Methodenartikel

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

DOI:

10.3791/54779

⸱

17 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, 2Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NK-cel cytotoxiciteit is een veel gebruikte maat voor het effect van externe interventie NK celfunctie bepalen. Echter, de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van deze test onstabiel beschouwd, hetzij door een vergissing gebruiker of vanwege de gevoeligheid van NK cellen voor experimentele manipulatie. Om deze problemen te elimineren, een workflow die hen reduceert tot een minimum werd opgericht en wordt hier gepresenteerd. Ter illustratie, we bloedmonsters op verschillende tijdstippen van lopers (n = 4), die een intensieve training opgemeten werden. Eerst worden NK-cellen tegelijkertijd geïdentificeerd en geïsoleerd door middel van CD56-tagging en magnetische gebaseerde sortering direct uit volbloed en van slechts één milliliter. De gesorteerde NK cellen verwijderd van elke reagens of capping antilichamen. Ze kunnen worden geteld om een ​​nauwkeurige NK cellen vast per milliliter bloed. Ten tweede kan de gesorteerd NK-cellen (effector cellen of E) worden gemengd met 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO) hebben K562 cellen (doelcellen of T) en een test-optimaal 1: 5 T: E-verhouding en geanalyseerd met een beeldvormende flow cytometer dat zorgt voor de visualisatie van elk voorval en het verdwijnen van een valspositieve of valse negatieven (zoals doubletten of effectorcellen). Deze workflow kan worden voltooid in ongeveer 4 uur, en zorgt voor een zeer stabiele resultaten, zelfs bij het werken met menselijke monsters. Indien beschikbaar, kunnen onderzoeksteams testen verschillende experimentele interventies bij menselijke proefpersonen, en vergelijk metingen tussen verschillende tijdstippen, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van de gegevens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natural killer cellen zijn een essentieel onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Terwijl de kamers worden gereguleerd, ze hebben de mogelijkheid om te herkennen en te elimineren abnormale cellen via cel-cel contact en zonder voorafgaande activering 1. Als zodanig vormen ze een snelle lijn van verdediging tegen infecties. Oefening, intense, is aangetoond dat tijdelijk onderdrukken van het immuunsysteem 2, 3, 4, 5. NK-cellen zijn bijzonder gevoelig voor dit effect 4, 6, 7, waardoor effectief een venster van verhoogde gevoeligheid voor ziekte. Vandaar dat de studie van interventies voor, tijdens of na intensieve training met als doel het verminderen van de gevolgen NK celfunctie van bijzonder belang is voor het welzijn van atleten na wedstrijden.

Echter, de studie van dergelijke ingrepen bemoeilijkt door verschillende factoren: 1) NK-cellen zijn schaars 8 bij ongeveer 1% van de witte bloedcellen compartiment; 2) NK-cellen zeer gevoelig zijn voor stress en vertrouwen op constante blootstelling aan fysiologische omstandigheden levensvatbaar en stabiel tijdens experimenten te blijven; en 3) standaard assays voor NK-cel cytotoxiciteit te bepalen, zoals Ficoll gradiënten 9 kort assays 10, onbetrouwbaar en inconsistent. De inherente variabiliteit van menselijke stalen verbinding alleen deze kwesties. Verse menselijke monsters verzameld tijdens ingrepen zijn vrij geregeld en moeilijk te schaffen, tenminste in vergelijking met diermonsters of geïmmortaliseerde cellijnen. Dit vermindert de kansen om experimenten te herhalen of de deelnemers aan de studie cohort om significante statistische drempels bereiken. Tezamen zijn deze problemen achter de noodzaak voor een gestroomlijnde protocol waarmee for zowel high-throughput en een zeer betrouwbare analyse van de NK-cel lytische activiteit in menselijke monsters.

We hebben een workflow dat de tijd verkort die nodig zijn om te identificeren, te isoleren en te testen NK-cellen uit menselijk bloed terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan externe factoren. De werkwijze optimaliseert het gebruik van twee instrumenten, een magnetisch gebaseerde celsorteerinrichting en een beeldvormende stromingscytometer en een test-specifieke, geoptimaliseerde T: E verhouding tot de detectie van afname of toename van NK-cel cytotoxiciteit mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Alle incassoprocedures bloed werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) richtlijnen.

1. Hele bloedafname

  1. Heeft u een gecertificeerde phlebotomist bloed te trekken volgens de richtlijnen van de World Health Organization.
  2. Trekken bloed in een 4 ml bloedafname met Di-Kalium Ethyleendeniaminetetraacetaat (K 2 EDTA). Inverteer bloedafname volgens de instructies van de fabrikant. Houd bloedafname bij kamertemperatuur op een bankje-top rocker tot scheiding.

2. Voorbereiding van de DIO-gelabelde doelcellen

  1. Groeien K562 cellen in compleet Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Media (IMDM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline streptomycine gedurende verscheidene weken voorafgaand aan de test om de gezondheid van de cellen te waarborgen. Pas de concentration van de cellen 3 x 10 5 cellen / ml dagelijks door de voltooiing van een celgetal en daaropvolgende passage van cellen. Voer een volledige media veranderen elke 2 tot 3 dagen.
  2. Op de dag van de test uitvoert een celtelling met een 1: 1 hemocytometer.
    1. Verwijderen 10 pi uit de K562 kolf en plaats in 1,5 ml buis.
    2. Voeg 10 ul van trypan blauwe kleurstof in dezelfde 1,5 ml buis voor een verdunningsfactor van 1: 1.
    3. Zachtjes flick buis K562 cellen mixen en trypan blauw kleurstof.
    4. Sta K562 cel-trypan blauwe kleurstof incuberen 1 min bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder 15 pi van gebrandschilderd K562 cellen uit buis.
    6. Pipet op hemocytometer voor celgetal.
    7. Aantal cellen in de vier hoeken vierkanten en het middelste vierkant in totaal vijf vierkanten.
    8. Bereken cellen met de volgende formule:
      Total cellen / ml = Total cellen geteld X (verdunningsfactor / aantal vierkantjes) X 10.000 / mL
  3. Resuspendeer K562 doelcellen in een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in serumvrij IMDM kweekmedium.
  4. Voor ongekleurde K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 targetcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen. Plaats in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik.
  5. Dio gekleurd K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 doelcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen.
    1. Voeg 1 ul van DIO cel-labeling oplossing per ml celsuspensie in 15 aangewezen voor DIO kleuring en voorzichtig vortex ml buis. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van cel-labeling oplossing Dio 10 x 10 6 K562 cellen / ml in een volume van 1 x 10 6 cellen / ml.
    2. Incubate K562-dio oplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO2 in een 15 ml buis.
  6. Volgening incubatie 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan K562-Dio oplossing die 15 ml buis.
  7. Centrifugeer 10 min bij 135 xg bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet met een 1000 ui volume verstelbare pipet.
  9. Voeg 10 ml vers IMDM naar cel pellet bevattende 15 ml buis.
  10. Voorzichtig vortex buis om de cellen te resuspenderen.
  11. Herhaal stap 2,7-2,10 twee keer.
  12. WINKEL cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen in de incubator gedurende maximaal 24 uur, maar het de voorkeur om ze te gebruiken op dezelfde dag.

3. Voorbereiding van Controls

  1. Breng de volgende in afzonderlijke en gemerkte 1,5 ml buizen:
    1. Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de "Double Positive" gelabeld 1,5 ml buis.
    2. Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de "enige dio" gelabeld 1,5 ml buis.
    3. Voeg 500 ul vers IMDM geresuspendeerd met ongelabelde K562 cellen in de "propidiumjodide (PI) in" gelabelde 1,5 ml buis.
  2. Breng het dubbele positieve en PI alleen buizen in een 55 ° C waterbad gedurende 5 min.
  3. Na 5 minuten is verstreken verwijderen buizen en afvegen met 70% ethanol.
  4. Voeg 10 L van PI Double positieve en PI slechts 1,5 ml buizen.
  5. Plaats alle drie K562 doelcel controles in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  6. Na 30 minuten incubatie is verstreken, centrifuge drie K562 doelwitcel regelaars voor 2 min bij 163 x g.
  7. Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
  8. Resuspendeer elk besturing met 20 pL vers IMDM celkweekmedia, en laat in de 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende ten minste30 min voor een optimale Dio signaal.
    LET OP: De controles zijn nu klaar om cytometer worden uitgevoerd door de beeldvorming flow.

4. NK Cell Geautomatiseerde Separation

  1. Schakel cel afscheider en laat de start-up cyclus te beëindigen.
  2. Zorg ervoor dat alle vloeistof flessen verlichtingen zijn groen en dat de fles afval leeg is.
  3. Zorg voor een kamertemperatuur van 15 ml buis rack.
    LET OP: De selectie is gebaseerd op de steekproef volumes. Bijvoorbeeld, voor een hoeveelheid van minder dan 3 ml gebruiken een 15 ml buis en rek voor een volume van meer dan 3 ml gebruiken een 50 ml buis rek.
  4. Label monsterbuizen dienovereenkomstig (Repeat per monster / deelnemer): Deelnemer 1 volledig bloedmonster; Deelnemer 1 Negatieve fractie; Deelnemer 1 Positief fractie.
  5. Voorzichtig pipet 1,5 ml volbloed van Stap 1.2 in "Whole Blood Sample" 15 ml buis.
  6. Plaats op geschikte wijze gemerkte 15 ml "Whole Blood Sample" buis uit stap 4.5 en gelabeld 15 ml "Negatief Fraction" en"Positief Fractie" buizen uit stap 4.4 in de buis rack. Gebruik thefollowing sample rack set-up: Rij (R1) A: volledig bloedmonster, Row (R2) B: Negatief, ongelabelde fractie, Row (R4) C: Positief, magnetisch gemerkte fractie.
  7. Plaats de separator rack op de MiniSampler voor autolabeling.
  8. Selecteer "reagens" op het menu en markeer de positie waar de flacon in de afscheider rack wordt geplaatst.
  9. Selecteer "Lees Reagent" naar de 2D-codelezer activeren.
  10. Plaats het reagens flacon voor de 2D-codelezer tussen 0,5-2,5 cm vanaf de codelezer deksel.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, de vereiste reagens NK celscheiding is CD56.
  11. Houd reagensflesje schuin voor 2D-codelezer optimaal lezen.
  12. Plaats de reagensflesje in de juiste afscheider rack positie.
  13. Markeer de gewenste posities op het tabblad Separation op het scherm.
  14. Vanaf het submenu Labeling, wijst u een autolabeling programma.
  15. Wijs de Cell Separation Reagent CD56 microbolletjes posities 1, 2, 3, en 4 rack.
  16. Selecteer de "posselwb" scheiding programma.
  17. Selecteer de "spoelen" wasprogramma.
  18. Plaats een sample volume van 1500 pi in de "Volume" submenu met behulp van het numerieke toetsenbord.
  19. Selecteer de "Enter" optie op het toetsenbord.
  20. Selecteer "Run" om de scheiding cel te starten.
  21. Selecteer "OK" om te bevestigen dat er voldoende buffer is beschikbaar voor de verwerking van alle monsters.

5. NK Cell Count Na Cell Separation

  1. Onmiddellijk na celscheiding met de cel separator, halen de positieve fractie. Laat bij kamertemperatuur. Deze fractie bevat de gewenste zuivere NK celpopulatie.
  2. Voor elk individueel monster, het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van een hemocytometer als per stap 2.2.
    1. Na de berekeningen, noteer de celgetal.

6. cytotoxiciteit Assay Monstervoorbereidingstesten

  1. Bereid en label 1,5 ml buizen voor elk monster / deelnemer dienovereenkomstig.
  2. Pipet gewenste verhouding van NK-cellen en DIO-gelabeld K562 cellen in elke buis.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, de gewenste verhouding van K562 doelwitcellen en effector NK cellen 1: 5.
  3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 135 x g.
  4. Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
  5. Resuspendeer NK-Dio gemerkte K562 celmengsel in 500 pi van NK celmedium zonder interleukine-2 (IL-2) en 2-mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK celkweekmedium).
    LET OP: De onvolledige NK media voor celkweek is Minimum Essential Medium Eagle met natriumbicarbonaat, zonder L-glutamine, ribonucleosiden en deoxyribonucleosides.
  6. Voeg 5 ul van PI aan elke buis.
  7. Centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g.
  8. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  9. Na 2 uur incubatie, centrifugalege gedurende 2 minuten bij 163 x g.
  10. Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
  11. Resuspendeer cellen in 25 ul onvolledige NK celkweek media.

7. Bereiding van Spontane ( "S") Sample

  1. Pipetteer 500 ul van DIO-gelabelde K562 cellen (concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml) in 1,5 ml buis.
  2. Voeg 10 ul van PI aan elke buis.
  3. Centrifugebuis gedurende 2 minuten bij 163 x g.
  4. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  5. Na 2 h incubatie centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g.
  6. Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
  7. Resuspendeer cellen in 25 ul incomplete alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) celkweek media.

8. Data Acquisition met Imaging flowcytometer

  1. Druk op de groene knop in de voordeur van de imaging stromingscytometer te schakelen op het instrument.
  2. Zet all computers in verband met de beeldvorming flowcytometer.
  3. Start de imaging flowcytometer software.
  4. Klik op de "Startup" knop om het systeem te spoelen en de voorbereiding van het monster lijn.
  5. Zodra de "Startup" is voltooid, sluit het venster "Calibrations".
  6. Wijs kanalen: op de bovenste linkerkant, klikt u op elk kanaal om ze toe te wijzen.
  7. Aan de rechterkant, klikt u op de scatterplot knop om 4 scatterplots maken: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 en FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
  8. Begin met het analyseren van monsters door eerst met behulp van de "Double Positive" control.
    1. Klik op "Load."
    2. Plaats de 1,5 ml buis met de "Double Positive" monster van Stappen 3,4-3,9 in het monster loader.
    3. Selecteer de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting".
    4. Schakel de 405 mW en642 mW lasers.
    5. Schakel de "Helderveld" kanaal.
    6. Klik op "Select Intensity."
    7. Op basis van de "Double Positive" controlemonster, bepalen de gewenste intensiteit van de laser 405 mW zodat de detector niet overbelast.
      Opmerking: Zo werd de optimale intensiteit voor dit experiment ingesteld op 11 mW.
  9. Nadat de gewenste set-up wordt bereikt, te verwerven gegevens.
    1. Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst. Selecteer een map voor het opslaan van de data file (s).
    2. Voer het aantal cellen te verwerven naast "Verzamel". Normaal gesproken is dit aantal varieert tussen 1000 tot 10.000.
    3. Klik op "te verwerven."
      LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen, wordt het bestand automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
  10. Na de overname is voltooid, plaatst u de volgende controle monster - Dio alleen controle.
    1. Klik op "Load."
    2. Plaats de 1,5 ml buis met de "DIO only" monster in het monster loader.
    3. Laat de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting" geselecteerd.
    4. Laat de 405 mW laser ingeschakeld.
    5. Schakel de 642 mW laser en de "Helderveld" kanaal.
      OPMERKING: Nu de gewenste opstelling is bereikt, kan data worden verkregen.
    6. Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer het aantal cellen te verwerven naast "Collect.". Meestal is dit getal 1000.
    7. Klik op "te verwerven."
      LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
  11. Herhaal stap 8.10 voor de "PI-only" controlemonster. De experimentele monsters zijn nu klaar om te worden verzameld.
  12. Behandel de remaining experimentele monsters, inclusief de "spontane" S "monsters" als volgt:
    1. Laat de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting" geselecteerd.
    2. Zet de 405 mW en 642 mW lasers.
    3. Zet de "Helderveld" kanaal.
    4. Klik op "Set Intensity."
    5. Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer in een aangepaste bestandsnaam tekst.
    6. Voer het aantal cellen te verwerven naast "Collect."
    7. Klik op de "Acquire" knop.
      LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
  13. Herhaal stap 8.12 voor alle experimentele monsters.
  14. Na alle experimentele gegevens en bestanden zijn verzameld, klikt u op de "Afsluiten" knop om het systeem te steriliseren.

9. Imaging flowcytometer Sample Analysis

  1. Open de beeldvorming flowcytometer analyse software.
  2. Onder "File", opent een experimentele .RIF bestand.
  3. Bouw een nieuwe matrix met behulp van de enkele kleur .RIF bestanden (DIO-uitsluitend het beheer en PI-only control, gemaakt tijdens stappen 8.10 en 8.11) door te kiezen voor "Create a New Matrix" onder het tabblad Compensation in de imaging flowcytometer software.
    OPMERKING: De software vraagt ​​voor de selectie van één kleur bestanden en samenvoegen tot een matrix bestand (.ctm extensie) te creëren, die wordt geselecteerd kanaalcompensatie passen.
  4. Maak dot plots met behulp van de functie "bouwstenen" van de software.
    1. Maak een dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequentie) aan de poort van de gerichte cellen. Bel de gate "Focus" (Figuur 1A).
    2. Met behulp van de "Focus" poort, maak een dot plot van Bright Field Area vs Bright Field beeldverhouding g at de singlet cellen. Bel de gate "Single" (Figuur 1B).
    3. Met behulp van de "Single" poort, maak een dot plot van Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Gebruik dit perceel te identificeren en gate DIO-positieve alleen cellen (targets, levend) en PI-DIO dubbele positieve cellen (targets, dood) (figuur 1C).
      LET OP: Alle percelen beschreven in de stappen 9.4.1, 9.4.2 en 9.4.3 kan worden gemaakt met behulp van de functie "bouwstenen" van de software.
  5. Klik op de statistieken functie van de dot plot om toegang te krijgen cel aantallen van elke poort.
  6. Bereken het percentage dode doelen in de spontane monster en proefmonsters volgens de volgende formule:
    % Dode doelwitten in het monster = (#dead targets x 100) / (# wonen targets + #dead targets)
  7. Bereken cytotoxiciteit met de volgende formule:
    % Cytotoxiciteit = [(Experimental dead-Spontaan dood) / (100-Spontane dood)] x100
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-protocol-1
Figuur 1: Representatieve histogrammen, scatter plots en afbeeldingen voor cytotoxische activiteit analyse. (A) aandacht cel analyse. (B) single cell analyse. (C) doelwitcel kleuring analyse. Alle bepalingen worden uitgevoerd met de afbeelding bij elke gebeurtenis. Dit kan in de analyse software worden benaderd door simpelweg te klikken op het evenement op de grafieken. (D) representatief beeld van een doublet evenement, dat een apoptotische NK cel en een live-K562 doel. CH01, Helderveld. CH02, Dio. CH05, PI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bepaling van NK cellen
Het effect van zware verkeer op NK cellen in volbloed werd berekend op basis van de inspanningsprotocol in figuur 2 beschreven. Bloedmonsters werden voor de inspanning, onmiddellijk na de training, 1,5 uur na inspanning, en tenslotte 24 en 48 uur na de eerste bloedafname. De concentratie van NK cellen per milliliter bloed werd gemeten voor elke loper (figuur 3A) en gemiddeld (Figuur 3B) voor elk tijdstip.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De werkwijze beschreven in deze studie meet direct de specifieke activiteit van NK-cellen van een individu in reactie op stimuli (in dit geval, langdurige oefening). Kenmerkend worden NK-cellen geïsoleerd van bloed dichtheidsscheiding gradiënten of celsortering door een combinatie van merkers. Hoewel deze werkwijzen op grote schaal worden gebruikt, hebben veel nadelen: ze zijn tijdrovend, omvatten meerdere manipulaties en zijn sterk afhankelijk van de gebruiker. Hierdoor wordt onnodige nadruk gelegd op de geïsoleerde NK...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd ondersteund door de Agriculture and Food Research Initiative Competitieve Subsidie nr. 2100-68003-30395 van het USDA National Institute of Food and Agriculture.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
K-562 lymfoblastenATCCCCL-243
Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's MediaATCC30-2005Hoge glucose, met L-Glutamine, met HEPES, Sterile-gefilterd
Alpha Minimum Essential mediumATCCCRL-2407Zonder ribonucleosiden en deoxyribonucleosiden maar met 2 mM L-glutamine en 1,5 g/L natriumbicarbonaat
Trypan Blauw Oplossing 0,4%AmrescoK940-100MLWeefselcultuurkwaliteit
Propridium Jodide Kleuring OplossingBD Pharmingen51-66211E
Vybranto DiO cel-labeling oplossingVybrantoV-22886
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
autoMACS Washing BufferMiltenyi Biotec130-092-987
autoMACS ColumnsMiltenyi Biotec130-021-101
Whole Blood CD56 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-090-875
ImageStream X Mark II Beeldvorming Flow CytometerEMD Millipore
SpeedbeadsAmnis Corporation400030
0,4-0,7% Hypochloriet (Sterilizer)VWRJT9416-1
Coulter ClenzBeckman Coulter8546929
70% Isopropanol (Debubbler)EMD Millipore1.3704
D-PBS (Sheath vloeistof)EMD MilliporeBSS-1006-B (1X)Geen calcium of magnesium
INSPIRE SoftwareEMD MilliporeVersie Mark II, september 2013
Ideas Toepassing SoftwareEMD MilliporeVersie 6.1, juli 2014

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
  2. Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
  3. Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
  4. Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
  5. Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
  6. Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
  7. Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
  8. Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
  9. Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
  10. McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
  11. Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
  12. McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
  13. Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125(2013).
  14. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NK celcytotoxiciteitflowcytometriecelseparatiemagnetische sorteringimaging flowcytometerpropidiumjodideK562 cellenCD56 labelingcytotoxische activiteit

Gerelateerde artikelen