Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Samenvatting

Bacteriële biofilms vormen vaak op schimmels oppervlakken en kunnen betrokken zijn bij talrijke bacteriële schimmel interactie processen, zoals metabolische samenwerking, competitie of predatie. De studie van biofilms is belangrijk in vele biologische gebieden, met inbegrip van milieu-wetenschap, de productie van levensmiddelen en medicijnen. Echter slechts weinig studies gericht op dergelijke bacteriële biofilms, mede door de moeilijkheid onderzoek ervan. De meeste van de methoden voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyses biofilm in de literatuur beschreven zijn alleen geschikt voor het vormen van biofilms op abiotische oppervlakken of homogene en dunne biotische oppervlakken, zoals een monolaag van epitheelcellen.

Terwijl laser scanning confocale microscopie (LSCM) vaak gebruikt voor het analyseren in situ en in vivo biofilms, deze technologie zeer moeilijk wordt wanneer toegepast om bacteriële biofilms op schimmeldraden, door de dikte en de drie dimensies van de hyphale networks. Tot op heden is, ontwikkelden we een protocol combineert microscopie met een werkwijze om de ophoping van schimmeldraden lagen in schimmelkolonies beperken. Bij deze methode konden we de ontwikkeling van bacteriële biofilms op schimmeldraden op verschillende schalen gebruikt zowel LSCM en scanning elektronenmicroscopie (SEM) onderzocht. Dit rapport beschrijft het protocol, met inbegrip van micro-organisme culturen, bacteriële biofilmvorming voorwaarden, biofilm kleuring en LSCM en SEM visualisaties.

Inleiding

Schimmels en bacteriën hebben veel mogelijkheden om te communiceren met elkaar, omdat ze samenwonen in de meeste terrestrische omgevingen. Door hun diversiteit en hun alomtegenwoordigheid, deze interacties zijn belangrijk in vele biologische gebieden, met inbegrip van de biotechnologie, de landbouw, de verwerking van levensmiddelen en medicijnen ^{1, 2.} Moleculaire interacties vereisen een zekere mate van nabijheid van uitwisselingen tussen de partners mogelijk, en in sommige gevallen, een fysische associatie van de partners is noodzakelijk voor een functionele interactie ^3. Een gemeenschappelijke fysische associatie tussen bacteriën en schimmels is de vorming van bacteriële biofilms op schimmels oppervlakken ^4. Deze directe contact tussen bacteriecellen en schimmeldraden maakt intieme interacties die betrokken zijn bij verschillende biologische processen. Bijvoorbeeld, in de geneeskunde, de studie van biofilmvorming van Pseudomonas aeruginosa op in de gelegenheidtunistic schimmel pathogeen Candida albicans kan inzicht in het verband tussen de vorming en de virulentie ⁵ biofilm te bieden. In de landbouw, studies suggereren dat de plantengroei-bevorderende rhizobacteriën en biocontrolebacteriën hebben een verhoogde efficiëntie bij het in verband met een schimmel in een gemengde biofilm. Zo hebben Bradyrhizobium elkanii verbeterd N ₂ -fixing activiteit wanneer geassocieerd met Pleurotus ostreatus in een gemengde biofilm ^6. Ten slotte bioremediatie, bacteriële schimmel- gemengde biofilms zijn gebruikt voor de sanering van verontreinigde plaatsen ^{7, 8.}

LSCM is bijzonder geschikt om biofilms te bestuderen aangezien het voor een drie-dimensionale waarneming van levende gehydrateerd biofilms met minimale voorbehandelingen, waardoor biofilm structuur en organisatie handhaven. Zo biofilm analyse door LSCM is zeer informatief, vooral voor detHermelijn het tijdsverloop van de vorming van biofilm en de detectie van karakteristieke fases ^{9, 10,} van de hechting stap naar de ontwikkeling van een volwassen biofilm. Het is ook bijzonder geschikt voor de biofilmstructuur en matrix ^{11, 12} visualiseren of de biofilm maat ^{13, 14} kwantificeren. Hoewel deze methode is geschikt om biofilms te bestuderen op abiotische of dunne biotische oppervlakken, het bestuderen van bacteriële biofilm op een schimmel draadvormige kolonie is nog steeds erg uitdagend. Inderdaad, de meeste filamenteuze schimmels bouwen dikke, complexe, driedimensionale netwerken in kweek. Zelfs als dikke objecten kunnen worden afgebeeld door confocale microscopie, de verzwakking van de laser penetratie en de fluorescentie-emissie verminderen vaak de kwaliteit van de uiteindelijke beelden gedurende een diepte van 50 urn ^15. Omdat bovendien schimmelkolonies niet star, iHet is moeilijk om de micro-organismen verwerken zonder het verstoren biofilms. Door de dikte van de monsters, worden de weinige microscopische analyses van bacteriële biofilms op schimmeldraden meestal alleen uitgevoerd op een klein deel van de schimmelkolonie derhalve met slechts enkele hyfen ^{16, 17, 18.} Dit alles beperkt ons vermogen om biofilm verdeling beschrijven de schimmelkolonie en dus biases brengen in de analyse bij de heterogene verdeling van de biofilm in de schimmelkolonie.

Om dergelijke moeilijkheden te overwinnen, beschrijven we een werkwijze voor de groei en de analyse van bacteriële biofilm op schimmeldraden. Deze methode werd gebruikt voor de biofilmvorming bestuderen Pseudomonas fluorescens BBc6 de hyfen van de ectomycorrhiza basidiomyceet Laccaria bicolor S238N. Deze twee bos-bodem micro-organismen werden eerder beschreven gemengd te vormenbiofilm-achtige structuren ^{19, 20.} Deze werkwijze kan gemakkelijk verder worden aangepast aan andere filamenteuze schimmels / bacteriële systemen. De hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de combinatie van een schimmel kweekmethode, waardoor de groei van zeer dunne schimmelkolonies met LSCM en SEM beelden. Daardoor konden we micro- (um bereik) te verkrijgen en meso- (enkele mm) schaal uitzicht op de interactie tussen de twee micro-organismen, waardoor de kwalitatieve karakterisering van de biofilm. We toonden ook aan dat de monsters kunnen worden waargenomen met SEM, waardoor structurele analyse van de biofilm op nano-schaal niveau (nm).

Protocol

1. Bereiding van bacteriële en fungale culturen

1. Bereiding van schimmelcultures
   1. Bereid cellofaan membranen met dezelfde diameter als de petrischalen en kook ze in EDTA (1 g / l in gedeïoniseerd water) gedurende 30 min. Spoel de platen met gedemineraliseerd water en autoclaaf ze twee keer.
   2. Bereid een schimmel voorkweek door enten schimmel agar stekkers op de juiste agarmedium bedekt met EDTA voorbehandelde cellofaan membraan. Incubeer in bij de optimale groeitemperatuur van de kolonies ongeveer 1 cm in diameter te verkrijgen.
      1. Voor L. bicolor S238N, incuberen bij 25 ° C gedurende 5 dagen op Pachlewski P5 agarmedium, uit 0,5 g diNH4 tartraat, 1 g KH ₂ PO4, 0,5 g MgSO .7H _{4 2} O, 5 g D + Maltose , 20 g glucose D +, 1 ml 10% thiamine-HCl, 1 ml 1/10 verdunde oplossing micronutriënten (6 g / l ijzersulfaat; 0,27 g / l molybdeen trioxyde; 8,45 g / l boorzuur; 5 g / L manganese sulfaat; 5 g / l cuprisulfaat; 2,27 g / l zinksulfaat) aangevuld tot 1 L met gedeïoniseerd water; en 20 g agar; pH 5,5.
   3. Van de schimmel voorkweek Inoculeer een nieuwe agarplaat bedekt met de EDTA voorbehandelde cellofaan membraan dat een koolstofarme agarmedium de radiale expansie van de kolonies te promoten.
      1. Om de petrischaal te enten, zachtjes krassen op de externe omgeving (waar de cellen hebben dezelfde fysiologische toestand) van een schimmel kolonie uit de pre-culture met een scalpel en breng de schimmeldraden om de nieuwe agar plaat.
      2. Incubeer bij de optimale groeitemperatuur totdat de nieuwe kolonies ongeveer 1 cm in diameter. Voor L. bicolor S238N, incubeer ze op 25 ° C gedurende 5 dagen op P20 agarmedium (0,25 g Dinh ₄ tartraat, 0,5 g KH _{2PO 4,} 0,25 g MgSO _{4 2} .7H O, 1 g glucose D + , 0,5 ml 10% thiamine-HCl, 0,5 ml 1/10 verdunde oplossing micronutriënten (zie 1.1.2.1), aangevuld tot 1 L met gedeïoniseerd water; en 20 g agar; pH 5,5).
         Let op: Als gevolg van de pre-cultuur op de cellofaan, zal de tweede cultuur niet agar media bevatten in de centrale pluggen. De agarproppen moet worden verwijderd voor verdere analyse van de biofilms, aangezien deze pluggen voeren agar en voedingsstoffen die systematische fouten in de analyse kan maken. Deze stap betreft alleen schimmelsoorten die worden gehouden en gekweekt op agarplaten, en het is niet noodzakelijk schimmels die zijn voortgeplant uit sporen of bevroren voorraden.
2. Bereiding van bacteriële culturen
   1. Een steriele lus te verzamelen 2-3 afzonderlijke bacteriële kolonies van een kweek van de geschikte agar medium te inoculeren en 25 ml vloeibare Luria-Bertani (LB) medium (of een ander geschikt medium, afhankelijk van de gebruikte stam). Voor P. fluorescens BBc6, uitbroeden van een kweek gedurende de nacht bij 28 ° C onder voorzichtig schudden (~ 150 rpm).
      Opmerking: Het gebruik van een stamgelabeld met fluorescerend eiwit zoals GFP, de voorkeur, omdat dit vermijdt het uitvoeren van een dubbele kleuring (schimmels en bacteriën) voorafgaande aan microscopische waarneming. De timing, de roersnelheid en de temperatuur van de incubatie afhankelijk van de gebruikte stam, het doel is om een ​​cultuur verkrijgen late exponentiële groei.

2. Bereiding van N in vitro Biofilm Bacteria de schimmelkolonie

1. Centrifugeer de bacteriekweek bij 5000 xg gedurende 3 minuten en suspendeer de pellet in 25 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (25 g / l KH _{2PO 4} en 2,78 g / LK ₂ HPO _4, pH 5,8). Herhaal deze stap eenmaal pas de uiteindelijke bacteriële concentratie 10 ⁹ cellen / ml met dezelfde buffer.
2. Vul een 6-well microplaat met 5 ml van de bacteriesuspensie (of steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer voor de negatieve controle).
3. Snijd het cellofaan membraan van de fungal cultuur met een steriel scheermesje vierkantjes cellofaan te verkrijgen met een schimmel kolonie op elk membraan. Haal het cellofaan pleinen met schimmeldraden van de vaste medium met behulp van een tang en breng het plein van cellofaan met schimmeldraden om een ​​put van de microplaat met de bacteriële suspensie.
4. Schud de microplaat, terwijl de schimmel kolonies nog steeds aan het cellofaan zijn bevestigd; Vervolgens, verwijder het cellofaan vellen, waarbij de schimmel kolonies in de plaat.
5. Incubeer de microplaat zacht schudden (~ 60 opm) bij een temperatuur aangepast aan de onderzochte micro-organismen.
   Opmerking: De incubatietijd afhankelijk van de snelheid van vestiging van de biofilm en de fase te analyseren. Voor P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incuberen bij 20 ° C gedurende 30 min om beginnende biofilms komen en tot 16 uur om volwassen biofilms.

3. laser scanning confocale microscopie Analyse van de biofilm Formation

1. monstervoorbereiding
   1. Om planktonische bacteriën en bacteriën elektrostatisch aan de hyfen en spoel vervolgens de schimmel door deze naar een nieuwe 6-well microplaat gevuld met 5 ml van een sterke zoutoplossing (NaCl, 17 g / l) ^17; schud gedurende 1 min.
   2. Breng de schimmel een nieuwe 6-well microplaat met 5 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer, schud gedurende 2 minuten, en breng de schimmel verse kaliumfosfaatbuffer.
   3. Snijd het deel van de schimmelkolonie af te beelden met een scalpel houd hem in de kaliumfosfaatbuffer, zodat het verkregen gedeelte bevat ongeveer de helft van de schimmelkolonie.
   4. Om het monster vlek, overbrengen naar een petrischaal gevuld met steriel water met een geschikte fluorescerende kleurstof (afhankelijk van het doel van de analyse) en incubeer in het donker.
      1. Schimmelwoekering netwerk visualiseren, gebruikt bijvoorbeeld Congo Red (0,1% uiteindelijke concentration, 5 min incubatie), tarwekiemen agglutin (WGA) lectine geconjugeerd met Alexa Fluor 633 (10 ug / ml eindconcentratie, 10 min incubatie) of FUNC1 (10 uM eindconcentratie, 10 min incubatie).
      2. Als een niet-fluorescerend-gemerkte bacterie, tegenkleuring de bacteriële cellen met een DNA-specifieke fluorescente probe onder de talrijke cel-permeant DNA kleurstoffen handel verkrijgbaar. Gebruik bijvoorbeeld DAPI (0,25 ug / ml uiteindelijke concentratie, 10 min incubatie).
      3. Om de matrix eiwitten te visualiseren, gebruik maken van een eiwit vlek ^21.
   5. Na het kleuren Spoel het monster door deze naar een petrischaal deksel met 10 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaat en schud gedurende 1 min.
   6. Half onderdompelen een dia in de petrischaal deksel en subtiel breng de snede boven de dia te zweven. Dan, langzaam verwijderen van de dia uit de buffer oplossing, waardoor het monster om voorzichtig te vestigen op de dia.
      Opmerking: deze stap is het belangrijk om voorzichtig gaan tot biofilm verstoring te voorkomen.
   7. Tot slot, voeg 10 ul van anti-fading montage medium om het monster en bedek het met een glazen dekglaasje.
      Opmerking: Als de dia wordt bereid, de microscopische analyse worden zo snel mogelijk uitgevoerd (binnen ten hoogste 30 min) tot wijziging van de biofilm niet stevig.
2. Confocale microscopische analyse
   1. Onderzoek de objectglaasjes onder een confocale laser microscoop met 10x of 40X objectief gekoppeld beeldverwerkingssoftware.
      Opmerking: Hier, een multi-beam scanning confocale microscoop met 405, 488 en 561 nm excitatie lasers, een GaAsP PMT-detector en 10x NA 0,3 en 40x NA 1,2 doeleinden gebruikt.
      1. Voeren beeldvorming met parameters aangepast aan het type van de gevraagde data en de tijd bedwingt. Met laser excitatie / emissie golflengten volgens de vlek gebruikt en recommendati de fabrikantons. Gebruik een combinatie van de tegel scan en de Z-stack functies om globale 3D-weergave van de schimmel kolonie en de biofilms te verkrijgen.
         Opmerking: De afbeelding in figuur 3 werden verkregen met de volgende parameters: 8-bit / pixel, gemiddelde = 2, pixelverblijftijd = 1,58 usec, tegels scannen van 5x5 beelden met online stiksel (10% dekking drempel = 0,7); Z-stap = 2 urn.
   2. Voor 3D-data visualisatie, een van de vele gratis of commerciële software (deze bieden veel mogelijkheden voor 3D-rendering).
      1. Als u bijvoorbeeld Z-stack gegevens als 2D maximale intensiteit projecties weer te geven, af te trekken van de bright-field-kanaal, de helderheid en het contrast aan te passen, en kanalen samen te voegen om een ​​samengesteld beeld te creëren. Indien die aanwezig zijn, te elimineren plakken zonder signaal aan de Z-stack uiteinden. Voer vervolgens een 2D maximale intensiteit projectie en zetten het resultaat in RGB kleuren. Gebruik de functie "Z project" in de ImageJ software ²² om de beelden te verkrijgen phier woordigd door 2D maximale intensiteit projecties.

4. Electron Microscopy Analyse

1. Bereid de monsters zoals beschreven voor LSCM, behalve in stap 3.1.2, de biofilms dragen aan steriel water plaats kaliumfosfaatbuffer na het spoelen stappen. Dit voorkomt de vorming van zoutkristallen in de dehydratatiestap, die SEM beeldvorming zou verstoren.
2. Breng de biofilms om een ​​monster houder en verwijder overtollig water; staan ​​alleen een klein vlies van water om het monster te dekken.
3. Breng het monster op de kamer van een variabele druk scanning elektronenmicroscoop (VP-SEM); bevriezen tot -50 ° C op een Peltier koelstap; en laat het langzaam vriesdrogen, direct in het SEM kamer met 100 Pa van variabele druk ingesteld op 15 uur.
4. Na voltooiing van de vriesdrogen, ophalen van de monster en het in een hoog-vacuum film afzettingssysteem. Coat het monster met 2 nm van geplatim (kwarts meting) onder argon plasma (2,5 x 10 ^-2 mbar, 35 mA).
5. Let op de gecoate monster met een SEM uitgerust met een veld emissie pistool (FEG) met de hoge resolutie "in lens" detector en een elektronisch hoge spanning van 1 kV.

Resultaten

De algemene schematische procedure van fungale cultuur biofilm bereidingswijze is aangegeven in figuur 1. De kweekmethode liet ons toe om schimmel kolonies 20 tot 50 urn dik met een paar lagen van schimmeldraden, waardoor micro- en meso-schaal analyses van gehydrateerde levende biofilm met behulp van LSCM verkrijgen. De toepassing van de methode is toegestaan de overname van beelden van hoge kwaliteit van P. fluorescens BBc6 biofilms op L. bicolor schimmeldraden langs de vorming van de biofilm (figuren 2-4).

De mesoschaal analyse van de biofilms toonde de heterogene verdeling van de biofilm P. fluorescens BBc6 de hyfen van L. bicolor S238N (figuren 2 en 3). Meso-schaal analyse ook toegestaan voor het volgen van de vorming van biofilm in de tijd (Figuur3) vanaf de eerste stappen, waarin slechts sommige bacteriën werden vastgemaakt aan hyfen (figuur 3a), de vorming van een dikke, volwassen biofilm (figuur 3b). De hoge resolutie van de mesoschaal beelden konden we micro-schaal analyse uit te voeren op dezelfde beelden om de kolonie architecturen (Figuur 3c - d) te verkrijgen.

De micro-schaal analyse in combinatie met de specifieke etikettering stelde ons in staat om een ​​stap verder te gaan in de biofilm karakterisering. Hier, SYPRO Ruby ^23, die de meeste klassen labels eiwitten, werd toegepast op de monsters (Figuur 4) en geeft de aanwezigheid van eiwitten in de matrix.

Tenslotte verdere details van de biofilmstructuur werden verkregen door SEM beelden van hetzelfde monster na dehydratatie en bekleding (Figuur 5). SEM beeldvorming verschafttoegang tot de nanoschaal niveau, waardoor de toegang tot de matrixstructuur geven.

Figuur 1: Algemeen schema procedure van schimmel cultuur en biofilm voorbereiding. Deze figuur beschrijft de belangrijkste stappen van de werkwijze van micro-organismen kweken analyses proeven. Meer details worden gegeven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: BBc6 biofilm verdeling op de schimmelkolonie. Het monster werd in beeld gebracht na 18 h interactie op 10X vergroting. Het beeld werd verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. De grijze raster op het Figure toont het mozaïek posities. L. bicolor hyfen worden gekleurd met Congo Red (rood) en bacteriën zijn GFP-tag (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vroege en late stadia van BBc6 biofilm formatie op L. bicolor schimmeldraden. Dit beeld werd verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. Beeldvorming werd uitgevoerd bij 40x vergroting. (A) biofilms verdeling na 2 uur van interactie. (B) Biofilm verdeling na 14 uur van interactie. (C) Uitbreiding van de witte rechthoek in (a). (D) De uitbreiding van de witte rechthoek in (b). Schimmeldraden zijn gekleurd met Congo rood (rood) en bacteriën GFP-tagged (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Matrix kleuring van BBc6 biofilm op L. bicolor schimmeldraden. (A) biofilms na 16 h interactie. (B) de uitbreiding van de witte rechthoek in (a). Beeldvorming werd uitgevoerd bij 40x vergroting, en deze beelden werden verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. Bacteriën zijn GFP-tag (groen), is schimmel gekleurd met fun1 (donkergroen), en de eiwitten worden gekleurd met S. Ruby (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: SEM beeldvorming van BBc6 biofilms op L. bicolor schimmeldraden. SEM Beeldvorming werd uitgevoerd bij 2360X, EHT: 1kV. Voor de beeldvorming, het monster langzaam gevriesdroogd in de SEM kamer en bekleed met platinum. Groene pijlen wijzen naar bacteriële biofilms en gele pijlen wijzen naar schimmeldraden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Bacteriële biofilms worden opgehaald in veel omgevingen en zijn onderzocht sinds de jaren 1950, leidt tot de ontwikkeling van een aantal werkwijzen om ze ²⁴ te analyseren. Klassieke methoden te kwantificeren en te controleren biofilms onder meer micro-titer assays en, het meest gebruikte methode, crystal violet (CV) kleuring. Deze methoden zijn snel, goedkoop en gemakkelijk te hanteren en ²⁵ zijn bijzonder nuttig aan totale biofilm biomassa kwantificeren of levensvatbaarheid en kwantificatie matrix assays. Op een andere kant, "omics" werkwijzen zijn eveneens nuttig bij biofilm studies, waardoor kwantitatieve en functionele analyse van biofilms ^{26, 27.} Ondanks de voordelen van micro-titer plaat en 'omics' methoden, kan een aantal essentiële kenmerken van biofilms niet worden vastgelegd met deze technieken, belemmeren een volledig begrip van dit proces. Dergelijke functies zijn onder meer matrixstructuurs, bacteriële kolonie architecturen cel / cel-interacties, en kolonisatiepatronen die sleutelgegevens voor het begrijpen van zowel de werking van biofilms en de dynamiek van hun vorming zijn. Ondanks het vermogen van microscopie deze functies vangen, microscopie analyse van bacteriële biofilms op filamenteuze schimmels nog schaars. Dit komt vooral door de groei van draadvormige schimmels, die vaak vormt kolonies dikke, complexe, driedimensionale netwerken. Vorming van bacteriële biofilms op schimmels is gebruikelijk in diverse omgevingen en wordt sterk betrokken bij diverse gebieden ⁴ (bijvoorbeeld, geneeskunde, landbouw en milieu.); derhalve is het essentieel om nieuwe methoden voor het onderzoek te vergemakkelijken. Hiervoor combineerden we een methode om zeer dunne schimmelkolonies microscopische beeldvorming van de bacteriële biofilms genereren. Daarnaast stelden we een set van microscopie tools waarmee kwalitatief te analyseren die biofilms. Het succes van de werkwijze berust ophet vermogen om zeer dunne hyfen kolonies produceren en passende kleurstoffen toegepast. Deze punten worden hieronder besproken.

Wegens de complexe structuur van de biofilms, het begrijpen van hun functie vereist een meerschalige benadering ^{28, 29.} Distributie patronen van de biofilms, bacteriële kolonie architectuur, en de matrix-structuur en samenstelling worden geanalyseerd op verschillende schalen (dwz, meso-schaal en de micro-schaal). Bovendien nanoschaal resolutie biedt toegang tot de cel / cel fysieke interactie en de nano-structuur van de matrix. Aldus ontwikkelde methode kan gemakkelijk een meerschalige analyse van de bacteriële biofilms gevormd op de schimmelkolonie.

In de meeste studies LSCM analyses van biofilms zijn beperkt tot de micro-schaal de mesoschaal gewoonlijk uitgevoerd door optische coherentie tomografie ^{30, 31,} 32. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk zowel micro- en meso-schaal analyses door LSCM. Het toont de bruikbaarheid van combinatie van beide analyses in hetzelfde gebied van het monster en zelfs op dezelfde afbeelding met nieuwe generatie confocale microscopen met hoge resolutie (Figuur 3). Dus, kwesties in verband met verzamelde gegevens verzameld op verschillende schalen met verschillende methoden hier worden vermeden.

Deze combinatie van analyse gaf gelijktijdig toegang tot de biofilm verdeling over de schimmelkolonie de bacteriële kolonie architectuur langs de ontwikkelende biofilm en de matrixstructuur. De mesoschaal analyse toonde een heterogene verdeling van de bacteriële biofilms op de schimmelkolonies (figuren 2 en 3). Deze observatie zou niet mogelijk zijn met protocollen die slechts beeldvorming van een klein gedeelte van de schimmelkolonie, die niet noodzakelijkerwijs representatief voor het gehele kolonie mogelijk. Dus, terwijlvaak verwaarloosd, het meso-schaal analyse kan waardevolle informatie over biofilm distributie patronen geven.

Tenslotte kan de ontwikkelde methode worden gebruikt om monsters met verschillende microscopische technieken, waaronder scanning elektronenmicroscopie geanalyseerd. Hier, SEM werd gebruikt om de nano-schaal te bereiken en om de bacteriële ruimtelijke organisatie in de biofilm verkrijgen. Het presteerde zeer goed met de dunne schimmel kolonies, terwijl de SEM alleen toegestaan ​​beeldvorming aan het oppervlak. In tegenstelling tot LSCM, SEM echter vereist steekproef uitdroging en, meestal, bekleden met een geleidend metaal. Dit droogproces kan biologische structuren veranderen als het niet goed is uitgevoerd en kan optimalisatie nodig. Hier, steekproef uitdroging langzame vriesdrogen werd gebruikt ^33. Niettemin toepassing zowel LSCM SEM en de monsters zullen de prestaties van correlatieve microscopie op dezelfde plaats van het monster mogelijk.

Ondanks de voordelenhierboven beschreven, bestaan ​​enkele beperkingen. Ten eerste kan het niet voor alle soorten schimmels. Inderdaad is deze kweken methode ontwikkeld om schimmels verspreiden radiaal op het oppervlak van de vaste media. Deze methode niet geschikt voor het vormen van schimmels voornamelijk lucht hyfen (bijvoorbeeld Fusarium sp.) Of micro-aerobe schimmels verspreiden hoofdzakelijk binnen agar. Bovendien kunnen schimmels verval cellofaan ook problematisch zijn (bijv., Trichoderma sp.). Ten tweede is het belangrijk op te merken dat de kleuring strategie is een kritisch punt en de keuze van de vlek moeten zorgvuldig worden gemaakt, omdat de vlek de biofilm niet mag verstoren. Zo hebben we geconstateerd dat Calcofluor White veroorzaakt gedeeltelijke biofilm verstoring (gegevens niet getoond), waarschijnlijk vanwege de hoge pH van deze kleurstof. Ook sommige kleurstoffen verkregen heterogene kleuring (bijv., Congo rood), terwijl andere geproduceerde homogene kleuring (bv., Celwand kleuring met lectine WGA), waardoor een heterogene beeldkwaliteit.Bovendien is het belangrijk te weten dat sommige kleurstoffen niet helemaal specifiek kunnen zijn. Bijvoorbeeld, WGA vlekken niet alleen schimmel celwanden, als N-acetylneuraminezuur in gram-positieve bacteriële celwanden en adhesinen geproduceerd door Gram-positieve en -negatieve bacteriën tijdens biofilmvorming ^{34, 35.} Daarom worden bij fluorescerend eiwit hebben bacteriën en / of schimmels wordt aanbevolen om meerdere vlekken voorkomen. Als meerdere kleurstoffen worden gebruikt, moeten deze niet chemisch interfereren en hun emissiespectra overlappen niet.

Mesoschaal analyses vereisen een groot scangebied, en daarom kan LSCM tijdrovende (40 min tot 1 uur, afhankelijk van het monster dikte) en knelpunt de analyse van een groot aantal monsters. Desalniettemin kunnen aanpassingen worden aangebracht, afhankelijk van het type gegevens vereist. Het is mogelijk acquisitietijd en het verkleinen van het veranderen van de beeldkwaliteit. Bijvoorbeeld, hoge resolutieis niet nodig om de biofilm algemene verdeling analyseren.

Ten slotte moet een aantal beperkingen te worden overwogen bij de keuze om Z- stack gegevens als 2D of 3D projecties weer te geven. Tweedimensionale projecties zijn een goede manier om gegevens samen te vatten, maar diepgaande informatie verloren gaat, en overlappende structuren worden verborgen. Aan de andere kant, 3D-projecties laat de visualisatie vanuit verschillende standpunten, maar ze maken vaak slecht in het geval van ruimtelijke complexiteit.

Concluderend, hebben wij een werkwijze voor de karakterisering van bacteriële biofilms op hyfen op structureel niveau gerapporteerd. De methodologie kan worden uitgebreid tot andere toepassingen. Inderdaad, maakt deze werkwijze het uitvoeren van functionele of chemische karakterisering van bacteriële biofilms vormen op schimmeldraden. Vanwege de grote verscheidenheid aan fluorescerende reporter bestaande systemen kunnen LSCM analyse worden gebruikt voor meerdere doeleinden ^29. Bijvoorbeeld, de fluorescentie microscopy kan worden gebruikt om de pH gradiënt ³⁶ of molecuul diffusie in biofilms ³⁷ volgen. Daarnaast is de methode maakt het mogelijk voor de gemeenschap analyse multispecies biofilms. Bijvoorbeeld, fluorescentie in situ hybridisatie gericht op specifieke bacteriële groepen is bijzonder nuttig om specifieke bacteriële verdeling bestuderen meerdere soorten biofilms ^{38, 39.} Ten slotte talrijke fluorescente kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de matrix van de samenstelling biofilms ²¹ karakteriseren. Hier werden eiwitten gevist met Sypro, die een groot aantal eiwitten, waaronder matrixeiwitten vlekken (figuur 4), maar ook andere kleurstoffen mogelijk maken de visualisatie van andere belangrijke matrix componenten, zoals exopolysacchariden of extracellulaire DNA. Interessant zouden al deze analyses worden uitgevoerd op mesoschaal met de beschreven werkwijze. Omdat LSCM kunnen worden uitgevoerd op levende samples,Het is ook mogelijk om time-lapse imaging realiseren met bijvoorbeeld coverwell kamers, bijzonder geschikt voor dunne schimmelkolonies. Deze optie is met name interessant, omdat biofilmvorming is een complex, dynamisch proces. Tenslotte een kwantitatieve doel, de gerapporteerde werkwijze kan de nauwkeurigheid van automatische kwantitatieve analyse verbeteren door kwantificering mogelijk mesoschaal beelden. Dit kan biofilm heterogeniteit en statistische kwesties ²⁹ overwinnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6 well Falcon Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	08-772-33	Gebruikt in 2.2 & 3.1
Congo Red	Fisher Scientific	C580-25	Gebruikt in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain	Thermo Fisher Scientific	F7030	Gebruikt in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W21404	Gebruikt in 3.1.4.1
DAPI solution	Thermo Fisher Scientific	62248	Gebruikt in 3.1.4.2
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	Gebruikt in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain	Thermo Fisher Scientific	F10318	Gebruikt in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01	Gebruikt in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		Gebruikt in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software	Zeiss		Gebruikt in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600	Leica		Gebruikt in 4
GeminiSEM-FEG	Zeiss		Gebruikt in 4