Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space via Een Transcleral Posterior Approach

Summary

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Abstract

Subretinale injecties zijn met succes gebruikt bij zowel mensen als knaagdieren therapeutische interventies van eiwitten, virale middelen, en cellen leveren aan de interphotoreceptor / subretinale ruimte die directe blootstelling aan de fotoreceptoren en retinaal pigmentepitheel (RPE) heeft. Subretinale injecties van plasminogeen en recente preklinische en klinische onderzoeken hebben aangetoond veiligheid en / of werkzaamheid van het leveren van virale vectoren en stamcellen voor personen met gevorderde ziekte van het netvlies. Muismodellen van het netvlies en vaatziekten, in het bijzonder erfelijke retinale dystrofie, zijn van essentieel belang voor het testen van deze therapieën. De meest voorkomende injectieprocedure bij knaagdieren is om kleine transcorneal of transcleral incisies gebruiken met een anterieure benadering van de retina. Met deze aanpak, de injectienaald dringt de neurosensorische retina het verstoren van de onderliggende RPE en bij het inbrengen kan gemakkelijk nick de lens, waardoor de lens vertroebeling en bijzondere waardevermindering van niet-invasieve Imaging. Toegang tot de subretinale ruimte via een transcleral, posterior aanpak vermijdt deze problemen: de naald steekt de sclera ongeveer 0,5 mm van de oogzenuw, zonder retinale penetratie en voorkomt het verstoren van het glasvocht. Nevenschade wordt beperkt tot die welke samenhangt met de focale sclerotomie en de effecten van een voorbijgaande sereuze netvliesloslating. De eenvoud van de methode minimaliseert oculaire verwonding, zorgt voor een snelle retinale herbevestiging en het herstel, en heeft een laag uitvalpercentage. De minimale schade aan het netvlies en RPE maakt een goede evaluatie van de werkzaamheid en de directe effecten van de therapeutische middelen zelf. Dit manuscript beschrijft een nieuwe subretinale injectie techniek die kan worden gebruikt om te richten virale vectoren, farmacologische middelen, stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan de subretinale ruimte in muizen met hoge efficiëntie, minimale schade en snel herstel.

Introduction

Subretinale injecties zijn het belangrijkste middel van het leveren van cellulaire en virale middelen om de netvliezen van muizen om hun effecten op fotoreceptoren en de onderliggende RPE ^1,2 bestuderen. Meest subretinale injectie protocollen muizen hebben een transcorneal of transcleral injectieplaats juist voor de evenaar (figuur 1). Deze benadering kan leiden tot inherente nevenschade die knikken en resulterende vertroebeling van de lens, verstoring van de integriteit van het glasachtig lichaam binnendringen van de neurosensorische retina en iris, retinale bloeding, netvliesloslatingen aanzienlijke en blijvende subretinale oedeem ^3-9 omvat. Experimentele manipulaties moeten deze effecten om de effecten van therapeutische interventies ^3,7,10,11 evalueren overwinnen. Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving en validatie van een posterior transcleral injectie methode die deze complicaties vermijdt, minimaliseert trauma en heeft een hoog slagingspercentage van gericht op de subretinale ruimte.

Injecties gericht op de subretinale ruimte in muizen vaak zeer moeilijk uit te voeren en de meeste onderzoekers geconfronteerd met een hoge frequentie van mislukte pogingen waarbij de vector een onjuiste locatie wordt geleverd of er significante schade aan het netvlies, bijvoorbeeld in een volledige netvliesloslating ^6. Het aantal ogen uitgesloten van de analyse door de injectie complicaties is meestal niet gemeld in de muis studies, maar in onze eigen ervaring en in overleg met andere onderzoekers, kan het aantal mislukte injecties zo hoog als 50% zijn en variëren afhankelijk van de ervaring en de capaciteiten van de onderzoeker die het uitvoeren van de injecties. Het succes van de injectie wordt typisch bepaald door directe fundus beeldvorming en / of optical coherence tomography (OCT) ^7,9. Een gemakkelijk onder de knie methode met een hoge slagingspercentages voor subretinale injecties in muizen kunnen experimenteren bespoedigen en de kosten van preklinische studies van treatments voor retinale ziekten die belangrijkste oorzaken van blindheid in de Verenigde Staten.

De achterste, transcleral subretinale injectie techniek die hier beschreven is een aanpassing van de klinische en preklinische protocollen ^9,12. De niet-invasieve diagnostische evaluaties uitgevoerd in geïnjecteerde muizen tonen mild en zeer plaatselijk schade en het gebrek aan aanvullende zekerheden lens, het netvlies en RPE letsel. Bovendien, met relatief weinig praktijk, een experimentator kan deze resultaten met een hoog slagingspercentage te bereiken (80 - 90% of beter), waardoor de kosten in verband met dergelijke studies verminderen. Deze procedure kan worden gebruikt om cellulaire, virale of farmacologische therapeutische interventies fotoreceptoren en / of RPE leveren preklinische studies en experimentele ingrepen gemakkelijk evalueren.

Protocol

Dieren: Wild-type C57BL / 6J muizen gekweekt aan de Universiteit van Californië in Los Angeles (UCLA). Alle dieren waren tussen 11-17 weken oud, en omvatte mannelijke en vrouwelijke muizen. Alle muizen werden in groepen te huisvesten, onderhouden in een 12:12 licht / donker-cyclus met voedsel en water ad libitum. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van UCLA en de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research.

LET OP: Alle drugs en injecteerbare agenten zijn United States Pharmacopeia (USP) rang.

1. Chirurgische Voorbereiding

1. Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 8 mg / kg xylazine in een zoutoplossing mix. Dien anesthesie tot een diepte zodanig dat de muis heeft geen teen knijpen of hoornvlies aanraking reflexen.
2. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37,0 ° C met een circulerend water pad.
3. Verwijden leerlingen met 2,5% fenylefrine eye drops en trim snorharen om visualisatie te vergemakkelijken. Bakkebaarden bieden significante sensorische input voor de muis derhalve whisker trimmen mag alleen het gedeelte te verwijderen die blokkeert goed toegankelijk voor het oog, en niet aan de basis van de whisker. In onze ervaring, muizen tonen normaal herstel na deze procedure. Solliciteer methylcellulose oogdruppels tot droog te voorkomen en te minimaliseren verdoving geïnduceerde voorbijgaande cataract ^13.
4. Steriliseren instrumenten voorafgaand aan de operatie (dwz betadine en ethanol of warm kralen).
5. Bereid verdunde fluoresceïne (0,01% met behulp van 0,9% zoutoplossing) in een steriele omgeving (dat wil zeggen, bioveiligheid kast) of visualisatie wordt uitgevoerd (zie punt 3 hieronder).

2. Injectie Site Voorbereiding

1. Bereid een injectiespuit (bijvoorbeeld 5 gl spuit) gepaste injectievolume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 gl).
2. Plaats de muis, zodat het oog naar boven en duidelijk zichtbaar in de dissecting microscoop.
3. Knijp de temporele bindvlies met fijne getipt pincet. Maak een omtrek incisie van ongeveer 90 graden met behulp van gebogen Vannas schaar.
4. Herhaal stap 2.3 met capsule de onderliggende Tenon.
5. Resect het omringende bindweefsel met fijne getipt pincet tijdens het draaien van de hele wereld nasaal. Werken aan de injectieplaats ongeveer 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw. Gebruik grote zorg om te voorkomen dat het verstoren van de retro-orbitale sinus.

3. sclerotomie en Subretinal Injection

OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de injectie van 0,01% fluoresceïne in 0,9% zoutoplossing worden gebruikt om te helpen met visualisatie tijdens het leren van deze procedure. De topografische distributie van fluoresceïne kan effectief worden gedocumenteerd met fundus beeldvorming (zie punt 4 hieronder).

1. Maak een kleine sclerale incisie op de injectieplaats door zachtjes krassen op de oogschelp met een 22,5 graden oogheelkundige mes. Deze incisie shouLD alleen groot genoeg om de punt van de naald door de sclera te passeren.
2. Plaats de afgeschuinde 33 G naald (hoek 5 -. 10 ° in de sclerotomie de afschuining gericht en hoekig evenwijdig aan het netvlies Injecteer gewenste volume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 ui van 0,01% Fluoresceïne voor leerdoeleinden).
   OPMERKING: Handhaaf steriliteit van de injectiespuit door het grondig reinigen met opeenvolgende wassingen van een geschikt oplosmiddel en DI-water voor elke injectie.
3. Druk de zuiger langzaam (meer dan 3 sec) zonder het verplaatsen van de naald en met gelijkmatige druk.
   LET OP: Als de naald in de subretinale ruimte, zal een lichte weerstand gevoeld worden, terwijl het indrukken van de zuiger. Er zal geen tot minimale weerstand zijn als de naald prikt het netvlies, en een hoge weerstand als de naald de sclera of RPE niet doordringen.
4. Wacht enkele seconden voordat de naald terug te trekken om terugstroom te minimaliseren.
5. Spoel het oog met steriele zoutoplossing en zorgen voor het oog hals terug naar zijn normale positie geroteerd.

4. Beoordeling van Netvliesloslating van oktober en Fundus Imaging

1. Voer oktober beeldvorming direct na de toediening van de kwaliteit van de injectie te evalueren en op geschikte tijdstippen na injectie als nodig netvliesstructuur evalueren.
   OPMERKING: Voorbeelden van het gebruik van LGO soortgelijke studies is eerder beschreven ^7,14.
   1. Pas en lijn beeld oktober naar de plaats van injectie te richten. De injectieplaats moet middellijn en 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw hoofd. Herhaal dit zo nodig als het detachement is uit frame of niet optimaal gecentreerd.
2. Visualiseer netvliesloslating en kleurstof injectie met en-gezicht fundus imaging ^7,14.
   LET OP: Als een LGO imaging-systeem niet beschikbaar is, injectie van een kleine hoeveelheid fluoresceïne met een vector voor de praktijk zal visualisatie bij elke fundus camera die fluoresceïne angio presteert toestaanGraphy met dezelfde golflengten en filters blokkeren. Gelokaliseerde gebieden van hyper-fluorescentie zal verschijnen onder het vaatstelsel en het vaatstelsel zullen scherpe en duidelijke grenzen hebben als de subretinale ruimte correct is gericht. De rand van de bleb van de injectie wordt afgebakend door de overgang van hyper- hypo- fluorescentie. Diverse instrumenten voorzien deze mogelijkheid voor de muis; de instrumentatie die hier gebruikt wordt elders ¹⁴ beschreven.

5. postoperatieve zorg

1. Breng een dikke laag van triple antibiotica oogheelkundige room aan de cornea oppervlak van de geïnjecteerde oog.
2. Plaats muizen in schone eenzame kooien voor herstel. Niet muizen die een operatie hebben ondergaan, totdat ze volledig hersteld te combineren.
3. Monitor ademhaling en temperatuur tijdens anesthesie herstel. Monitor dieren totdat ze borstligging kunnen handhaven.
4. Voer extra juiste post-operatieve bewakingen behandeling, met een subcutane injectie van carprofen (5 mg / kg) voor post-operatieve pijn.

6. Beoordeling van retinale functie door Electroretinografie (ERG)

1. Voer ERG analyse pre-injectie en op geschikte tijdstippen na de injectie als nodig is om het netvlies functie te evalueren. Als de injectie werd gemaakt in de subretinale ruimte, moet netvliesloslating verdwijnen binnen 72 uur.
   1. Gebruik standaard ERG technieken om retinale functie geëvalueerd voor en na de injectie zoals eerder beschreven ^14,15.

7. 3D Wederopbouw en Bleb Volume kwantificering

LET OP: oktober scans met een hoog contrast omvat het gehele detachement in het kader van het uitzicht zijn optimaal voor gebruik. ImageJ / Fiji ^17,18 en Imaris werden gebruikt, maar ook andere software kan worden gebruikt.

1. Exporteer de b-scan van belang, de invoer in ImageJ / Fiji en gewas (Afbeelding> Crop) het gedeelte van de oktober sceen te worden gemodelleerd met behulp van de rechthoekige selectie tool.
   1. Stel contrast (Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast) en de afbakening van eventuele ontbrekende grenzen door het verbinden van twee delen met een lijn.
   2. Trek een rechte lijn met de line tool (met shift) dat de RPE aan de fotoreceptor laag overspant. Measure (Analyze> Measure) de lengte van de lijn om de grootte van de maximale onthechting te krijgen voor stap 7.8.
2. Import bijgesneden frames om de 3D-reconstructie software (zie tabel van materialen) met behulp van de "RGB naar grijs" plugin en MATLAB Compiler Runtime.
3. Stel de voxel grootte (onder Eigenschappen afbeelding) met behulp van de kalibratie parameters uit de LGO scan (x, y, z).
4. Voer de "RGB Gray" plugin (onder Eigenschappen afbeelding), met gelijke weging voor elk kanaal, een vierde kanaal te maken. Verwijder origineel rood-groen-blauw-kanalen.
5. Keren de grijze kanaal met contrast verandering. Store Afbeelding.
6. Klik op de "voeg eenew oppervlak "knop in het tabblad 3D-View, en beginnen met de begeleide 4 stap proces van het creëren van het oppervlak.
   1. Stel het maaiveld detail (stap 1 van 4).
      LET OP: In onze ervaring 8,0-12,0 was de meest effectieve bereik.
   2. Zet de bol grootte (onder Achtergrond Selectie) iets minder dan de maximale grootte detachement gemeten in 7.1.2. Maak het oppervlak en ongedaan te maken grijze kanaal inversie (stap 2 van 4).
   3. Stel de drempel op de maximale waarde, zodat het oppervlak van de negatieve ruimte buiten het netvlies en de onthechting niet in contact komen (stap 3 of 4).
   4. Stel het filtertype het aantal voxels en isoleren negatieve ruimte in het losmaken plaats op grootte. Finish het oppervlak (stap 4 van 4).
      Opmerking: Het volume van de loslating oppervlak onder volume in het tabblad statistieken.

Results

Postérieure benadering transcleral subretinale injecties werden uitgevoerd op 31 gezonde ogen van 16 wildtype muizen injecties van 0,3 ui (n = 18), 0,5 ui (n = 8) en 1,0 ui (n = 5) van 0,01% fluoresceïne. Eén oog werd uitgesloten van injectie door een bestaand hoornvlies dat structurele en functionele analyse voorkomen. Elk geïnjecteerd oog is opgenomen in dit rapport. Geen onbedoelde netvliesloslatingen, puncties van de neurosensorische retina, of lekkage in het glasvocht werden ontdekt...

Discussion

Subretinale injecties zijn de voorkeurswerkwijze voor de afgifte van virale vectoren en stamcellen afgeleide therapie voor het manipuleren fotoreceptoren en RPE zowel fundamenteel onderzoek en klinische behandeling. Bij patiënten, worden subretinale injecties meestal gedaan met een voorste sclerotomie bij de pars plana, een posterior kern vitrectomie en penetratie van het netvlies door de naald met directe visualisatie. Zoals bij de meeste vitrectomie procedures, is het gebruikelijk voor cataract voortijdig plaatsvinden...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spuit x 1
Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 roestvrij staal)	Hamilton	7803-05	Naalden x 6
Vannas Gebogen Schaar	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Blad
22.5 Graad Microchirurgie Mes	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluoresceïne 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
Antibioticumzalf	Akorn	NDC 17478-235-35	Oogmedicijn
Watercirculatiepomp	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercieel
Fundus Camera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pincet Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Fenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Oogmedicijn
IMARIS8	Bitplane		Versie 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose 2.5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Oogdruppels (spoelen)	Bausch & Lomb		Zoute oplossing
Microscoop	Zeiss	Stemi 2000	Microscoop
Lichtbron	Fostec	P/N 20520	Lichtbron