Methodenartikel

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

DOI:

10.3791/54819

⸱

14 december 2016

 ,  ,  , 
1Physiology and Experimental Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Clinical Microbiology, Royal College of Surgeons in Ireland, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Pediatrics, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de visualisatie van de ontwikkeling van biofilms na blootstelling aan gastfactoren met behulp van een glijkamermodel. Dit model maakt directe visualisatie van de ontwikkeling van biofilms mogelijk, evenals analyse van biofilmparameters met behulp van computersoftwareprogramma's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilms bestaan ​​uit groepen van bacteriën ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. Zij spelen een belangrijke rol bij industriële vervuiling en in de ontwikkeling en persistentie van vele gezondheid gerelateerde infecties. Een van de meest goed beschreven en bestudeerd biofilms in menselijke ziekte voorkomt bij chronische longinfectie van cystische fibrose. Bij het bestuderen biofilms in het kader van de gastheer, een groot aantal factoren biofilm vorming en ontwikkeling beïnvloeden. Om te bepalen hoe gastheerfactoren biofilm vorming en ontwikkeling kunnen beïnvloeden gebruikten we een statische chambered dekglaasje methode biofilms groeien in aanwezigheid van gastheer afkomstig factoren in de vorm van sputum supernatanten. Bacteriën worden gezaaid in kamers en blootgesteld aan sputum filtraten. Na 48 uur groei worden biofilms gekleurd met een commerciële kit biofilm levensvatbaarheid vóór confocale microscopie en analyse. Volgende beeld acquisitie, kan biofilm eigenschappen worden beoordeeld met behulp van verschillende software platforms.Deze methode stelt ons in staat om de belangrijkste eigenschappen van de biofilm groei te visualiseren in aanwezigheid van verschillende stoffen, waaronder antibiotica.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële biofilms zijn groepen micro-organismen die zijn bevestigd aan elkaar en ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. 1,2 klassiek, zij vertegenwoordigen bacteriën fysiek verbonden aan een abiotische of biotische oppervlak gevormd onder omstandigheden van flow. Biofilms zijn ook aangetoond dat ze groeien in statische toestand (zonder stroom) en distaal van oppervlakken, zoals bij de lucht-water grensvlak thermische zwembaden of pellicles gevormd in reageerbuizen. Deze biofilms zijn lang erkend in de omgeving en die een groot nadeel voor industriële processen zoals deze zich kunnen vormen in water reservoirs of leidingen, waardoor biofouling, corrosie en verstopping. 3,4

Biofilms zijn ook kritisch in de gezondheidszorg, zoals ze zijn getoond worden bij kathetergerelateerde infecties, longinfecties bij cystische fibrose patiënten, alsmede in talrijke andere infecties. 5,6 Een van de kenmerken van biofilm infecties is het degevouwen gevoeligheid van bacteriën tegen antibiotica en verminderde klaring van het aangeboren immuunsysteem. 7-9 De meest bestudeerde, klinisch relevante scenario's van biofilm-gebaseerde infectie optreedt bij patiënten met cystic fibrosis (CF), die chronisch besmet zijn met Pseudomonas aeruginosa biofilms. P. aeruginosa kan bij instelling van chronische infectie die het zeer moeilijk te behandelen een aantal wijzigingen ondergaan. 10,11 Biofilms kunnen differentieel activeren aangeboren immuniteit en rijden ontsteking. 12-14 Al deze infecties leiden tot verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij CF-patiënten, is het cruciaal om factoren die invloed hebben biofilm ontwikkeling in dit verband verstaan.

Een recente studie suggereert dat gastheer-factoren zijn cruciaal bij de vorming van biofilm P. aeruginosa aggregaten. 15 Deze biofilms bijdragen tot verminderde gevoeligheid voor antibiotica en gastheer afweermechanismen. de presentie van gastheer afkomstig factoren, zoals neutrofiel elastase, alsook uitgescheiden producten van micro-organismen in de CF longen, het potentieel sterk moduleren vorming en ontwikkeling biofilm. 16 Daarnaast biofilms interactie met de gastheer voor expressie van een groot cascades en een ontstekingsproces. Terwijl hoge doorvoer werkwijzen, zoals de standaard kristalviolet assay kan enige informatie met betrekking tot de biofilm werkwijze, visualisatie van de biofilm in reactie op deze factoren zorgen voor meer gedetailleerde informatie.

In dit manuscript beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van factoren uit het sputum van patiënten met CF biofilmvorming in vitro bestuderen. Deze methode zorgt voor een snelle visualisatie van biofilms blootgesteld aan sputum met gastheer factoren met behulp van een commercieel biofilm levensvatbaarheid kit. Deze techniek kan worden gebruikt om visueel veranderingen die optreden tijdens biofilmgroei te identificeren in de aanwezigheid van exogenoons producten, en vertegenwoordigt een verbeterde werkwijze voor de veranderingen in biofilm ontwikkeling onder verschillende omstandigheden te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merk op dat Research Ethics Board (REB) moet verzamelen en opslaan sputum monsters uit proefpersonen. Deze studies werden goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Voorbereiding CF sputum

  1. Verzamel sputum monster van patiënten tijdens een routine bezoek aan de cystic fibrosis clinic en blijf op ijs.
  2. Vervoeren sputum monster op het ijs binnen het eerste uur van de collectie, aan het onderzoekslaboratorium, de verwerking te ondergaan.

2. Sputum Processing

  1. Noteer het volume van het sputum monster verkregen. Voeg fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om het volume van het monster (dat wil zeggen, 2 delen PBS, 1 deel van een monster) 2x.
  2. Meng het monster goed met een transfer pipet. Vortex het monster op de hoogste stand gedurende 1 minuut om volledig te mengen.
  3. Aliquot 1 ml van het bovenstaande mengsel in het juiste aantal 1,5 ml microcentrifugebuizen en spin neer bij 5000 xg gedurende20 min bij 4 ° C.
  4. Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet.
  5. Filter steriliseer het supernatant door een 0,22 urn filter en blijft dan op een schone microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Steriliteit filtraat wordt getest door uitplaten op LB agar en enten vloeibare media.
  6. WINKEL sputum supernatant bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
    LET OP: Sputum uit meerdere patiënten kunnen ook worden samengevoegd na filtratie.
  7. Vóór gebruik verdund sputum filtraat 1/10 v / v (100 pl sputum, 900 ul medium) in de gewenste media.
    LET OP: Hier werd standaard lysogenie bouillon (LB) media gebruikt.

3. Chambered dekglaasje Methode voor Biofilm Formation

  1. Grow bacteriële isolaat van belang 's nachts in de gewenste media bij 37 ° C onder schudden (200 rpm).
    Opmerking: Een aantal verschillende bacteriën werden gebruikt, met inbegrip van klinische isolaten Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia en Achromobacter xylosoxidans. Mediakeuze afhankelijk stammen en omstandigheden plaats, echter LB-medium kan worden gebruikt voor initiële experimenten.
  2. Van overnachtcultuur Plaats 40 gl kweek in 4 ml vers medium en kweken gedurende 3-4 uur bij 37 ° C onder schudden (200 rpm) tot een kweek met een optische densiteit bij 600 nm (OD 600) van ongeveer 0,5 -0,6.
  3. Verdun de cultuur van stap 3,2 tot 1/5 in de gewenste media met 10% sputum filtraat of zonder sputum filtraat (als controle). Andere concentratie van sputum filtraat kan worden getest (dat wil zeggen, 50% of 100%).
  4. Gebruik 200 ul van de verdunning tot putjes van dia kamers zaad.
  5. De bacteriën te hechten 4 uur bij 37 ° C zonder schudden.
  6. Na 4 uur, verwijder de media en voorzichtig te wassen de biofilm met 1x verse media. Vervangen door 200 ul vers medium.
    OPMERKING: Om het effect van sputum op de biofilm te bestuderen, de fresh media moeten sputum supernatant bevatten.
  7. Biofilms laten groeien voor de gewenste tijd bij 37 ° C zonder schudden, vervangen media elke 12 uur, zonder te wassen tot de tijd voor microscopie.
    Opmerking: Om het effect van sputum op supernatanten biofilm antibioticagevoeligheid bestuderen antibiotica toegevoegd aan het medium na 24 uur groei van biofilm en worden gehandhaafd in de media tot kleuring en beeldvorming van biofilms.

4. kleuring Biofilms en confocale microscopie

  1. Naar aanleiding van de gewenste groei van de tijd (24-48 uur het beste werkt), verwijder media uit kamer putten en voorzichtig te wassen elke kamer tweemaal met 300 pl steriel PBS.
  2. Bereid kleuring mengsel biofilm door mengen 1 pi van elke kleurstof (verschaft in de kit levensvatbaarheid) per ml oplossing nodig. Maak kleurstof in water of media-oplossing.
    OPMERKING: Water wordt aanbevolen door de fabrikant.
  3. Voeg 200 ul van kleurstofmengsel elk putje van chambered coverglass en incuberen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min.
  4. Verwijderen Kleurend mengsel van kamers en was elk putje met 300 pl steriel PBS. Verwijder PBS en te vervangen door vers water of media.
  5. Ga verder met visualisatie van biofilms via confocale microscopie.

5. Visualiseren Biofilms met confocale microscopie

  1. Lees lood biofilms in raadkamer onmiddellijk na kleuring (binnen 1 uur). Minimaliseren vertraging visualisatie van de objectglaasjes door kleuring 1-2 augustus putjes kamers tegelijk.
  2. Voer beeldvorming met behulp van confocale microscoop met lasers voor excitatie en filter sets voor de overname.
    OPMERKING: Hier, de draaiende schijf confocale systeem spectrale borealis lasers (Groen: 491nm, Red: 561 nm) werd gebruikt voor excitatie. Emissiefilter sets 515/40 en 624/40 werden gebruikt om de vlekken visualiseren van de biofilm levensvatbaarheid kit.
  3. Maak opnamen met behulp van een 25X objectief water op confocale microscoop met camera.
  4. Gebruik Z-Stacks aan de biofilm te modelleren. Neem beelden elke 0,5-1 um vanaf de eerste in-focus vliegtuig naar de laatste in-focus beeld van de biofilm (meestal verspreid over 30-80 urn 48 uur biofilms)
  5. Neem 3-5 beelden van elk putje.
    LET OP: Dus voor een 8 goed chambered dekglaasje, zal 24-40 beelden worden gegenereerd.
  6. Bewaar afbeeldingen voor analyse.
    LET OP: Beelden worden opgeslagen als OME-TIFF-bestanden te analyseren met behulp van COMSTAT 18,19. Instructies voor het biofilm analyse kan worden gevonden op http://www.comstat.dk/. Zodra beelden worden ingevoerd, kunnen parameters zoals gemiddelde dikte, biomassa en oppervlaktebedekking voor elk kanaal (rood en groen) geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het totale ontwerp van het experiment weergegeven in figuur 1. Het gebruik van dit protocol een handige methode om de wijzigingen in biofilms gekweekt voor verschillende tijdsperioden (bijvoorbeeld 24, 48 of 72 uur) zichtbaar. Belangrijker exogene signalen, zoals sputum filtraat kan worden toegevoegd aan de veranderingen in de biofilm ontwikkeling visualiseren. Zoals blijkt uit figuur 2, kan de aanwezigheid van 10% sputum filtraten de architectu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierin beschreven werkwijzen maken voor visualisatie van bacteriële biofilms gekweekt in de aanwezigheid van exogeen producten. Niet verrassend, de productie van de exoproducts van belang bij gebruik van dit type systeem. Bijvoorbeeld, dithiothreitol (DTT), wordt vaak gebruikt op menselijke sputum monsters om vloeibaar monsters. Echter, het effect van DTT alleen biofilm ontwikkeling en levensvatbaarheid verlagen (gegevens niet getoond). Aldus juiste controles voor alle omstandigheden noodzakelijk. Verder is de toevoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TB erkent een research fellowship van Cystic Fibrosis Canada.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-wellThermo Sicher Scientific155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty KitThermo Fisher ScientificL10316
Blood agar platesThermo Fisher ScientificR10215Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTATBeschikbare software onlineCOMSTAT is software om biofilmbeelden te analyseren. Beschikbaar op www.comstat.dk 
Millers LB BrothThermo Fisher Scientific12780-052Standaard media voor overnachtelijke groei/biofilmgroei
Millex-GV Syringe FiltersMilliporeSLGV013SLFiltreren van sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)OxoidBR0014GWassen van biofilmkamers na media verwijdering
Zeiss AxioVert 200MCarl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCDQS Technologies Inc.
Spectral BorealisQs Technologies Inc.
Perkin Elmer VolocityQS Technologies Inc.Instructies voor deze software zijn te vinden op: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  3. Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
  4. Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
  5. Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
  7. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  8. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  9. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  10. Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
  11. Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
  12. Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
  13. Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
  14. LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).
  15. Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
  16. Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
  17. Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
  18. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  19. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
  20. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chambered Coverglass ModelBiofilm DevelopmentSputum EffectsConfocal MicroscopyBiofilm Viability KitAntibiotic EfficacyBacterial SeedingPBS WashingComstat AnalysisBurkholderia Cepacia

Gerelateerde artikelen