Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Samenvatting

Fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie van specifieke biomoleculen in cellen. Voor conventionele fluorescentiemicroscopie de ruimtelijke resolutie beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak en> 500 nm langs de optische as. Daardoor fluorescentiemicroscopie al lang ernstig beperkt in de waarneming van ultrastructurele kenmerken in cellen. De recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie methoden heeft deze beperking te omzeilen. Met name de komst van photoswitchable fluoroforen maakt lokalisatie-based super resolutie microscopie, die oplossend vermogen het naderen van de moleculaire lengte schaal biedt. Hier beschrijven we de toepassing van een drie-dimensionale super-resolutie microscopie methode op basis van single-molecule lokalisatie microscopie en multifase interferometrie, genaamd interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM). Deze methode biedt bijna isotrope resolutie over deorde van 20 nm in alle drie dimensies. Protocollen voor het visualiseren van de filamenteuze actine cytoskelet, waaronder prepareren en de werking van het instrument iPALM, worden hier beschreven. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aan te passen en leerzaam voor de studie van andere ultrastructurele functies in cellen.

Inleiding

De visualisatie van complexe celstructuren is al lang een integraal onderdeel van de biologische inzichten en ontdekking. Hoewel fluorescentie microscopie afbeeldingscellen met hoog moleculair specificiteit, het oplossend vermogen wordt beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak (x, y, of dwarsafmeting) en> 500 nm langs de optische as (z of axiale afmeting) ^1,2. Vandaar dat de observatie van ultrastructurele kenmerken van oudsher beperkt tot elektronenmicroscopie (EM). Gelukkig heeft de recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie deze limiet omzeild, waardoor ruimtelijke resolutie in de 10-100 nm ^1-6. In het bijzonder, benaderingen super resolutie op basis van één molecuul lokalisatie, bekend onder acroniemen zoals PALM (Photoactivated Localization Microscopy) ^4, FPALM (Fluorescence Photoactivated Localization Microscopy) ⁵ (d) STORM (direct Stochastic Optical Wederopbouw Microscopy) ^6,7, PAINT ( point accumulatie for Imaging Nanoscale Topografie) ^8, GSDIM (grondtoestand Uitputting Microscopy, gevolgd door individuele moleculaire return) ⁹ of SMACM (single-molecule Active-Control Microscopy) ^10, evenals hun 3-dimensionale (3D) implementaties, zoals interferometrische PALM (iPALM) ¹¹ of 3D-STORM ^12, zijn waardevol in het onthullen van nieuwe inzichten in de nanoschaal organisatie van een groot aantal biologische structuren, met inbegrip van neuronale axonen en synapsen ^13, focale adhesies ^14,15, cel-cel kruispunten ^16, nucleaire poriën ¹⁷ en centrosomes ^18-20, een paar te noemen.

Een andere ultrastructurele functie in cellen voor die super-resolutie microscopie is potentieel bruikbaar is het actine cytoskelet. Het complex maaswerk van filamenteuze (f) actine in de cel cortex speelt een essentiële rol in de controle van celvorm en mechanische eigenschappen ^21. De organisatie of f-actine wordt actief en dynamisch geregeld al tal van regulerende eiwitten die sterk beïnvloeden polymerisatie, verknoping, omzet, stabiliteit en netwerktopologie ^22. Hoewel de karakterisering van F-actine maaswerk architectuur is belangrijk mechanistische inzichten in een diversiteit aan cellulaire processen, de kleine (~ 8 nm) van de f-actine filamenten belemmert de waarneming door gebruikelijke buigingsbegrensde lichtmicroscopie; dus de visualisatie van actine fijne structuur tot nu toe uitsluitend uitgevoerd door EM. Hier beschrijven we protocollen voor het visualiseren van de f-actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen, met behulp van de iPALM super resolutie microscopie techniek om te profiteren van de zeer hoge precisie capaciteit te nemen in 3D ^11,23. Hoewel de iPALM instrument sterk gespecialiseerd heeft instructies over het opzetten van een dergelijk instrument is beschreven onlangs ^23, terwijl de toegang tot de iPALM microscoop georganiseerd door de Howard Hughes Medical Institute is ook ter beschikking gesteld van de onderzoeksgemeenschap met minimale kosten. Bovendien, het prepareren hierin beschreven werkwijzen zijn direct toepasbaar op alternatieve 3D superresolutie benaderingen, zoals die gebaseerd op astigmatisch onscherpte in de puntspreidingsfunctie (PSF) ¹² of bi-plane detectie ^24, die breder beschikbaar zijn.

We merken op dat een noodzakelijk ingrediënt voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie in het algemeen is de photoswitchable fluorofoor ^25, waarin de drie kritische eisen voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie maakt het mogelijk moet worden voldaan: i) high single-molecule helderheid en contrast ten opzichte achtergrondsignalen; ii) spaarzame distributie van enkele moleculen in een gegeven beeldframe; en iii) hoge ruimtelijke dichtheid etikettering voldoende om het profiel van de onderliggende structuur (ook bekend als Nyquist-Sha vangennNiet sampling criterium) ^26. Zo bevredigende resultaten nadruk liggen eveneens op zowel de goede voorbereiding van monsters geplaatst fluorofoor photoswitching optimaliseren en de onderliggende ultrastructuur behouden, evenals de instrumentatie en verwervingsprocessen van de experimenten.

Protocol

1. Imaging Specimen Voorbereiding

1. Sinds achtergrond fluorescentie signalen interfereren met fluorescentie van fluorofoor labels, het reinigen van de coverglasses door ze eerst in gedeïoniseerd water spoelen (DDH ₂ O) en vervolgens aan de lucht drogen ze met behulp van perslucht. Vervolgens voeren plasma-etsen in een plasma reiniger voor 15 sec of langer indien nodig.
2. Om drift correctie en iPALM kalibratie mogelijk te maken, gebruiken # 1.5 round (22-mm diameter) pre-gereinigd coverglasses ingebed met fluorescerende nanodeeltjes als vaste merktekens, die als zeer fotostabiele fiducials voor een betrouwbare calibratie en drift correctie dienen. Vanwege de lange acquisitietijd dienen een voldoende dichtheid fluorofoor accumuleren (> 15-30 min), sample drift onvermijdelijk.
3. Plaats elke fiducialed dekglaasje in een 6-well weefselkweek plaat. Gesteriliseerd door ultraviolette (UV) straling in een laminaire stroming kap voor 15 minuten.
4. In een steriele laminaire stroming kap, voor te bereiden fibroNectin oplossing dekglaasje coaten door verdunnen van 1 mg / ml fibronectine voorraadoplossing in steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) tot een eindconcentratie 2-10 ug / ml. Spoel elk dekglaasje drie keer met DPBS en geïncubeerd met 2 ml van de fibronectine oplossing overnacht bij 4 ° C. Vervolgens, zuigen de fibronectine-oplossing en een keer spoelen met DPBS.
5. Spoel de cellen kort met DPBS. Incuberen met 1 - 2 ml trypsine gedurende enkele minuten bij 37 ° C totdat de cellen los en blussen met ~ 10 ml vers serumhoudend celkweekmedium. Bijvoorbeeld, voor humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), gebruiken grote vaten endotheliale kweekmedium aangevuld met grote vaten endotheliale factoren en penicilline en streptomycine.
   1. Replate de cellen op de met fibronectine gecoate dekglaasje (voor ijle dichtheid, plaat <50.000 cellen per dekglaasje) en onderhouden van de cultuur in een incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% _CO2 en 37 & #176; C.
6. Voor een goede bewaring van de fijne structuren van F-actine cytoskelet Gebruik bufferoplossingen basis van Good's buffer ²⁷ reagentia.
   1. Zij bijvoorbeeld PHEM buffer als 2x voorraadoplossing (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM _MgCl2, pH 7,0 met KOH) door het oplossen van 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA en 190 mg _MgCl2 in ~ 300 ml DDH ₂ O, met de pH aangepast tot 7,0 door druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde KOH-oplossing; vervolgens toevoegen DDH ₂ O om het volume op 500 ml te brengen. Steriliseer het buffer met een 0,22 urn filter, opslaan bij 4 ° C, en verdun het 1: 1 met DDH ₂ O voor gebruik.
7. Voor de beste resultaten met een hoge dichtheid kenmerken van f-actine, gebruik falloïdine geconjugeerd met organische fluoroforen, zoals Alexa Fluor 647. Op het gewenste tijdstip na cel replating, zet de cellen als volgt:
   1. Zuig het medium van elke cultuur putje met de cell exemplaar. Voorzichtig maar snel afzien 2 ml warm (37 ° C) extractie fixatieven die 0,25% glutaaraldehyde in PHEM-buffer met 0,25% Triton X-100. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 min. Voor daaropvolgende stappen gebruikt 2 ml lijm of blussen buffer per dekglaasje, tenzij anders aangegeven.
   2. Vervang het fixeermiddel extractie met een 2,5% glutaaraldehyde fixeermiddel in PHEM-buffer en laat de monsters incubeer gedurende 10 - 12 min. Dit en volgende stappen worden allen in kamertemperatuur.
   3. Aspireren de fixatieven en voorzichtig te vervangen door PHEM buffer. Tilt en werveling zacht, en dan weer wassen met PHEM. Herhaal dit twee keer.
   4. Om autofluorescentie van glutaaraldehyde, die signalen van de gewenste fluoroforen kunnen overweldigen, incubeer de monsters met een vers bereide quenching buffer met _NaBH4 in een massaconcentratie van 0,1% in PHEM blussen. Profuse belletjes zal worden waargenomen. tikt u zo nu en dan het monster schotel voorzichtig aan op dislodge de bubbels. Laat het incubeer gedurende 5-10 min.
   5. Aspireren uit het doven buffer en voorzichtig te vervangen door PHEM buffer. Spoel een paar keer om de bubbels weg te ruimen. Pipet 2 ml PHEM buffer en laat het incubeer in het donker gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer en laat het monster rust in PHEM buffer als u klaar bent.
   6. Bereid een vochtige kamer voor Phalloidin incubatie met behulp van een grote plastic petrischaal opgevuld met een stuk papier handdoek royaal bevochtigd met 5-10 ml van DDH ₂ O. Leg een groot vel schone Parafilm bovenop het natte papieren handdoek.
   7. Vanwege de relatief hoge kosten van gelabelde phalloidin met een kleine volume per labeling. Voor de etikettering hoge dichtheid, te beginnen met een concentratie van 0,3 uM. Bereid ~ 60 ul per dekglaasje behulp falloïdine-Alexa Fluor 647 in PHEM-buffer.
   8. Pipette 55-60 ul van de phalloidin oplossing op de Parafilm blad in de vochtige kamer. Met behulp van fijne tang, verwijder voorzichtig het monster covergdeerntje. Wees voorzichtig om op te merken de juiste-cel met gezicht.
   9. Snel en zachtjes tikken overtollige buffer door het aanraken van de rand van het dekglaasje met een opgevouwen stuk delicate absorberend papier, en plaats dan de dekglaasje cel kant naar beneden op de druppel phalloidin oplossing op de Parafilm. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen door de dekglaasje.
   10. Plaats het deksel op de vochtige kamer. Wikkel de kamer in aluminiumfolie om deze te beschermen tegen omgevingslicht, en laat het monster incubeer overnacht bij 4 ° C. Het monster kan in deze toestand gehouden gedurende enkele dagen. Zorg ervoor dat de vochtige kamer blijft vochtig als lange bewaring wordt gepland.
8. Voorafgaand aan beeldvorming plaats voorzichtig het dekglaasje cel naar boven op een nieuwe 6-well plaat met 2 ml PHEM buffer per putje.
9. Bereid zuurstof weggevangen-thiol-based imaging buffers met behulp van de volgende stockoplossingen: 1 M glucose, 1 M cysteamine en 100x glucoseoxidase / catalase enzym mixture (4 mg katalase en 10 mg glucoseoxidase in 100 pl buffer PHEM, en door vortexen gemengd) ^28. Vlak voor imaging, meng 75 ul van 1 M glucose-oplossing, 30 ul van 1 M cysteamine-oplossing, en 3 pl 100x voorraad enzymmengsel. Zet het volume op 300 pi met PHEM buffer en gebruik onmiddellijk na het mengen om het monster te monteren.
10. Voor iPALM, de voorbereiding van de beeldvorming monster met behulp van een vooraf gereinigd # 1.5 dekglaasje (22-mm diameter).
    1. U kunt ook gebruik maken van een glasplaatje (3 "x 1") met een dubbelzijdige kleefband spacer om te helpen bij de assemblage if-astigmatisme gebaseerde 3D-STORM ¹² is in plaats daarvan worden gebruikt.
    2. Om de beeldvorming monster samen te stellen, gebruik fijne tang om voorzichtig verwijderen van het monster dekglaasje uit de buffer ook. Dan, snel en zachtjes tikken overtollige buffer door het aanraken van de rand van het dekglaasje met gevouwen absorberend papier.
    3. Plaats het dekglaasje cel kant naar boven op een stuk van schone lens papier. Spoel het monsterdoor het plaatsen van 30-50 ul van imaging buffer op het monster, en verwijder overtollig buffer door het kantelen en te tikken met gevouwen absorberend papier.
    4. Herhaal het spoelen stap een paar keer, en plaats dan 30-50 ul van imaging buffer op het monster. Blot droog de rand van het dekglaasje en plaats van meerdere kleine puntjes van snel uithardende epoxy op de gedroogde gebied.
    5. Langzaam lager andere vooraf gereinigd # 1.5 dekglaasje (normaal, rond dekglaasje, 18-mm diameter) op het midden van de celbevattende 22 mm dekglaasje. Laat de imaging buffer nat zowel coverglasses door capillaire werking. De kleine puntjes van snel uithardende epoxy moeten zich houden aan beide coverglasses.
    6. Druk voorzichtig op de verzamelde monster met behulp van gevouwen absorberend papier om de druk gelijkmatig verdeeld. Gebruik voldoende druk om de monstercel dun en zelfs (<15 pm), maar niet zo veel als de cellen verpletteren. Peilen naar de juiste dikte door het observeren van de Newton's ringen patroon. Zorg er ook voor om deze st uit te voerenep voorzichtig om luchtbellen te minimaliseren. Indien nodig, oefenen met lege coverglasses meerdere malen op voorhand.
11. Verzegelen van het monster met gesmolten vaseline-lanoline-paraffine (valap, stock bereid van 100 g elk van vaseline, lanoline, en paraffine, smolt samen) ^29, spoel de verzegeld monster met DDH ₂ O, en blaas droog met perslucht. Het monster is nu klaar voor montage op de microscoop voor beeldvorming.

2. Sample Placement en iPALM Alignment

1. Verplaats de veerbelaste top objectieflens omhoog zodat de verwijdering van de monsterhouder. Plaats de verzegelde monster bereid in stap 1.10 op het monster houder en bevestig met een aantal kleine zeldzame aardmetalen magneten. Toepassen immersie olie aan weerszijden van de imaging monster. Het monster houder terug in het optische pad en laat de top objectief.
2. Schakel de excitatie lasers. Zet de Electron vermenigvuldigen Charge-Coupled Device (EMCCD) camera in frame-transfer mode.
   1. Draaien in de juiste emissiefilters. Activeer een mechanische sluiter aan de bovenbalk pad (Figuur 1A) te blokkeren en open de onderbalk pad. Breng de onderste objectief in beeld door translatie in kleine stappen met behulp van de piëzo-actuator.
   2. Zodra het referentiemerkteken is scherpgesteld, open de stralengang tijdens blokkeren van de onderbalk weg en breng de bovenste objectieflens scherp op soortgelijke wijze. Bewaken van de breedte van het referentiemerkteken op het beeldscherm voor optimale scherpstelling.
3. Voor een goede centratie, geopend zowel de bovenste en onderste balk paden. Stel handmatig boven objectieflens terwijl de onderste doel constant gehouden met behulp van een paar microfijne stelschroeven totdat de vaste beelden zo dicht mogelijk overlappen, idealiter binnen één pixel.
   1. Vervolgens voeren fijne aanpassingen, zodat de vaste beelden in stap 2.3 overlap binnen een tiende van een EMCCD pixel. Pas de top2-as-piezo gemonteerde spiegels via de besturingssoftware terwijl zowel objectieve lenzen en de onderkant reflectie spiegels constant. Vergelijk de middelpunten van de ijkpunten van de bovenste en onderste doelstelling uitzicht via het beeldscherm om het proces te begeleiden.

3. Kalibratie van de iPALM Setup

OPMERKING: Aangezien fluorescentie-emissie is incoherent voor inmenging in iPALM worden waargenomen lengtes het pad door de bovenste en onderste doelstellingen moeten dicht bij elkaar, binnen enkele micron. Dit kan als volgt worden bereikt:

1. De lasers op de camera continu streaming, en zowel de bovenste en onderste stralengangen geopend, oscilleren de monsterhouder z-piëzo met een sinusvormige golfvorm gegenereerd door de besturingssoftware voor een continue z-as oscilleren over een omvang van 400 nm .
2. Door gebruik te maken van het feit dat, wanneer u niet op optimale afstemming, de vaste intensiteit varieert weinig met tHij oscillatie handmatig gemotoriseerde bundeldeler samenstel vertalen omhoog of omlaag tot de intensiteit van de vaste oscilleert door de gewenste enkel-foton interferentie effect. Dit betekent de nauwe afstemming van de lengtes optische pad. Een piek-tot-dal-verhouding van> 10 kan op optimale geval (figuur 1D).
3. Om ervoor te zorgen dat zowel de amplitude en fase bij elk oppervlak zo uniform mogelijk over het veld, aan te passen aan de onderkant spiegel van de bundelsplitser assemblage in kleine stapjes te fine-tunen van de kloof en de kantelhoeken. Voer bundelsplitser fijne afstemming van het monster in 8 nm z-stappen vertalen van meer dan 800 nm.
   1. Bewaak de vaste sterkte tussen camera # 1 - 3. Regel de hoogte, positie en kanteling van de onderste spiegel binnen de bundeldeler samenstel in kleine stappen, zodanig dat de oscillatie fase van camera # 1 ten opzichte camera # 2 is gemaximaliseerd, idealiter bij 120 ° (Figuur 1B-D).
   2. Zodra de eersteuitlijning voltooid, vertalen het monster te scannen naar een geschikt gebied van mening dat beide cellen om het beeld en meerdere fiducials nabijgelegen bevat. Plaats een omheining rond het systeem om strooilicht en ambient verstoringen te blokkeren. Zodra de beeldvorming gebied is gevonden, voert u de procedure in stap 3.4 weer, en noteer de kalibratiecurve voor gebruik in de daaropvolgende z-coördinaat extracties met het commando "Verwerven Calibration Scans vs Sample Piezo Position" in het hoofdmenu.

4. Data Acquisition

1. Zodra een gewenste gebied wordt gevonden en de kalibratiekromme wordt verkregen, voert u de juiste bestandsnamen in de software. Open zowel de bovenste en onderste balk paden. Verhoog de excitatie energie van de 642-nm laser maximum. Voor Alexa Fluor 647, kan een eerste periode van fluorofoor uitschakelen nodig (Figuur 2A).
   1. Expose met een constante 642 nm-excitatie gedurende 5 minuten of langer indien nodig, tot single molecuul knipperen waargenomen (figuur 2B). De software maakt een automatische toename van 405-nm photo activatie tijdens de overname. Grote aantallen van verwerving frames zijn meestal vereist voor draadvormige functies om duidelijk zichtbaar zijn (> 50.000 frames). Als u klaar bent, begint het verwerven van grondstoffen afbeelding sets met de opdracht "Start iPALM Acquisition" in het hoofdmenu.
2. Tijdens de overname tunen fotoactivatie gecorrigeerd tot de intensiteit van de 405-nm laser om de juiste knipperende dichtheid handhaven nodig (zie voorbeelden in figuur 2B).
   LET OP: Als de overname is afgerond, zal de software automatisch de beeldbestanden om te zetten in de juiste binair formaat. De dataopslag in de berekening server is aangebracht als een netwerkstation, waardoor gegevens daar direct worden gekopieerd voor verdere verwerking.

5. Data Processingen Analyse

1. Voeren lokalisatie analyse met een speciaal ontwikkelde software best-fit parameters extract voor individuele moleculen en voor de fiducials ^11,15,23. Dit levert niet alleen de x, y-coördinaat, maar ook de intensiteit die wordt gebruikt voor de kalibratie curve analyse.
   1. Importeer de ruwe kalibratie data verkregen in stap 3.5 met behulp van het commando "Extract Peaks Meerdere labels" onder het menu "Bestand" om de single-molecule lokalisatie uit te voeren. Na de eerste lokalisatie analyse coördinaten verkregen van camera # 1-3 aanwezig in rode, groene en blauwe kanalen, respectievelijk, en kan in worden opgeslagen voor verdere analyse met het commando "(.sav) Tenzij verwerkt als IDL" het " file menu ".
2. Om gegevens van camera's # 1 te brengen - 3 in de registratie met behulp van de fluorescerende fiducials ingesloten op de dekglaasjes, selecteert een aantal felle fiducials om de dekking van het centrale beeld te bieden (bijvoorbeeldFiguur 1B) met behulp van het commando "Anchor Fiducial Points" onder het menu "Image Transformaties". Gebruik de drievoudige sets lokalisatiecoördinaten van camera's # 1 - 3 verkregen uit de heldere ijkpunten in stap 5.1 de rotatie en schaling matrix die brengt camera's # 1 en # 3 in register met camera # 2 te berekenen. Met een voldoende groot aantal fiducials kunnen hogere orde polynoom kromtrekken worden uitgevoerd beter past.
3. Zodra de transformatiematrix wordt berekend, transformeren de ruwe gegevens van camera # 1-3 tezamen met de gesommeerde ruwe data te verkrijgen. Voer een nieuwe ronde van lokalisatie analyse om een ​​nauwkeuriger x opleveren, y-coördinaat en de relatieve bijdrage van elke camera kanaal om de opgetelde ruwe data te bepalen; Gebruik de opdracht "Transform Rauw, Save en Save Sum (.dat)" onder het menu "Beeld Transformaties". Dit intensiteitsverhouding bevat de z-coördinaten.
4. Kies een heldere de vaste en uit te voeren z-kalibratie montage met de functie "Test Punt van de wind 3D" in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies". Dit past 3-sinusoïdale functies om de intensiteiten van de 3 camerakanalen om de kalibratiecurve te bepalen. De kalibratie-bestand wordt vervolgens opgeslagen voor verder gebruik op de belangrijkste datasets.
5. Om de kwaliteit van de kalibratiecurve testen uitvoeren z-coördinaat extractie, zoals eerder ²³ beschreven. Voor goed gedragen fiducials in een goed gekalibreerd systeem moet de z-coördinaat lineaire schaal, aangezien de calibratie datasets worden genomen met een lineaire zwaai in z-positie. Bovendien moet de z-posities van alle fiducials schaal met dezelfde helling.
6. Zodra een bevredigende kalibratie wordt verkregen, uit te voeren lokalisatie en transformatie-analyse voor het ruwe beeld datasets verworven in stap 4 na dezelfde procedure beschreven in stappen 5,1-5,3. Als je klaar bent, plaatst u de kalibratie-bestand uit stap 5.4 en het uitvoeren van z-coördinaat extractie met behulp van de functies "Pick WND File" en "Extract Z-coördinaat" in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies".
   OPMERKING: Aangezien de acquisitietijd is> 15 min, mechanische drift te verwachten.
7. Drift correctie in te voeren x, y, selecteer een heldere de vaste van de lokalisatie coördinaten. Dat de vaste moet aanwezig zijn in alle frames zijn. Gebruik vervolgens de x, y-coördinaat drift van de vaste aan alle andere coördinaten af te stemmen binnen hetzelfde frame terug in de registratie (figuur 3A-B) met behulp van de functie "Test / Schrijf Guide Star" onder het menu "Image Transformaties". Z-coördinaat registratie kan op dezelfde manier worden uitgevoerd door de toegang tot de "Test Guide Star" en "Write Guide Star" functies in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies".
8. Als het monster lichte tilt kan vertonen, uit te voeren tilt correctie door het verstrekken van de x, y, z-coördinaten van 3 referentiepunten het definiëren van het vliegtuig dat moet worden ingesteld niveau met behulp van de functie "Verwijder XYZ Kantelen 'in het pop-up venster door te klikken op" Z-coördinaat Operations "onder het menu" Speciale functies ".
9. Na de drift en tilt correcties, sparen de lokalisatie coördinaten. Reconstrueren afbeelding een super resolutie voor verdere analyse (Figuur 4A-D) met behulp van het commando "Render" op de belangrijkste interface. Kleur kan worden aangegeven de z-coördinaat. Als alternatief kan een zijaanzicht van het geselecteerde gebied kan ook worden gemaakt. De lokalisatie coördinaten kan als tekstbestanden worden geëxporteerd voor verdere kwantificering of de gereconstrueerde afbeelding kan worden opgeslagen als een TIF-bestand.

Resultaten

Kritieke vereisten voor iPALM zijn de uitlijning, registratie en kalibratie van de optische systemen. Deze zijn nodig om de juiste storing binnen de 3-way bundelsplitser vereiste garanderen voor de z-coördinaat extractie. Om continue monitoring mogelijk te maken, constant puntbronnen van fluorescentie nodig. Dit kan worden bereikt met fluorescerende Au of bi-metallische nanodeeltjes ²³ waarvan de fotoluminescentie voortvloeien uit plaatselijke surface plasmon resonance (LSPR)....

Discussie

Het optische systeem iPALM is gebaseerd op een 4-π dual-tegen objectief ontwerp, zoals weergegeven in figuur 1A. De instellingen worden geconstrueerd met zowel maat gefreesd en commerciële opto-mechanische onderdelen, zoals eerder beschreven ²³ en in tabel 1. In aanvulling op onze opstelling, het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) biedt onderdak aan een systeem dat toegankelijk is voor de wetenschappelijke wereld op het Advanced Imaging Center van de Jane...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
optical table	Newport, CA	RS4000	iPALM, geïnstalleerd op 4 Newport Stabilizer vibratie isolatoren
vibration isolator voor optische tafel	Newport, CA	S-2000
laser-642	Newport, CA	1185055	uitgangsvermogen=100 mw
laser-561	Newport, CA	1168931	uitgangsvermogen=200 mw
laser-488	Newport, CA	1137970	uitgangsvermogen=200 mw
laser-405	Newport, CA	1142279	uitgangsvermogen=100 mw
breedband diëlektrische spiegels	Thorlabs, NJ	BB1-E02	laser combiner
dichroic beamsplitter	Semrock, NY	LM01-427-25
acousto-optische afstembare filter	AA Opto-Electronic, Frankrijk	AOTFnC-VIS-TN
Lineaire polarisator	Newport, CA	05LP-VIS-B
basisplaat	lokale werkplaats	aangepast
draaispiegel (22,5°)	Reynard Corpporation, CA	aangepast	22,5° spiegel
gemotoriseerde optiek houders	New Focus, CA	8816
gemotoriseerde XYZ vertaalstand	Thorlabs, NJ	MT3/M-Z6	monster houder
T-Cube DC servomotor controller	Thorlabs, NJ	TDC001
Piezo Phase Shifter	Physik Instrumente, Duitsland	S-303.CD
objectieflens	Nikon, Japan	MRD01691	objectief. Apo TIRF 60X/1.49 olie
vertaalstand	New Focus, CA	9062-COM-M
Pico Motor Actuator	New Focus, CA	8301
roterende Solenoïde/Shutter	DACO Instruments, CT	5423-458
3-weg straal splitter	Rocky Mountain Instruments, CO	aangepast	straalsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner	Physik Instrumente, Duitsland	S-316.10
gemotoriseerde vijf-as kantelinrichter	New Focus, CA	8081
Picmotor ethernet controller	New Focus, CA	8752
Piezo controllers/versterker/digitaal bedieningsmodule	Physik Instrumente, Duitsland	E-509/E-503/E-517
bandpass filter	Semrock, NY	FF01-523/20	filters
bandpass filter	Semrock, NY	FF01-588/21
bandpass filter	Semrock, NY	FF01-607/30
bandpass filter	Semrock, NY	FF01-676/37
notch filter	Semrock, NY	NF01-405/488/561/635
gemotoriseerde filterwiel met controleur	Thorlabs, NJ	FW103H
EMCCD	Andor, UK	DU-897U-CSO-#BV	3 sets
Desktop computers voor het besturen van camera's en synchronisatie	Dell	Precision T3500	PC, 4 sets
dekglasjes met fiduciële markeringen	Hestzig, VA	600-100AuF	monstervoorbereiding. Fiduciële markeringen met verschillende dichtheid en spectra beschikbaar
fibronectine	Millipore, MT	FC010
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	15710	fixatie. 16%
glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	16220	25%
triton X-100	Sigma aldrich, MO	T8787
HUVEC cellen	Life Technologies, CA	C-015-10C
Medium 200	Life Technologies, CA	M-200-500
Grote vaat endotheel factoren	Life Technologies, CA	A14608-01
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing		14190367
Pennicillin/Streptomycin		15140122
Trypsin/EDTA	Life Technologies, CA	25200056
PIPES	Sigma aldrich, MO	P1851	PHEM
HEPES	1st base, Maleisië	BIO-1825
EGTA	Sigma aldrich, MO	E3889
MgCl2	Millipore, MT	5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen, CA	A22287	kleuring
natriumborohydride (NaBH4)	Sigma aldrich, MO	480886	doving
glucose	1st base, Maleisië	BIO-1101	beeldvorming buffer
glucose oxidase	Sigma aldrich, MO	G2133
catalase	Sigma aldrich, MO	C9322
cysteamine	Sigma aldrich, MO	30070
Epoxy	Thorlabs, NJ	G14250
vaseline	Sigma aldrich, MO	16415	monster verzegeling
lanoline	Sigma aldrich, MO	L7387
paraffinewas	Sigma aldrich, MO	327204
Immersiolie	Electron Microscopy Sciences, PA	16915-04	beeldvorming. Cargille Type HF