Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space via Een Transcleral Posterior Approach

Summary

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Abstract

Subretinale injecties zijn met succes gebruikt bij zowel mensen als knaagdieren therapeutische interventies van eiwitten, virale middelen, en cellen leveren aan de interphotoreceptor / subretinale ruimte die directe blootstelling aan de fotoreceptoren en retinaal pigmentepitheel (RPE) heeft. Subretinale injecties van plasminogeen en recente preklinische en klinische onderzoeken hebben aangetoond veiligheid en / of werkzaamheid van het leveren van virale vectoren en stamcellen voor personen met gevorderde ziekte van het netvlies. Muismodellen van het netvlies en vaatziekten, in het bijzonder erfelijke retinale dystrofie, zijn van essentieel belang voor het testen van deze therapieën. De meest voorkomende injectieprocedure bij knaagdieren is om kleine transcorneal of transcleral incisies gebruiken met een anterieure benadering van de retina. Met deze aanpak, de injectienaald dringt de neurosensorische retina het verstoren van de onderliggende RPE en bij het inbrengen kan gemakkelijk nick de lens, waardoor de lens vertroebeling en bijzondere waardevermindering van niet-invasieve Imaging. Toegang tot de subretinale ruimte via een transcleral, posterior aanpak vermijdt deze problemen: de naald steekt de sclera ongeveer 0,5 mm van de oogzenuw, zonder retinale penetratie en voorkomt het verstoren van het glasvocht. Nevenschade wordt beperkt tot die welke samenhangt met de focale sclerotomie en de effecten van een voorbijgaande sereuze netvliesloslating. De eenvoud van de methode minimaliseert oculaire verwonding, zorgt voor een snelle retinale herbevestiging en het herstel, en heeft een laag uitvalpercentage. De minimale schade aan het netvlies en RPE maakt een goede evaluatie van de werkzaamheid en de directe effecten van de therapeutische middelen zelf. Dit manuscript beschrijft een nieuwe subretinale injectie techniek die kan worden gebruikt om te richten virale vectoren, farmacologische middelen, stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan de subretinale ruimte in muizen met hoge efficiëntie, minimale schade en snel herstel.

Introduction

Subretinale injecties zijn het belangrijkste middel van het leveren van cellulaire en virale middelen om de netvliezen van muizen om hun effecten op fotoreceptoren en de onderliggende RPE ^1,2 bestuderen. Meest subretinale injectie protocollen muizen hebben een transcorneal of transcleral injectieplaats juist voor de evenaar (figuur 1). Deze benadering kan leiden tot inherente nevenschade die knikken en resulterende vertroebeling van de lens, verstoring van de integriteit van het glasachtig lichaam binnendringen van de neurosensorische retina en iris, retinale bloeding, netvliesloslatingen aanzienlijke en blijvende subretinale oedeem ^3....

Protocol

Dieren: Wild-type C57BL / 6J muizen gekweekt aan de Universiteit van Californië in Los Angeles (UCLA). Alle dieren waren tussen 11-17 weken oud, en omvatte mannelijke en vrouwelijke muizen. Alle muizen werden in groepen te huisvesten, onderhouden in een 12:12 licht / donker-cyclus met voedsel en water ad libitum. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van UCLA en de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research.

LET OP: Alle drugs en injecteerbare agenten zijn United States Pharmacopeia (USP) rang.

1. Chirurgische V....

Results

Postérieure benadering transcleral subretinale injecties werden uitgevoerd op 31 gezonde ogen van 16 wildtype muizen injecties van 0,3 ui (n = 18), 0,5 ui (n = 8) en 1,0 ui (n = 5) van 0,01% fluoresceïne. Eén oog werd uitgesloten van injectie door een bestaand hoornvlies dat structurele en functionele analyse voorkomen. Elk geïnjecteerd oog is opgenomen in dit rapport. Geen onbedoelde netvliesloslatingen, puncties van de neurosensorische retina, of lekkage in het glasvocht werden ontdekt.......

Discussion

Subretinale injecties zijn de voorkeurswerkwijze voor de afgifte van virale vectoren en stamcellen afgeleide therapie voor het manipuleren fotoreceptoren en RPE zowel fundamenteel onderzoek en klinische behandeling. Bij patiënten, worden subretinale injecties meestal gedaan met een voorste sclerotomie bij de pars plana, een posterior kern vitrectomie en penetratie van het netvlies door de naald met directe visualisatie. Zoals bij de meeste vitrectomie procedures, is het gebruikelijk voor cataract voortijdig plaatsvinden.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Vannas Curved Scissors	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Blade
22.5 Degree Microsurgery Knife	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
Antibiotic Ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	Ophthalmic
Water Circulating Pump	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Fundus Camera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Tweezers Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose 2.5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Eye Drops (Rinse)	Bausch & Lomb		Saline Solution
Microscope	Zeiss	Stemi 2000	Microscope
Light source	Fostec	P/N 20520	Light source