam PRVABC59 in een zoogdiercel kweeksysteem en om het nut van deze besmettelijke kweeksysteem als geneesmiddelenontwikkeling platform demonstreren. Deze bron heeft de potentie om veel baat de Zika virale en neurologisch onderzoek gemeenschap om i verder te ontrafelents mechanismen van virale pathogenese en ontwikkeling van virale virulentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Een schematisch overzicht van de workflow wordt weergegeven in figuur 1.

1. Cellen

  1. Gebruik Vero cellen voor Zika virusproductie en analyse van de virale replicatiecyclus.
  2. Bereid volledige groei medium dat 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 eenheden / ml) en 10 mM HEPES.
  3. Cultuur Vero cellen met het gespecificeerde volledige groeimedium bij 37 ° C met 5% CO2.

2. Zika Virus Production

  1. Oogst de Vero cellen bij 80% celdichtheid behulp 0,25% trypsine in T-75 kolf en tel de cellen.
    1. Zuig het medium van de T-75 kolf en spoel de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg 2 ml van 0,25% trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 8 ml serum bevattend groeimedium trypsine te inactiveren. Pipet op en neer om suspend cellen en breng de cellen om een ​​15 ml buis.
    4. Verwijder 10 pi cellen en meng met gelijke hoeveelheid 0,4% trypan blauw. Plaats de voorbereide mix naar de cel telkamer glijbaan en het verkrijgen van levensvatbare cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller.
  2. Seed totaal 7.000.000 cellen in een 30 ml volume in een T-160 kolf.
  3. De volgende dag, bereidt een geschikte multipliciteit van infectie (MOI 0,01 tot 0,1) van Zika virus inoculum in 10 ml serumvrij kweekmedium per fles.
  4. Verwijder het verbruikte medium van de T-160 kolf en voeg de vers bereide virale inoculum (10 ml).
  5. Incubeer de geïnoculeerde kolven van 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de kolven zijwaarts op elk uur.
  6. Na voltooiing van de incubatie, vervang het inoculum met warm-serum gesupplementeerd groeimedia (30 ml) voor elke fles. Dan blijven de viruskweek voor de volgende 96 uur.
  7. Controleer de progressie van inFection door het observeren van het optreden van virale plaques op de cel monolaag met een fasecontrastmicroscoop en beeld (figuur 2) naar behoefte bij 40X en 200X vergroting nemen.

figure-protocol-1
Figuur 2:. Plaques gevormd door Zika virus op een monolaag van Vero-cellen Helderveld beelden van verschillende vergrotingen tonen Zika virale plaques bij 48 hpi. Let op de aanwezigheid van afgeronde cel foci op de monolaag. (Schaal bar = 50 pm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Oogst celcultuur supernatanten op 96 hr tijdstip en centrifugeer het supernatant bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
  2. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig zonder te storen gepelleteerd puin en overdracht to 15 ml buizen. Ultracentrifugatie bij 24.000 xg kunnen worden uitgevoerd om de virale deeltjes (optioneel) concentreren.
  3. Bewaar de virale kweeksupernatanten in meerdere porties bij -80 ° C.

3. Het meten van Zika virustiter door Plaque Assay

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volume met een 12-wells plaat.
  2. De volgende dag bereiden 10-voudige seriële verdunningen van viraal kweeksupernatanten vanuit het T-160 kolf behulp serumvrij medium. Verwijder de gebruikte media uit elk putje en voeg 400 ul van bereide entstof op Vero-cellen in drievoud.
  3. Incubeer de geïnoculeerde kolven 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de plaat zijdelings bij ieder uur.
  4. Aan het eind van de incubatie, het inoculum vervangen met serum aangevuld medium (2 ml per putje).
  5. Na 48 uur na inenting, tel de virale brandpunten met behulp van een fase contrast microscoop. Bereken de virale titer plaque vormende eenheden (PFU) per ml. Zie Figuur 3 voor plaque assay.
  6. Fix en vlekken op de cellen in 4% formaldehyde en 0,1% kristalviolet oplossing bereid in 20% ethanol voor een duidelijke visualisatie van plaques.

4. Zika virale genoom replicatie Assay

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volumina onder toepassing van een 12-wells plaat. De volgende dag bereiden virale inocula (MOI van 0,01 en 0,1, 400 ui / putje) met lage en hoge titer gebruik serumvrij medium in drievoud. Voor pseudo-infectie, gebruik serum vrije media (400 ul / putje) alleen.
  2. Herhaal de stappen 3,2-3,4.
  3. Voor deze 48 en 96 uur tijdstippen, laat de monsters voor RNA en immunocytochemie (ICC).
    1. Oogst RNA monsters, verwijder de kaart en voeg 400 ul lysis oplossing rechtstreeks aan elk putje en verzamel de lysaten.
    2. Voor ICC, verwijder de media en then vast de cellen door toevoeging van 1 ml methanol aan elk putje en incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    3. Van het cellysaat, isoleer het totale RNA met een RNA-isolatie-kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren RNA met behulp van een spectrofotometer.
  4. Voer een tweestaps reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) aan de ZIKV genoominhoud van geoogste RNA te bepalen.
    1. Om reverse transcriberen het RNA, eerst een 13 pi reactie mix bestaat uit 5 ug van geïsoleerde RNA, 1 ui dNTPs (10 mm), en 1 pl willekeurige hexameer (250 ng) in een 0,2 ml buis. Incubeer de buis bij 65 ° C gedurende 5 minuten en plaats het op ijs gedurende één minuut. Voeg vervolgens 1 pl reverse transcriptase, 4 pl 5x streng synthese buffer, 1 pl 0,1 M dithiothreitol, en 1 pl RNase remmer aan het reactiemengsel. Incubeer de buis gedurende nog 5 min bij 25 ° C, gevolgd door 60 min bij 50 ° C en inactivat de reactie door verwarmen tot 70 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Voer qPCR gebruikt 1 pl van de resulterende cDNA met 12,5 ui 2x groene kleurstof super mengsel dat DNA polymerase en 1 pl 10 mM individuele primers specifiek voor Zika virus [Zika virus pan-genotype primers (voor: 5'- AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virus Aziatische genotype PRVABC59 stam primers (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], of hepatitis C virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), of cellulaire huishoud-gen GAPDH (voor: 5'- CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in een 25 pl reactievolume.
    3. Voer PCR met de run toestand 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 30 seconden (40 cycli) in een real-time PCR systeem.
    4. Gebruik GAPDH expressieniveau basis van cyclus drempelwaarde (Ct) waarde voor de Z normaliserenika virale genoom meting. Bereken de delta Ct (ACt) waarde van Zika genoom vergeleken met die van GAPDH en het verkrijgen van de 2 ACt waarde. Bereken vervolgens de veelvoudverandering door de verhouding van genormaliseerde Zika inhoud genoom tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen op aangegeven tijdstippen. Zie Figuur 4 voor ZIKV genoomreplicatie resultaten.
  5. Voer ICC via de methanol gefixeerde cellen.
    1. Was de vaste cellen drie keer met 1x PBS en geblokkeerd met ICC blokkeerbuffer (3% geit serum, 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS).
    2. Met monoklonaal anti-dsRNA J2 antilichaam (1 ug / ml) bij een verdunning van 1: 100 in blokkerende buffer en incubeer overnacht bij 4 ° C.
    3. Was de cellen met 1x PBS en secundair antilichaam geit anti-muis IgG-594 (1 ug / ml) toe aan een 1: 1000 verdunning in blokkeerbuffer en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.
    4. Was de cellen met 1x PBS en vlek voor kernen met behulp van Hoechst kleurstof enobserveert de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij 100x vergroting (figuur 4).

5. Screening Cytokine Bibliotheek tegen Zika Virus Infection

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje onder toepassing van een 12-wells plaat. Zodra de cellen zijn bevestigd (6 uur na het zaaien), voeg elk cytokine bij aangegeven concentraties in biologische duplicaten (2 ml volume / putje). Inclusief voertuig (PBS) alleen controle.
  2. Om 12 uur na de behandeling uit te voeren Zika virale infectie (MOI van 0,1 in 400 ul per putje). Onder meer negatieve controle wells zonder infectie (mock).
  3. Bij 4 uur na infectie, vervang het virale inoculum met cytokine behandelde media (2 ml). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende nog 44 uur.
  4. Op 48 uur na infectie, virale plaques tellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop en het verwerven van representatieve beelden van geïnfecteerde cellen 40x vergroting (figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een Zika virusstam (PRVABC59; GenBank KU501215) van de Aziatische genotype werd gebruikt in deze studie 12. Vero cellen bij 80% confluentie werden gebruikt voor het onderzoeken van de novo Zika virusinfectie. Virale productie en daaropvolgende virologische karakterisering werd een vroege passage (P3) Zika virus toegepast. De virale plaques werden waargenomen op de tweede dag van de infectie. Zika virale nakomelingen afgegeven uit de aanvankelijk geïnfecteerde cel vers...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier wordt een gestroomlijnde protocol voor het kweken Zika virus in vitro gepresenteerd. Kritische stappen met inbegrip van, het identificeren van optimale eindpunten voor de uitbreiding van het virus cultuur, het meten titer, en kwantificeren van genoom replicatie werden verstrekt. Zika virus is een menselijk pathogeen, dus, terwijl de behandeling van infectieuze middelen, bioveiligheid procedures moeten strikt worden opgevolgd. Een aap niercellijn, Vero, werd gebruikt voor het aantonen van verschillende viro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Aaron Brault en Dr. Brandy Russell van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA bedanken voor het verstrekken van de Zika-virusstam PRVABC59. We danken Nicholas Ten van Yale University voor het copy-redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award aan V.A.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red  Corning25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%Life TechnologiesT10282
Countess – Automated Cell CounterThermoFisher ScientificC10227
Countess-cell counting  chamber slidesThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR SystemThermo Fischer4471088
RNase-Free DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
Zika viral strain PRVABC59Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6Peprotech200-06             
IL-1 alpha       Peprotech200-01A          
TNF-alphaPeprotech300-01A          
Interferon alpha A  R & D Systems11100-1
Interferon betaPeprotech300-02BC
Interferon gammaPeprotech300-02
Centrifuge 5415REppendorf5415R
Centrifuge 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFINikonVisit Nikon for Request

Referenties

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311(2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bepaling van de virale titerplaquevorminggenoomreplicatieinterferonbehandelingcytokinescreeningVero cellenimmunocytochemieRT qPCR
Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.