Methodenartikel

Een model van remodellering Door vernauwing van de abdominale aorta bij ratten

DOI:

10.3791/54818

⸱

2 december 2016

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mackay Memorial Hospital, 3Mackay Medicine, Nursing and Management College, 4School of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hosptial

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een rattenmodel van abdominale aortaconstrictie dat cardiale hypertrofie en remodellering induceert, wordt beschreven. Een efficiënte, zeer reproduceerbare en minimaal invasieve methode wordt gebruikt om een eenvoudige maar nuttige platform te bieden voor onderzoek naar myocardiale hypertrofie en disfunctie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hartfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Het is een complex klinisch syndroom dat vermoeidheid, kortademigheid, inspanningsintolerantie en vochtretentie omvat. Veranderingen in de myocardstructuur, elektrische geleiding en energiemetabolisme ontwikkelen zich bij hartfalen, wat leidt tot contractiele disfunctie, verhoogd risico op aritmieën en plotselinge dood. Hypertensieve hartziekte is een van de belangrijkste bijdragende factoren van cardiaal remodelleren geassocieerd met hartfalen. Het meest gebruikte diermodel dat hypertensieve hartziekte nabootst, wordt gemaakt via chirurgische ingrepen, zoals door het vernauwen van de aorta. Abcessie van de abdominale aorta is een nuttige experimentele techniek om een drukbevrachting te induceren, wat leidt tot hartfalen. De operatie kan eenvoudig worden uitgevoerd, zonder de noodzaak van het openen van de borstkas of mechanische ventilatie. Door abdominaal aortavernauwing veroorzaakte cardiale pathologie vordert geleidelijk, waardoor dit model relevant is voor klinische hypertensieve hartfalen. Cardiale letsels en remodellering kunnen 10 weken na de operatie worden waargenomen. De hier beschreven methode biedt een eenvoudige en effectieve aanpak om een diermodel van hypertensieve hartziekte te produceren dat geschikt is voor het bestuderen van ziektemechanismen en voor het testen van nieuwe therapeutische middelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hartfalen is een complex klinisch syndroom, waarvan de symptomen zijn vermoeidheid, dyspnoe, inspanningsintolerantie en vochtophoping in perifere weefsels. Het is de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen 1. Naast erfelijke cardiomyopathie veroorzaakt door mutaties in sarcomeer eiwitten of ionkanalen 2, kan myocardiale disfunctie veroorzaakt door een verscheidenheid aan medische aandoeningen, waaronder hypertensie, hartklepaandoeningen, obesitas en diabetes 3. Veranderingen in het myocard structuur, elektrische geleiding en energiemetabolisme leiden tot onvoldoende cardiale pompcapaciteit om de bloedsomloop eisen, wat uiteindelijk resulteert in hartfalen 3,4 ontmoeten. De mechanismen die ten grondslag liggen hartfalen derhalve kritisch op het gebied van cardiovasculair onderzoek. Het identificeren moleculaire mechanismen die leiden tot hartfalen progressie uiteindelijk helpen bij de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten of nuttig biomerkers 1. Het is daarom belangrijk om hartfalen dierlijke modellen die de belangrijkste klinische kenmerken deelt met hartfalen bij mensen 5 ontwikkelen.

Cardiale hypertrofie en remodellering speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van hartfalen. Hypertensieve hart-en vaatziekten is de belangrijkste bijdragende factor van cardiale hypertrofie en de onaangepaste remodeling gezien bij menselijke patiënten 1. Om deze menselijke omstandigheden na te bootsen, zijn diermodellen vaak vastgesteld door middel van chirurgische procedures. In het bijzonder kan de dwars- of abdominale aorta wordt vernauwd tot de weerstand tegen de linker ventrikel, wat uiteindelijk leidt tot een drukoverbelasting in het hart te verhogen. Dit verschijnsel leidt gewoonlijk tot cardiale hypertrofie, een fysiologische compensatie van de hartspiercellen op de functionele eis van het cardiovasculaire systeem. Echter, de functionele vraag voorrang op de normale fysiologische compensatiemechanismen, wat leidt tot cardiale fibrose en contractegel impairment. Dwarse aorta vernauwing (TAC) chirurgie gaat vaak ingewikkelde procedures, waaronder thoracotomie, mechanische ventilatie en scheiding van de thymus en vetweefsel van de aortaboog. Daarentegen abdominale aorta vernauwing vereist eenvoudiger experimentele technieken 6-8. De abdominale aorta tussen het linker en rechter nierslagaders vernauwd tijdens de operatie. Cardiale hypertrofie en remodellering kan enkele weken waargenomen na de abdominale aorta vernauwing chirurgie 6-8; zij produceren robuuste hypertensieve hartziekte vergelijkbaar met die die door de dwarse aorta vernauwing chirurgie 9,10. We beschrijven hier een protocol abdominale aorta vernauwing gedrag in ratten een efficiënt, zeer reproduceerbare en minimaal-invasieve methode. De abdominale aorta naast de nierslagaders vernauwd door een 0,72 mm lus gevormd door een 4-0 zijden draad. Tien weken na de operatie, cardiale hypertrofie en remodeling waarneembaar. Het rattenmodel van abdominale aorta-vernauwing geïnduceerde cardiale hypertrofie verschaft een platform voor het bestuderen van ziektemechanismen en pathofysiologie, alsook de ontwikkeling van potentiële therapeutica.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door het Amerikaanse National Institutes of Health (NIH publicatie nr. 85-23, herzien 1996). Dit protocol werd goedgekeurd door en in overeenstemming met de uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite bij National Taiwan University richtlijnen.

1. Dierlijke Surgery

  1. Bereid een 22 G injectienaald door afstomping de punt van de naald op een honen steen. Met behulp van een tang, plicate de naald in een rechte hoek.
  2. Voor de operatie voorbereiden die nodig chirurgische instrumenten en materialen, evenals een herstelkooi. Autoclaaf alle instrumenten en chirurgisch materiaal voor gebruik.
  3. Handhaving van de ratten ongeveer 200 g en houd ze onder 12 uur licht / donker cycli bij een gecontroleerde temperatuur (21 ± 2 ° C) met vrije toegang tot voedsel en water. Ten minste 6 ratten in elke groep. Verdoven de ratten met pentobarbital(75 mg / kg in 0,5 ml, ip) of een ander geschikt anestheticum. Controleer de diepte van de anesthesie door het testen van de staart reflex.
    OPMERKING: De afwezigheid van staart reflex is een indicator van geschikte anesthesie.
  4. Plaats een rat in rugligging op een operatie platform met een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven. Scheer de buikstreek van de rat met een dierlijk haar clipper en haar remover lotion chirurgische besmettingen te voorkomen. Schrob de netjes geschoren achterlijf met betadine of een andere reinigende reagens voor de operatie.
    NB: Het is belangrijk om een ​​steriel veld te houden gedurende de hele procedure.
  5. Voeg een 2 cm incisie langs de middellijn van het abdomen met een scalpel. Met behulp van een fysiologische zoutoplossing, houden de buik orgel vochtig tijdens de operatie. Verplaats de spijsverteringsorganen voorzichtig opzij behulp watten de inferior vena cava dat ligt in het achterste peritoneale regio bloot. Identificeer de abdominale aorta, die ligt geplaatst naast en meestal aan delinks van de inferior vena cava.
    NB: De abdominale aorta is het schip dat pulseert in de tijd met de hartslag.
  6. Doorboren het peritoneum met een tang om de schepen eronder bloot. Voorzichtig de abdominale aorta nabij de nierslagaders isoleren en passen een 8 cm lange 4-0 zijden hechtdraad onder de abdominale aorta tussen de oorsprong van de rechter en linker nierslagaders.
  7. Maak een losse dubbele knoop met de hechtdraad; laat een diameter lus 3 mm, en plaats de afgestompte en boog 22 G naald in de lus. Draai de knoop rond de aorta en de naald en verwijder de naald onmiddellijk tot een diameter vernauwing 0,7 mm te bereiken.
  8. Sluit de buikholte met 6-0 absorbeerbare hechtmateriaal. Hecht de spier of incisies met eenvoudige onderbroken hechtingen. Om infectie te voorkomen, scrub de chirurgische site met een jodium tinctuur.
  9. Observeer het dier voorzichtig tot het voldoende bewustzijn herwint, zoals aangegeven door het vrije verkeeren voedselinname. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Om te voorkomen na de operatie pijn, de behandeling van de rat met acetaminofen (300 mg / kg in 0,5 ml, ip).
    OPMERKING: Gebruikers moeten analgetica toedienen, zoals goedgekeurd door institutionele beleid.

2. Tissue and Blood Sample Collection

  1. Op 10 weken na de operatie, wegen de rat en verdoven met pentobarbital (75 mg / kg in 0,5 ml, ip). Voor de operatie, bevestigen de diepte van de anesthesie door het testen van zijn staart reflex. Plaats de rat op een metalen dienblad.
  2. Voeg een 2 cm incisie langs de middellijn van de hals met een scalpel. Verplaats de spieren voorzichtig met een tang om de luchtpijp bloot. Observeer aandachtig naar de halsslagaders, die parallel aan de luchtpijp zijn en pulseren in de tijd met de hartslag te identificeren.
  3. Verzamel het bloed van de halsslagader in een Bloedverzamelinrichting buis bekleed met EDTA. onmiddellijk centrifugehet bloed gedurende 15 minuten bij 2000 xg en het verzamelen van het plasma. Bewaar het bloedplasma bij -80 ° C totdat het nodig is.
  4. Maak een 5 cm incisie in de thoracale regio, rond de middellijn van xyphoid proces. Doorboren het membraan met scherpe tang. Met behulp van een schaar, knippen en verwijder de ribbenkast langs de mid-claviculaire lijnen aan beide zijden naar het hart bloot te leggen. Accijnzen het hart voorzichtig langs de cardiale en vasculaire grenzen. Verwijder het hart voorzichtig zonder grijpen het weefsel.
  5. Monteer het hart op een gemodificeerde Langendorff perfusie apparaat door koppelverkoop de aorta stam naar de perfusie naald. Perfuseren het hart met Krebs buffer (die 110 mM NaCl, 2,6 mM KCI, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, en 11 mM glucose [pH 7,4]) uit te spoelen het bloed. Weeg het hart en het berekenen van de hart-weight-to-body-gewichtsverhouding. Bevestig het hart met 4% paraformaldehyde op het ijs. Vergeet niet om een ​​masker te dragen, omdat paraformaldehyde damp is toxic.

3. Tissue Fibrosis Kwantificering

  1. Plaats het paraformaldehyde gefixeerd hartweefsel op een weefsel snijden en snij inrichting 2 mm dikke panelen. Plaats de weefselcoupes per inbedding cassette. Dehydrateer het weefsel door een reeks van gegradeerde alcohol baden (50%, 75%, 95% en 100% voor 1 uur elk).
  2. Infiltreren het weefsel met xyleen gedurende 1 uur en tenslotte in was gedurende 1 uur. Plaats het geïnfiltreerde weefsel in een inbedding cassette en insluiten met paraffine. Bewaar de ingebedde weefsels in paraffine blokken bij kamertemperatuur totdat microtoming.
  3. Snijd de ingebedde weefsel in 4 pm dikke secties. Leg de secties in een 45 ° C waterbad. Dompel een glasplaatje in het waterbad onder een hoek en geleidelijk aan de aanpak van de paraffine sectie randen gedeeltelijke bevestiging aan de dia toe te staan.
  4. Beweeg de schuif in en uit het bad om potentiële luchtzakken onder het gedeelte weefsel te verwijderen en om een ​​betere hechting te vergemakkelijken. droge tHij schuift bij 37 * C gedurende 1 uur en opgeslagen bij kamertemperatuur histologische kleuring.
  5. Zet de schuif in een tank. Deparaffinize de dia met xyleen gedurende 30 min en hydrateren in opeenvolgend verdunde alcohol (95%, 75% en 50% gedurende 3 min elk) en tenslotte in gedestilleerd water. Met adequate picrosirius rode oplossing volledig te bedekken de weefselcoupes gedurende 1 uur. Spoel de dia's in een 0,5% azijnzuur oplossing voor twee wijzigingen, en vervolgens uit te voeren twee spoelingen in absolute alcohol.
  6. Air-droog de glijbaan en monteer de dia in kunsthars met een dekglaasje. Fotografeer de dia in een zichtbaar licht veld.
    LET OP: Het rode gebied in de foto toont een picrosirius rode positieve zone onder een microscoop bij 200X vergroting. Bereken het percentage positieve picrosirius rode zone boven de oppervlakte, wat aangeeft de mate van fibrose 11.

4. Bloed troponine kwantificering

  1. Kwantificeren plasma troponine niveausonder toepassing van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Assay elk monster in duplo. Belasting 50 pl bloed plasma en 50 pl van een antilichaam cocktail in de geschikte putjes. Verzegel de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamer temperatuur op een plaat schudder bij 400 rpm.
    OPMERKING: troponine in het plasma is een marker voor cardiale schade.
  2. Zuig het vloeistof en was elk putje met 250 ui wasbuffer driemaal. Na de laatste wasbeurt, draai de plaat en dep het tegen schone papieren zakdoekjes om overmatige vloeistof te verwijderen.
  3. Voeg 100 pl tetramethylbenzidine substraat aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten in het donker op een plaat schudder bij 400 rpm. Voeg 100 gl stopoplossing aan elk putje. Schud de plaat op een plaat schudder gedurende 1 min mengen. Noteer de optische dichtheid (OD) bij 450 nm.
    NB: De troponine-concentratie in verhouding staat tot de OD-waarde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 weken na de abdominale aorta vernauwing chirurgie, werd de resulterende cardiale pathologie geanalyseerd. De cardiale histologie werd gemeten als de verhouding van het gewicht van het hart tot het lichaamsgewicht en door het detecteren van de hoeveelheid collageen in het hart. Cardiale schade werd bevestigd door meting van plasma cardiaal troponine concentratie.

Zoals getoond in figuur 1A, is de cardiale gr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hypertensieve hartziekte, een groot gezondheidsprobleem dat aanzienlijk bijdraagt aan morbiditeit en mortaliteit, kan leiden tot cardiale hypertrofie en hartfalen5. De pathogenese en progressie van hypertensieve hartziekte bij mensen is complex, dus een geschikt diermodel is van cruciaal belang om de onderliggende mechanismen te onderzoeken en nieuwe therapieën te testen die zijn gericht op het verbeteren van de hartstructuur en -functie5. Het model voor abdominale aortaconstricie, dat chronische ha...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk van de auteurs werd ondersteund door een subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2320-B-002-068-MY2), het National Health Research Institute (NHRI-EX104-10418SC) en de Nationale Universiteit van Taiwan (NTU 104R4000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22 G syringe needle                         BD Biosciences             309572
EDTA Blood Collection Tubes   BD Biosciences            REF365974
4-0 silk suture                          Sharpoint™ Products                   DC-2515N
6-0 silk suture                          Sharpoint™ Products                   DC-2150N
Pentobarbital                           Sigma Aldrich                              1507002
Paraformaldehyde                    Sigma Aldrich                             441244
AcetaminophenSigma Aldrich                                     A7085
Picrosirius red solution             Abcam                                        ab150681
Cardiac troponin kit                    Abcam                                       ab200016
ImagequantMolecular Dynamics
Langendorff                             ADInstruments                            ML870B2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
  2. Towbin, J. A. Inherited cardiomyopathies. Circ J. 78, 2347-2356 (2014).
  3. Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
  4. van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
  5. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
  6. Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
  8. Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
  9. Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950(2014).
  10. Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634(2014).
  11. Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80(2015).
  12. Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983(2014).
  13. deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. , e1729(2010).
  14. Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259(2016).
  15. Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
  16. Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545(2016).
  17. Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
  18. Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
  19. Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Abdominale aortaconstrictiehypertensieve hartaandoeningcardiale fibrosehartgewichtratioPicrosirius roodkleuringratmodelchirurgische proceduremyocardiale hypertrofiedrukoverbelasting

Gerelateerde artikelen