De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het is goed aanvaard dat ruggenmerg gliale respons aanzienlijk bijdragen tot de ontwikkeling van neuropathische pijn. Enorme informatie betreffende gliale activiteiten op cellulair en moleculair niveau is verkregen door middel van in vitro celkweek systemen. De in vitro-systemen gebruikt, die voornamelijk bestaan uit primaire glia afgeleid van neonatale hersenen corticale weefsel en onsterfelijk cellijnen. Echter kunnen deze systemen niet de kenmerken van ruggenmerg gliale cellen in vivo. Om de rol van ruggenmerg gliacellen in de ontwikkeling van perifere zenuw-verwonding geïnduceerde neuropathische pijn verder te onderzoeken met behulp van een kweeksysteem dat beter de in vivo toestand, heeft ons laboratorium een methode primaire ruggenmerg gemengde gliale culturen van ontwikkelde volwassen muizen. In het kort worden ruggenmerg van volwassen muizen verzameld en verwerkt door middel van papaïne digestie gevolgd door myeline verwijderen met een holenity-gradiënt medium. Enkele cel suspensies worden gekweekt in compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (cDMEM) aangevuld met 2-mercaptoethanol (2-ME) en 35,9 oC Deze kweekomstandigheden werden specifiek geoptimaliseerd voor de groei van gemengde gliale cellen. Onder deze omstandigheden zijn de cellen klaar voor gebruik voor experimenten tussen 12 - 14 d (cellen meestal logfase gedurende deze tijd) na de oprichting van de kweek (D 0) en kunnen in kweekcondities gehouden tot D 21. het kweeksysteem kan worden gebruikt om de reacties van ruggenmerg gliacellen na stimulatie met diverse stoffen en agentia te onderzoeken. Naast neuropathische pijn, kan dit systeem worden gebruikt om gliale reacties in andere ziekten die pathologische veranderingen op spinale gliacellen omvatten bestuderen.
Inleiding
Chronische pijn is een ernstig gezondheidsprobleem dat ongeveer 100 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten beïnvloedt, met een geschatte jaarlijkse kosten van maximaal $ 635.000.000.000 1. Groeiend bewijs heeft een belangrijke bijdrage op spinale gliacellen in de ontwikkeling van neuropathische pijn, een van de meest verwoestende vormen van chronische pijn 2 aangegeven. Een goede in vitro kweeksysteem aanzienlijk zou helpen hun onderzoek naar de rol van gliacellen op cellulair en moleculair niveau.
Momenteel is de in vitro gliale kweeksystemen gebruikt door onderzoekers behoren hoofdzakelijk gli....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het volgende protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van New England. Het volgende protocol is voor het bereiden van glialculturen van 4 volwassen muis ruggenmerg.
1. Voorbereiding van de Solutions in een cultuur van de Kap onder aseptische omstandigheden
- Bereid kweekmedia: compleet Dulbecco's modificatie van Eagle's medium (cDMEM) DMEM (met 4,5 g / l glucose), 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine , 250 ng / mL Amfotericine B, en 50 uM 2-mercaptoethanol (2-ME, zie 1.1.1). Mix en filter sterili....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze methode kan worden gebruikt om gemengde gliale cellen te bereiden uit zowel muizen als ratten. De gemiddelde totale aantal cellen per putje in een 12-well plaat op D 12 na initiatie van de kweek moet betrekkelijk stabiel zijn, ongeveer 100.000 cellen per putje wanneer cellen afkomstig uit muizen ruggenmerg. Gliale cellen verkregen uit deze werkwijze kan worden gebruikt in experimenten die zijn ontworpen om volwassen ruggenmerg gliale responsen na toediening van stoffen en agentia va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is cruciaal om alle stappen-met inbegrip van de media veranderen schema-op een consistente manier om reproduceerbare resultaten tussen de experimenten te verkrijgen uit te voeren. De volgende stappen zijn bijzonder kritisch bij het verkrijgen van een uitstekende kwaliteit voor volwassenen gemengde glia.
De enzymatische afbraak is een belangrijk aspect van dit protocol. Het is cruciaal dat het weefsel stukken zijn goed verteerd om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Echter, over-de s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Gemengde culturen van volwassen ruggenmerg werden voor het eerst ontwikkeld met behulp van ratten met subsidieondersteuning van een NIH/NIDA R01-award (PI De Leo) en een NIH T32-trainingssubsidie (PI Green). Deze methoden werden verder aangepast voor muisruggerggen met ondersteuning van de volgende subsidies: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) en NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). De auteurs willen ook Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, bedanken voor zijn technische hulp bij het verkrijgen van microglia-rijke gemengde gliacellen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modificatie van Eagle’s media (DMEM) met 4,5 g/L glucose | Lonza | 12-709F | Het cDMEM-medium is een standaard, veelgebruikt kweekmedium. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze het DMEM en alle andere componenten die worden gebruikt om cDMEM-medium te maken, kunnen kopen. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | De L-glutamine is een standaard, veelgebruikt onderdeel voor verschillende kweekmedia. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze L-glutamine kunnen kopen. |
| Antibioticum-Antimycotisch oplossing (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | Dit is een combinatie van penicilline, streptomycine en Amphotericin geformuleerd om 10.000 eenheden/mL penicilline G, 10 mg/mL streptomycinesulfaat en 25 µg/mL amfotericine B te bevatten. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze de afzonderlijke componenten kunnen kopen. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | Een BioReagent, geschikt voor celcultuur, moleculaire biologie en elektroforese. |
| Papaïne dissociatiesysteem | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | De individuele componenten van dit kit kunnen afzonderlijk worden gekocht. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll wordt verkocht als steriele oplossing. Onverdunde Percoll kan indien nodig opnieuw worden geautoclaveerd. |
| Lab-line incubator/schudder | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | Dit is de incubator/schudder die we momenteel hebben. Andere soorten schudders kunnen in plaats daarvan worden gebruikt. |
| Lipopolysacchariden, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Andere stammen van LPS kunnen ook gliale reacties induceren. De omvang van de reacties kan echter variëren. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | Dit product was op het moment niet beschikbaar voor in-house analyse. In plaats daarvan hebben we monsters naar de fabrikant gestuurd voor analyse. |
| APC-anti-muis-CD45 (kloon 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antilichaam van dezelfde kloon maar van andere leveranciers kan worden gebruikt. |
| FITC-anti-muis-CD11b (kloon M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antilichaam van dezelfde kloon maar van andere leveranciers kan worden gebruikt. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Elke individuele onderzoeker kan elke flow cytometer gebruiken die hij of zij het liefst gebruikt. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Elke individuele onderzoeker kan elke analysesoftware gebruiken die hij of zij het liefst gebruikt. |
Referenties
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
