Methodenartikel

Met behulp van 3D-printtechnologie om samenvoegen MRI met de histologie: A Protocol for Brain Snijden

15.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54780

⸱

6 december 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

In dit artikel

Samenvatting

De algemene doelstelling van dit protocol is om nauwkeurig af te stemmen magnetic resonance imaging (MRI) image volumes met histologie secties via de creatie van op maat gemaakte 3D geprint hersenen houders en snijmachine dozen.

Samenvatting

Magneetresonantie beeldvorming (MRI) maakt het mogelijk om een onderscheid te maken tussen normaal en abnormaal weefsel op macroscopische schaal, door een volledige weefselvolume driedimensionaal te bemonsteren. Hoewel MRI een uiterst gevoelig hulpmiddel is voor het detecteren van weefselafwijkingen, is de associatie van signaalveranderingen met een onderliggend pathologisch proces meestal niet eenvoudig. In het centrale zenuwstelsel kunnen bijvoorbeeld ontsteking, demyelinisatie, axonaal letsel, gliose en neuronale dood allemaal vergelijkbare bevindingen op MRI veroorzaken. Daarom is interpretatie van MRI-scans afhankelijk van de context, en is radiologisch-histopathologische correlatie van het grootste belang. Helaas is traditionele pathologische sectie van hersenweefsel vaak onnauwkeurig en inconsistent, waardoor de vergelijking tussen histologiesecties en MRI wordt gecompliceerd. Dit artikel presenteert een nieuwe methodologie voor nauwkeurige sectie van hersenweefsels van primaten en maakt zo een nauwkeurige overeenkomst tussen histologie en MRI mogelijk. Het gedetailleerde protocol dat in dit artikel wordt beschreven, zal onderzoekers helpen bij het toepassen van deze methode, die is gebaseerd op het maken van 3D-geprinte hersensnijders. Enigszins gemodificeerd, kan het gemakkelijk worden geïmplementeerd voor hersenen van andere soorten, inclusief mensen.

Inleiding

In vivo MRI biedt een niet-invasieve en gevoelige meting van de weefselintegriteit op macro-niveau. Veranderingen in de MRI-signaalintensiteit die in vivo worden gezien, zijn uitkomstmaten in veel lopende klinische onderzoeken.1 Hoewel de intensiteitsveranderingen die via MRI worden gezien, gebieden van abnormaliteit in de context van de hele hersenen kunnen identificeren, zijn ze vaak niet specifiek genoeg om pathologische processen te onderscheiden. Dit geldt vooral voor dynamische processen die meerdere pathologieën omvatten. Bijvoorbeeld, bij multiple sclerose (MS) of zijn diermodel, experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE), overlappen ontsteking, oedeem, myelinedegradatie, axonale vernietiging, gliose en neuronale dood. 2, 3 Om de nodige specificiteit over de onderliggende pathologie te verkrijgen, moet rekening worden gehouden met de context, samen met kennis van de histologie van de door MRI geïdentificeerde abnormale weefsels.

Echter, zelfs in goed gecontroleerde dierexperimenten is het fundamenteel uitdagend om histologie te matchen met in vivo MRI om verschillende redenen. Ten eerste, het verschil in dimensionale schalen tussen histologie secties en MRI is van meerdere ordes van grootte.4 Ten tweede, voor een goede vergelijking, moet de oriëntatie van het MRI-snijplan overeenkomen met het snijplan van het hersenweefsel bij het snijden. Vanwege de vorm van de hersenen is het erg moeilijk om consistent rechte en nauwkeurige sneden te maken wanneer de hersenen op een vlak oppervlak liggen. Ten derde, de grote omvang van de hersenen ten opzichte van een mogelijk klein gebied van belang (laesie, tumor, enz.) creëert een "naald-in-een-hooiberg" scenario voor de patholoog die het weefsel verwerkt. Ten vierde, zelfs wanneer het doelweefsel wordt gevonden, wordt het vaak op een zodanige manier verwerkt dat een associatie met de originele MRI-gegevens vrijwel onmogelijk is. Ten slotte, traditionele pathologische snijden van hersenweefsel is vaak onnauwkeurig en inconsistent, wat de vergelijking tussen histologie secties en MRI-beelden verder compliceert.

Eerdere pogingen om deze uitdagingen te overwinnen, waren gebaseerd op het gebruik van deformationele algoritmen om de gegevens te coregistreren en/of het plaatsen van fiduciale markers binnen of rond het weefsel als referentie.5, 6, 7, 8 De eerste benadering vereist complexe computationele modellen die bijzonder vatbaar zijn voor complicaties door gegevensformatering, beeldartefacten en veranderingen veroorzaakt door weefselverwerking.4 Aan de andere kant introduceert de laatste benadering de mogelijkheid om het weefsel zelf te verontreinigen of anderszins te beschadigen.9

De hier beschreven benadering verbetert de overgang tussen modaliteiten door het gebruik van postmortem MRI om de kloof tussen in vivo MRI en histologie te overbruggen. Postmortem MRI levert driedimensionale (3D) beelden van de hersenen met een hogere resolutie dan in vivo kan worden bereikt en biedt bovendien de gegevens die nodig zijn voor het produceren van een morfologisch nauwkeurig model van het hersenoppervlak. Dit digitale model kan vervolgens worden gebruikt om een 3D-geprinte aangepaste houder voor de hersenen te maken. Met zorgvuldige positionering stelt de hersenhouder nauwkeurige, MRI-georiënteerde hersensneden mogelijk, waardoor de behoefte aan complexe wiskundige algoritmen wordt verminderd, en maakt een focus op specifieke regio's mogelijk voor gerichte bemonstering.

Ons laboratorium introduceerde onlangs nieuwe methoden voor het maken van aangepaste hersenhouders en sneden met behulp van postmortem MRI en 3D-printtechnologie voor menselijke10 en marmoset-hersenen.4 De twee methoden maken een nauwkeurigere correlatie tussen MRI en histologie mogelijk in een onderzoeksomgeving, en maken uiteindelijk een dieper begrip van de specifieke pathologie onderliggend aan MRI-afwijkingen mogelijk. Zorgvuldig ontworpen experimenten, waarbij de hersenen herhaaldelijk worden bemonsterd over tijd in vivo, kunnen context bieden voor de interpretatie van de pathologie, wat op zijn beurt specificiteit kan toevoegen aan de interpretatie van de MRI. Hier presenteren we een gewijzigd protocol in een uniform kader dat kan worden toegepast op elk hersenweefsel, of het nu afkomstig is van niet-menselijke primaten, knaagdieren of mensen. We geven gedetailleerde instructies en een bijbehorende video voor de marmoset-snede. Hoewel het algemene protocol op elk type hersenen van toepassing is, zijn er, vanwege verschillen in MRI-acquisitie en weefselmaten, evenals de uitdagingen die worden ondervonden bij het omgaan met specifieke hersentypes, enkele verschillen in de benadering, afhankelijk van het type hersenen dat wordt verwerkt. In deze presentatie zullen secties met "mens" verschillen in het protocol aanduiden die specifiek zijn voor de menselijke hersenen.

Protocol

Alle dierlijke behandeling en procedures die hierin worden beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. Hersenen werden verzameld uit gewoon penseelaapje (Callithrix jacchus) geïnduceerd om EAE te ontwikkelen. 11 De hersenen werden bewaard in 10% formaline tussen 3 weken en één jaar na euthanasie transcardial perfusie van 4% paraformaldehyde.

1. Post mortem MRI Voorbereiding en Acquisition

  1. Marmoset Brain
    1. Bereid een werkstation met katoengaas, een 50 ml centrifugebuis, kleine spatels, ~ 30 ml van een gefluoreerd olie, paraffine, en de marmoset hersenen.
    2. Vul de buis met de gefluoreerde olie en gaas aan de 20 ml markering. Druk de gaas om luchtbellen te verwijderen langs de weg.
    3. Zachtjes droog formaline van het oppervlak van de hersenen met een papieren handdoek. Steek de hersenen met de frontale pole naar de onderkant vande buis. beveiligen voorzichtig de hersenen in de buis met behulp van meer gaas rond de zijkanten om zijn positie te bepalen. Zie aanvullende sectie 11 voor een methode om een ​​MRI hersenen houder voor installatie van extra MRI scans.
    4. Vul de rest van de buis met gaas en gefluoreerde olie. Verwijder voorzichtig luchtbellen langs de weg. Zet de dop en sluit de buis met paraffine.
    5. Markeer de kap in lijn met de interhemisferische spleet. Wikkel de buis in een papieren handdoek en plaats het in de spoel met het merkteken top-center.
    6. Verwerven 2D spin-echo T2. Parameters worden gegeven in tabel 1.
    7. Open de 10 anatomische 150 micron-T2 weigted overnames in Mipav en registreer u om de 6 e overname.
      LET OP: De registratie is een geoptimaliseerde automatische registratie 3.5D algoritme met 9 graden van vrijheid, windowed sinc interpolatie, genormaliseerde kruiscorrelatie kosten functie, met een Powell's roepen Brent's zoekalgoritme. Rotaties werden bemonsterd uit 106; tot -10 ° met grof rotaties verhogen van 5 graden en fijne rotaties verhogen van 1 °. het gemiddelde dan de geregistreerde beelden: Utilities, Afbeelding calculator-Bulk beelden, Average.
  2. Menselijke brein
    1. Scheid de voorhersenen van de hersenstam met behulp van een snede op het niveau van de middenhersenen. 10 De hemisferen kan ook worden gescheiden door een snede langs de middellijn.
    2. Plaats de voorhersenen in een cilindrische buis met een hemisferische koepel aan één einde en een tuit aan de andere kant.
    3. Vul de buis met een gefluoreerde olie door de tuit. Verwijder luchtbellen met behulp van zachte zuigkracht voor ~ 30 min door de tuit.
    4. Acquire 3D T1-MPRAGE. Parameters worden gegeven in tabel 1.

2. extraheren Brain Oppervlakte: Mipav 7.2

  1. Open MRI in coronale oriëntatie.
  2. Selecteer Algorithms, Transformation gereedschappen, Transform, Resample. Selecteer de gebruiker gedefinieerde grootte en resample om ISOTropic voxels: 0,1 x 0,1 x 0,1 mm. Sla de geresampled MRI als Brain_MRI_Resampled. Mens: Resample aan voxels isotroop 0,3 x 0,3 x 0,3 mm.
  3. Selecteer Algorithms, Filters (ruimtelijk), lineaire ruisonderdrukking. Gebruik de standaardinstellingen, klikt u op OK.
  4. Selecteer Displays opzoektabel en klik op de dubbele drempel knop. Sleep de schuifknop op de grafiek om de hele hersenen te dekken.
  5. Selecteer Algorithms, Segmentatie, Threshold, Drempel met behulp van min / max. Voer de waarde in de linkerbenedenhoek van de intensiteit grafiek (net onder de schaal) in het vak 'Ondergrens ". Selecteer "binary" voor het type uitvoerbeeld en verwijder het vinkje "omkeren drempel."
  6. Selecteer Algorithms, morfologische, vullen gaten. Vink "Process in 2.5D."
  7. Omdat dit een MRI van de volledige hersenen, er een lege ruimte tussen de achterhersenen en cortex die moet worden opgevuld. Menselijke hersenen: deze stap overslaan.
    1. Met behulp van lijn VOI, trekken in een verbindingtussen de achterhersenen en cortex aan beide zijden van de hersenen op de laterale punt. Ga door met deze door de hersenen.
    2. Selecteer VOI, VOI conversie, Alle binaire masker. Selecteer Hulpprogramma's, Afbeelding rekenmachine. Selecteer OR van de operator dropdown menu en selecteer de hersenen masker. Selecteer "Bevorder bestemming image type"
    3. Selecteer Algorithms, morfologische, vullen gaten. Controleer "Process in 2.5D"
  8. Sla de binaire masker als Brain_Model.nii.
  9. Selecteer Algorithms, Extract oppervlak (marching cubes). Beeldmasker Select, Opslaan als Brain_Model.ply.

3. Het selecteren van Slice Locaties: Mipav 7.2

  1. Identificeer weefsel van belang of uitgangspositie. Berekenen van de beoogde plaatdikte. In marmoset hersenen, het tellen van 30 MRI plakjes per sectie en 5 MRI plakjes per blade gat, creëert 3 mm secties met 0,5 mm mes gaten, wat resulteert in ~ 3,5 mm platen. Menselijke hersenen: 20 MRI plakken per afdeling, en 4 MRI slijs per blade gat, creëert 6 mm secties met 1,2 mm mes gaten, wat resulteert in ~ 7.2 mm platen.
  2. Ter plaatse van de eerste mes kloof, klik op "box VOI" en dan trek een doos over de hersenen. Klik op de binnenkant van het vak om deze te selecteren. Kopieer en plak de contour voor elke MRI slice die overeenkomt met het mes kloof.
  3. Ga dan verder met het aantal MRI-schijfjes die overeenkomt met de sectie dikte en kopieer en plak de contour die overeenkomt met de volgende mes kloof. Herhaal dit proces door de hersenen.
  4. Selecteer VOI, VOI Conversie, All to Binary Mask. Opslaan als Blade_Gaps.nii.
  5. Selecteer beeld Masker Algorithms, Extract Surface (marching cubes), Blade_Gaps.ply.

4. Het maken van MRI Blade Map: Mipav 7.2

  1. Open de Brain_MRI_Resampled en de Blade_Gaps.nii afbeeldingen.
  2. Met de Blade_Gaps.nii afbeelding geselecteerd, selecteert u Hulpprogramma's Afbeelding Math. Selecteer bevorderen image type en Multiply.Voer 10.000 als de waarde.
  3. Selecteer Hulpprogramma's, Afbeelding Calculator. Selecteer Toevoegen en selecteer vervolgens de Brain_MRI_Resampled afbeelding uit de afbeelding dropdown box. Selecteer bevorderen bestemming afbeelding type.
  4. Sla deze afbeelding op als Brain_BladeMap.nii.
  5. Door te klikken op de TRIPLANAR uitzicht, kunnen de plaatsen waar de hersenen zullen worden gesneden te zien in drie orthogonale uitzicht.

5. importeren Brain and Blade Gap Oppervlakken: Netfabb Professional

  1. Selecteer Part, onderdeel toevoegen. Kies de bestanden Brain_Model.ply en Blade_Gaps.ply
  2. Selecteer de hersenen en klik op de reparatie-modus. Reparatie-modus:
    1. Klik op de schaal selectie knop, en klik vervolgens op de hersenen.
    2. Klik op de toggle selectie knop om de andere mazen te selecteren. Klik op Verwijderen om de andere mazen te verwijderen.
    3. Klik op Apply Repair, en verwijder het oude gedeelte.
  3. Klik met de rechtermuisknop op de hersenen. Kies zet. Klik op deOm oorsprong knop. Noteer de XYZ parameters die verschijnen. Deze vertaalparameters nodig zijn bladpositie opgezet Mipav handhaven. Klik op Translate. Sluit vervolgens het venster. (Klik niet te vertalen meer dan eens. Het zal vertalen opnieuw met dezelfde parameters.)
  4. Selecteer de Blade_Gaps model. Klik met de rechtermuisknop op het onderdeel en selecteer Verplaatsen. Voer de XYZ-waarden eerder opgenomen in de XYZ parameters dozen. Klik nu Vertalen en sluit het venster.
  5. Selecteer de Brain_Model model en klik op Repair-modus. Reparatie-modus:
    1. Klik op de schaal selectie knop, en klik vervolgens op de hersenen.
    2. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Smooth driehoeken. Voer 4-5 herhalingen. Controleer Prevent volume krimpen. Menselijke hersenen: 1-2 iteraties.
    3. Klik met de rechtermuisknop, selecteer Verminder driehoeken. Voer 200000 in het doel driehoek graaf en klik op Uitvoeren.
    4. Klik op Automatische reparatie, Default reparatie. Klik vervolgens op Apply Repair
  6. Klik met de rechtermuisknop, Naam wijzigen. Hernoem de afgevlakte hersenen als Smoothed_Brain_Model.
  7. Selecteer Smoothed_Brain_Model. Klik met de rechtermuisknop, Export, STL.

6. bewerken Brain Contouren: Meshmixer

  1. Importeer de Smoothed_Brain_Model in Meshmixer.
  2. Gebruik het beeldhouwen en selectie tools waarmee aanpassingen aan het netwerk te maken. Bewerkingen zijn onder meer:
    1. Gebruik Sculpting gereedschappen, Robuust glad. Strijk de oppervlakte die overeenkomt met de lijn VOI's. Menselijke hersenen: deze stap overslaan.
    2. Strijk het oppervlak van de cortex die naar beneden zal worden geconfronteerd in de doos.
    3. Smooth weg kleine divots die mogelijk zijn gemaakt in de meshing en bewerkingsproces.
  3. Selecteer Analysis, Inspecteur, Autorepair allemaal.
  4. Exporteer de Smoothed_Brain_Model als Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. Het creëren van de Brain Slicer Box: Netfabb Professional

  1. Selecteer Part, Toevoegen. Kies de file Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. Selecteer Part, Toevoegen. Selecteer vervolgens het STL bestand Brain Slicer Parts_Marmoset en klik geopend. Menselijke hersenen: Brain Slicer Parts_Human (Aanvullende code-bestanden).
  3. Klik met de rechtermuisknop op het onderdeel en selecteer Extended, schelpen te delen. Selecteer elk deel afzonderlijk en klik met de rechtermuisknop om ze te hernoemen. (Door te klikken op het oog naast een object verbergt het of maakt het zichtbaar.) De naam van de grote doos Main, de kleine doos Sub, en de scherpe doos Box_Cutout, de Zeshoek vorm Blade_Holder_Main, de kleine platte doos Microtoom Blade, en de half- buis object Cradle. Menselijke hersenen: geen Blade_Holder_Main, Microtoom Blade of Cradle.
  4. Hide Main, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Microtoom Blade, en Cradle en het gebruik shift-select om alle zes de Box_Cutout selecteren. Alleen de Box_Cutout en Smoothed_Edited_Brain_Model moeten zichtbaar zijn, maar de Smoothed_Edited_Brain_Model mag niet worden geselecteerd.
  5. Klik en sleep de geselecteerde delen van de doos ten opzichte van de hersenen aan te passen.
    1. Plaats de hersenen in het midden van de doos. Positie de hersenen diep genoeg in de doos stevig vast te pakken, maar niet te diep overhangen die juiste plaatsing verhinderen creëren.
  6. Eenmaal geplaatst, kan de hersenen box contour worden getest overhangen. Selecteer de Box_Cutout en Smoothed_Edited_Brain_Model. Selecteer Boolean Operation.
    1. Klik op de Smoothed_Edited_Brain_Model te draaien rood.
    2. Selecteer Boolean aftrekken, en de berekeningen toe te passen.
  7. Vink het vakje hersenen overhangen dat het hersenweefsel zou voorkomen dat veilig in de doos geplaatst. Als deze overhangen aanwezig zijn, passen de hersenen, zodat het minder diep in de doos. Als de hersenen op de gewenste diepte en overhangenaanwezig zijn, zie aanvullende sectie 10 naar een oplossing voor het verwijderen van de overhangen.
  8. Selecteer de Blade_Gaps model. Klik met de rechtermuisknop, selecteer Verplaatsen. Noteer de positie Z-waarde, dan sluit het venster. Dit zal de positie van de achterste mes kloof.
  9. Selecteer de Blade STL dat vanaf de Brain Slicer Parts kwam. Klik met de rechtermuisknop, selecteer Verplaatsen.
    1. Selecteer Absolute vertaling. Voer de Z-waarde van 7,8. Voor de X- en Y-waarden, voert u de overeenkomstige waarde van de huidige positie parameter boxes
  10. Selecteer de Blade STL. Klik met de rechtermuisknop, klik op Dupliceren.
    1. Controleer Schik delen. Voer het totale aantal bladen in de totale telling. Voer hetzelfde nummer in de Z-count doos. Voer de plaatdikte in de Z-kloof. Klik op dupliceren. Als de plakdikte werd gevarieerd, de bladen moeten individueel worden gepositioneerd. Dupliceren elk nieuw blad van de vorige (het verplaatsen van posterior naar anterior)met de z gat gelijk aan de sectie dikte van dat gedeelte.
  11. Plaats de Microtoom Blade delen op exact dezelfde tijdstippen als de messen in de snijmachine door het herhalen van stap 7.9 en 7.10 voor de Microtoom Blade. Menselijke hersenen: deze stap overslaan.
    1. Selecteer Microtoom Blade, samen met de Blade_Holder_Main deel en selecteer Boolean Operation.
    2. Selecteer alle bladen in Microtome Blade om ze rood te markeren. Klik op Boolean aftrekken, en de berekeningen toe te passen.
    3. Select Repair-modus. Voer een uitgebreide reparatie. Selecteer gelden de reparatie, en verwijder het oude gedeelte.
    4. Hernoem het deel Blade Holder. Exporteer de rol als STL.
  12. Shift-select Smoothed_Edited_Brain_Model, alle van de Blade-modellen gemaakt in de vorige stap, en de Sub en Main. Klik op Booleaanse operatie.
    1. Maak alle onderdelen behalve Main rood door selecting hen en klik op de pijl onder het groene vak om ze te verplaatsen naar rood.
    2. Selecteer Boolean Aftrekken en selecteer vervolgens berekeningen toe te passen.
  13. Klik op de reparatie-modus. Reparatie-modus:
    1. Vink het vakje voor overhangen en scherpe punten. Deze kunnen worden gladgestreken in Netfabb of Meshmixer.
    2. Klik op Automatische reparatie, Extended reparatie. Breng vervolgens de reparatie en het verwijderen van het oude deel
  14. Klik met de rechtermuisknop op het gerepareerde hersenen doos en hernoem het Brain Slicer Box. Exporteren als een STL.

8. Het afdrukken van de Brain Slicer Box op de Ultimaker 2

  1. Marmoset Brain: Cura
    1. Importeer de Brain Slicer Box in Cura.
    2. Selecteer Draaien en sleep de cirkel om de doos te draaien zodat het plat op het bed.
    3. Pas de afdrukinstellingen: 0,1 mm layer-resolutie, 50% fill dichtheid, Raft.
    4. Selecteer Opslaan Tool Path to SD-kaart. (Print tijd ~ 12 uur.)
    5. Import Blade Holder innaar Cura en draai het zo de sleuven op de zijkanten en de zeshoek gezicht is in de XZ of YZ-vlak.
    6. Dupliceren van het object.
    7. Pas de afdrukinstellingen: 0,2 mm dikke laag resolutie, 20% fill dichtheid, Brim.
    8. Selecteer Opslaan Tool Path to SD-kaart. (Print tijd ~ 3 uur)
  2. Human Brain: Cura
    1. Importeer de Brain Slicer Box in Cura en draai als in 8.1.2.
    2. Pas de afdrukinstellingen: 0,2 mm dikke laag resolutie, 30-35% fill dichtheid, Raft.
    3. Selecteer Opslaan gereedschap pad naar SD-kaart. (Print tijd ~ 70 uur voor alleenstaande halfrond box.)
  3. Op de Ultimaker 2
    1. Breng een dun laagje lijm stok lijm op plaat te bouwen.
    2. Plaats de SD-kaart. Selecteer Afdrukken en selecteer het onderdeel.

9. Het snijden van de hersenen

  1. Marmoset Brain
    1. Bereid een werkstation met de vaste hersenen, de hersenen snijmachine, twee meshouders, microtoom messen, 1 ml gefluoreerde olie, flat pincet, beschermende handschoenen en inbedding cassettes.
    2. Plaats nieuwe microtoom messen in de sleuven op het blad houders. Controleer de schuine rand van elk blad wordt gericht in dezelfde richting. Draag beschermende handschoenen bij het omgaan met microtoommessen messen.
    3. Verwijder de hersenen tegen formaline en voorzichtig drogen.
    4. Plaats de hersenen in de snijmachine. Een paar druppels gefluoreerde olie kan worden toegepast op de hersenen en snijmachine om gemakkelijk positioneren. Zorg ervoor dat de hersenen stevig op zijn plaats.
    5. Plaats het mes houders met de messen in de betreffende mes slots.
    6. Duw op het blad houders stevig en toe te passen langzame evenwicht druk door de hersenen te snijden.
    7. Verwijder elke plak, een voor een, vanaf de voorkant van de hersenen. Het helpt om de microtoom mes voor een plak te verwijderen alvorens de plaat zelf. Let goed op de voorste / achterste oriëntatie van elke plaat.
    8. Neem foto's van de voorste eend postérieure oppervlak van elke plaat. De achterste platen zal waarschijnlijk bevatten afzonderlijke stukken, dus let op de oriëntatie van de stukken voor het inbedden. Plaats elke plaat in een inbedding cassette en zet ze allemaal in een 10% formaline-oplossing.
  2. Menselijke brein
    1. Zorgvuldig te testen de pasvorm van de hersenen in het vak.
    2. Snijd de hersenen vanaf het ene uiteinde met behulp van een schuine snede, langzaam maar stevig snijden. Snijd de hersenen door middel van elk blad kloof.
    3. Verwijder elke plaat een voor een, met veel aandacht voor het aantal en de anterieure / posterieure oriëntatie van elke plaat.
    4. Neem foto's van de voorste en achterste oppervlak van elke plaat. Plaats platen in gesloten 10% formaline zakken. Weefselblokken worden uit de platen gesneden en in cassettes voor het inbedden.

10. Het verwijderen van Overhangen in Brain Box (aanvullende sectie)

  1. Het uittrekken van plakken: Meshmixer
    1. Importeer de Smoothed_Edited_Brain_Model.
    2. Selecteer Bewerken, Make plakjes. In Make plakken:
      1. Selecteer Stacked 3D, Z, voer 1-2 mm dikte. Klik op Compute. Wanneer de schijfjes te laden, klikt u op Accepteren.
    3. Selecteer 1 of 2 segmenten met grote perimeters dichtbij de bodem van de cortex. Deze segmenten moeten onder het niveau van de Sub vak.
    4. Exporteer elk van deze segmenten als Brain_Slice_ #.
  2. Uitbreiding van de plakjes tot overhangen verwijderen: Netfabb Professional
    1. Importeer de Brain_Slice_ # plakjes.
    2. Dupliceren elke Brain_Slice_ # (haal het vinkje weg te regelen delen indien aangevinkt).
    3. Klik met de rechtermuisknop op een kopie van elke Brain_Slice_ # en selecteert Scale.
      1. Haal het vinkje weg Vaste scaling ratio. Schaal dan de hersenen segment in de Y-richting zodat het niveau van de bodem van de doos Sub bereikt.
    4. Hernoem deze plakjes Brain_Slice_Big_ #.
    5. Controleer de Y-positie of de oorspronkelijke Brain_Slice_ # door rechts te klikken op de kant en het selecteren van bewegen. Noteer de Y positie van elk van de oorspronkelijke Brain_Slice_ # plakjes.
    6. Voer de berekening: Brain_Slice_ # [y-positie] - (Brain_Slice_Big_ # [y size] - Brain_Slice _ # [y size])
    7. Selecteer de Brain_Slice_Big_ # individueel, klik met de rechtermuisknop en kies verplaatsen.
      1. Voer de waarde berekend uit 10.2.6 in de Y-vertaling parameter box. Voor de X- en Z-vertaling parameters, voert u de waarden in de huidige positie parameter dozen. Selecteer Absolute Translation. Klik op Vertalen en sluit het venster.
        LET OP: De Brain_Slice_Big_ # schijfjes zullen worden afgetrokken, samen met de hersenen en de messen bij het maken van de doos.

11. Marmoset Brain MRI Cradle voor extra Scanning

  1. Het creëren van de hersenen MRI Cradle
    1. Zorg ervoor dat de bovenkant van de CrADLE is op dezelfde hoogte als de Box_Cutout. De diepte en de positie van de hersenen in de houder moet worden ingesteld net als voor de snijmachine.
    2. Shift-select aan de Smoothed_Edited_Brain_Model en Cradle selecteren.
    3. Selecteer Boolean operatie. Selecteer de hersenen om te markeren rood, selecteer vervolgens Boolean aftrekken. Breng vervolgens de berekeningen. (Selecteer ook de Brain_Slice_Big_ # plakjes indien van toepassing.)
    4. Voer reparatie modus om scherpe punten in de wieg contour te verwijderen zoals eerder gedaan voor de snijmachine. Selecteer Extended reparatie. Breng de reparatie, en verwijder het oude gedeelte.
    5. Klik met de rechtermuisknop op het deel MRI Brain Cradle hernoemen. Selecteer Exporteren, STL.
  2. Het afdrukken van de wieg: Cura
    1. Importeer de MRI Brain Cradle in Cura en draai het zo dat het vlakke gedeelte van de hersenen uitsparing is naar boven.
    2. Pas de afdrukinstellingen: 0,1 mm dikke laag resolutie, 100% vulling dichtheid, Raft.
    3. Selecteer Opslaan hulpmiddel pad naar SD-kaart. (Print tijd ~ 10 uur)
    4. Print op de Ultimaker 2 zoals beschreven in 8.3.
  3. Het verwerven van hoge resolutie T2 * MRI met behulp van de wieg
    1. Zachtjes droog formaline van het oppervlak van de hersenen met een papieren handdoek.
    2. Plaats de hersenen houder zoals beschreven voor de snijmachine.
    3. Schuif de hersenen en in de houder 50 ml centrifugebuis. Vul het aan de rand met gefluoreerde olie.
    4. Knijp voorzichtig in de buis om luchtbellen te ontsnappen uit de hersenen. Steek de Cap te voegen in de inzet van de buis cap om te voorkomen dat luchtbellen vanaf daar gevormd. Zet de dop, en sluit de buis met paraffine.
    5. Breng de buis in spoel zoals eerder beschreven. 3D T2 * parameters worden gegeven in tabel 1.
    6. Open de 18 anatomische 100 micron T2 * gewogen overnames in Mipav en registreer u om de 10 e overname. Registratieparameters zijn hetzelfde als in 1.1.7. Het gemiddelde van de geregistreerde beelden: Utilities, Afbeelding calculator-Bulk beelden, Average.

Resultaten

De werkstroom van deze methode is samengevat in figuur 1. Nadat de hersenen is gesneden, een visuele vergelijking tussen de MR beelden en beelden van het oppervlakkige oppervlak van de platen geeft een goede oriëntatie match meerdere platen (figuur 2). Nadat de platen zijn ingebed in paraffine, worden zij gesegmenteerd op een microtoom en gekleurd. Een grondiger vergelijking van de hoge resolutie postmortem MRI en de gekleurde histologische secties toont een accurate en consistente match in alle structuren van de marmoset hersenen (figuur 3).

In dit diermodel van MS, de dieren ontwikkelen wittestoflaesies verspreid over de cerebrale witte stof. Deze letsels kunnen invasief worden gedetecteerd door het uitvoeren van MRI. Figuur 4 toont het vermogen van deze techniek om de pathologische substraat van de MRI bevindingen helderen. Kleine laesies gedetecteerd op in vivo MRI kanworden gevolgd op zowel postmortem MRI en histologie. Zoals in de bijvoegsels, demyelinisatie in de laesies is een van de belangrijkste onderdelen aansturen van de MR signaalverandering (hyperintensiteit vergelijking met omliggende weefsel). De histologie en postmortem MRI ook letsels gemist in vivo MRI (Figuur 4) laten zien.

figure-results-1
Figuur 1. Workflow voor het creëren van een marmoset hersenen snijmachine doos. De hersenen gefixeerd met formaline (A1) en een T2-gewogen MRI wordt verkregen met isotrope voxels van 150 pm per rand (A2). De beelden worden verwerkt en thresholded om een ​​binair masker (A3) te creëren. Het oppervlak wordt vervolgens weergegeven in 3D modeling software (A4). Een Booleaanse aftrekken tussen een snijmachine template en de hersenen model creëert een digitaal model van de hersenen snijmachine (B1). De hersenen snijmachine vak wordt afgedrukt op een 3D printer (B2). De hersenen wordt vervolgens stevig in de snijmachine doos voor geplaatstsnijden (B3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Van links naar rechts: In vivo MRI, postmortem MRI, en weefsel plaat foto. Snijdende vlakken werden vastgesteld op basis van de postmortem MRI (B) en visueel vergeleken met de overeenkomstige in vivo MRI slice (A). De hersenen werden vervolgens gesneden en de resulterende platen bleken consistent (C) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Hoge-resolutie postmortem MRI en histologiesectie matching. Platen werden ingebed in paraffine, gesneden met een microtoom in 4 pm secties en gekleurd met snelle blauwe en cresylviolet (B). De coupes werden vervolgens visueel vergeleken met de 100 urn T2 * gewogen MRI gebaseerd op hersenstructuren (A). Details voor het verwerven van dit beeld zijn in de aanvullende sectie van het protocol en Tabel 1. Brain structuren: (1) rode pijl = interne capsule, blauwe pijl = commissura anterior; (2) rode pijl = putamen, blauwe pijl = optische-darmkanaal; (3) rode pijl = Spiegelse, blauwe pijl = hippocampus; (4) rode pijl = corpus callosum, blauwe pijl = cerebrale aquaduct; (5) rode pijl = inferior colliculus, blauwe pijl = piramidebaan. De gestippelde box aan B1 geeft een plakje wanneer zij tijdens hersenen snijden of inbedden in paraffine, een fout veroorzaakt een kleine rotatie om de Y-as, waardoor mismatch van de anterieure commissuur links. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4. Tracking laesies van in vivo MRI histologie sectie. De in vivo MRI toonde geen overtuigend bewijs van abnormale hyperintensiteit signaal aan laesies in beide optische-darmkanaal (A1) suggereren. Echter, de hoge resolutie postmortem MRI toont duidelijk hyper intense lijnen in zowel de optische traktaten (A2). De snelle blauw / cresylviolet vlek van een 4 urn histologie sectie blijkt dat de hyperintense gebieden gezien op de ex vivo MRI worden gedemyeliniseerde (A3). In de cerebrale witte stof, de in vivo MRI toont subtiel hyperintensiteit bilateraal (B1, uitgebreid in de inzetstukken). De hyperintense gebieden zijn meer voor de hand op de hoge resolutie postmortem MRI (B2). De LFB smet van een 4 urn histologie sectie blijkt dat deze gebieden gedemyeliniseerde (B3). Na vergelijking met de basislijn in vivo MRI en een hemotoxyline-en-eosine vlek, de rechterkant was vastbesloten om een anatomische afwijking, geen gedemyeliniseerd laesie zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Aanvullende code-bestanden. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: Klik hier om dit bestand te downloaden. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: Klik hier om dit bestand te downloaden. Cap_Insert.stl: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De hier geschetste protocol maakt een nauwkeurige vergelijking van MRI en histologie secties. Het protocol wordt in een standaard formaat dat kan worden toegepast op hersenen van mensen en kleine dieren, zoals knaagdieren of zijdeaapjes. Verschillen die specifiek zijn voor grote (menselijke) en kleine (niet-menselijke primaten en knaagdieren) hersenen zijn gemarkeerd en in de bijgaande video en cijfers tonen we de toepassing in de marmoset. De invalshoek is eenvoudig, de werkwijze vereist vele stappen en het gebruik van verschillende soorten software. Bovendien verschillende problemen mogelijk waardoor de nauwkeurigheid van deze methode is belangrijk te vermelden.

De beeldkwaliteit van de in vivo MRI is een belangrijke factor. Om het verschil in beeldresolutie tussen MRI en histologie gedigitaliseerde beelden te minimaliseren, moet de kleinst mogelijke MRI voxel grootte worden gebruikt. Deze definitie geldt ook voor de beeldkwaliteit van de postmortale MRI. Door de grotereacquisitie tijd in postmortem MRI maakt het mogelijk veel hogere beeldresolutie, de voorbereiding kan het artefacten te introduceren zoals focale signaal dropouts in verband met luchtbellen. Deze artefacten kunnen gebieden van het weefsel verhullen en beïnvloeden de contour. Bovendien, de afmetingen van het weefsel op de postmortale MRI waarschijnlijk worden beïnvloed door het fixatieproces en duur. Terwijl de in vivo ex vivo MRI vrijwel overeenkomen kan worden benaderd door gebruik anatomische oriëntatiepunten in slice geometrie opstart tijdens acquisitie zou een niet-lineaire registratie nog steeds nodig zijn om een hogere nauwkeurigheid bereikt in de aanpassing van deze twee MRI beelden.

Het ontwerp van de hersenen houder en snijmachine is een cruciale stap. Bij het creëren van het digitale model van de hersenen, is een egalisatie algoritme toegepast die enigszins vergroot het model opzichte van de vaste hersenen. Dit maakt gemakkelijk inbrengen van de hersenen in de houder en snijmachine en vermindert de scherpe randen in de houder &# 39; s contour. Indien het model te groot is (bijvoorbeeld meer dan 5%), de hersenen kan bewegen tijdens de postmortem MRI en / of snijden. Een ander belangrijk punt is het ontwerp van de hersenen model aan te passen dat het cerebellum goed in de 3D geprint object geplaatst. Dit kan vooral lastig zijn wanneer de kleine hersenen heeft tijdens de hersenen extractie bij de autopsie is beschadigd.

Bij het afdrukken van de hersenen snijmachine en houder, het type 3D printer moet ook zorgvuldig worden gekozen. Sommige multi-jet printers vereisen post-processing met behulp van een oven om steun materiaal te verwijderen. Hoewel deze printers objecten die waterdicht en relatief duurzamer dan desktop Fused Deposition Modeling (FDM) printers kan produceren, het verwarmingsproces aan steunen te verwijderen kan enigszins vervormen geven, creëren blade gaten die niet perfect loodrecht op de hersenen contour.

De hersenen snijden proces is een cruciale stap. Voor het snijden the gehele hersenen tot platen, is het belangrijk ervoor te zorgen dat de hersenen vast zit in de hersenen slicer er mag geen beweging wanneer lichte druk wordt aangebracht op de hersenen. Dit maakt het mogelijk dat de messen door de hersenen te snijden op de precieze locatie van de onderzoekers vastgesteld. Een continue, evenwichtige druk moet worden aangebracht op beide meshouders bij het zagen. Afhankelijk van de scherpte van de bladen en de stijfheid van het weefsel, kan een lichte dwarse snijbeweging voordelig voor handhaving platte snijvlakken zijn.

De paraffine inbedding proces kan ook een bron van verkeerde uitlijning tussen MRI en histologie worden. Als het weefsel niet vlak plaat zit tegen de cassette tijdens het inbedden, zal er een kanteling tussen het snijvlak van het microtoom en het oppervlak plaats van de plaat zijn. Dit vereist snijden onbruikbare gedeelten om een ​​plat vlak waarbij alle weefsel wordt blootgesteld voorbeeld. Een manier om te corrigeren voor de kantelingwordt door de hoek van het zichtbare vlak op de hoge-isotrope resolutie postmortem MRI. Dit is echter vrijwel onmogelijk kan worden uitgevoerd op de in vivo MRI die meestal wordt verkregen met anisotrope resolutie (meestal dikke coronale plakken).

Ten slotte kan het weefsel enkele vervorming tijdens de formaline fixatie periode en inbedden in paraffine (krimp) ervaren, evenals tijdens de voorbereiding van dia's (vouwen, scheuren, rimpels). Sommige van deze vervormingen kunnen worden gecorrigeerd door er 4-5 urn secties in een waterbad vóór de overbrenging op objectglaasjes. Andere vervormingen kan deels worden opgelost door het uitvoeren van vervormbare beeld coregistratie van de histologische gedigitaliseerde beelden naar de postmortale MRI-beelden. Niettemin minimaliseren van de vervormingen zorgvuldige en bekwame praktijk de meest effectieve aanpak overeenkomende MRI volumes secties histologie.

Tot slot, de hier geïntroduceerde methode maakt investigators om nauwkeurig te beoordelen van de onderliggende pathologie van MRI bevindingen. Meer in het algemeen is een veelbelovende benadering voor het identificeren en / of valideren van nieuwe biomerkers voor MRI onderzoeken die specifieke pathologische processen, zoals ontsteking of remyelinisatie targeten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Het Intramurale Onderzoeksprogramma van NINDS ondersteunde dit onderzoek. We danken de NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We danken Jennifer Lefeuvre en Cecil Chern-Chyi Yen voor hun hulp bij het verkrijgen van postmortem MRI. We danken John Ostuni en de Section on Instrumentation Core Facility voor hun hulp met 3D-printen. Figuur 1 van dit werk gebruikte snapshots van MeshLab, een tool ontwikkeld met de ondersteuning van het 3D-CoForm project.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
7T/30cm USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38 mm Bruker Biospin volume coilBruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, SterileCorning21008-951
Fisherbrand Gauze SpongesFisher Scientrific13-761-52
Parafilm M All-Purpose Laboratory FilmBemis
Leica RM2235 rotary microtome Leica
Leica Disposable Blades, low profile (819)Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1% AqueousElectron Microscopy Sciences26089-01
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% AlcoholElectron Microscopy Sciences26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended Ultimaker
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA  Filament, 2.85 mm, Silver MetallicUltimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2 (Blue Edition)Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.edu
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software

Referenties

  1. Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
  2. 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
  3. Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
  4. Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
  5. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  6. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  7. McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
  8. Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
  9. Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
  10. Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
  11. Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D printenMRI histologiecorrelatiehersensnijboxmagnetische resonantiebeeldvorminghistologische coupesuitlijning van hersenweefselprimatenbreindigitaal hersenmodelmicrotoommesjes

Gerelateerde artikelen