High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Summary

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Abstract

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii¹. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

Introduction

Fenotypische karakterisering van systematische mutant collecties van model organismen is een bewezen aanpak voor het ontleden van cellulaire complexiteit. De haploïde ééncellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii heeft een fabriek-achtig gen set, maar het afweken van landplanten voor meerdere genoomduplicaties in het land fabriek lijn ^2. In principe is het ontbreken van gen duplicatie en een voornamelijk haploïde levenscyclus vergemakkelijkt aanzienlijk verlies-van-functie genetische benaderingen. Echter, gerichte verstoring van genen van belang bijna onmogelijk door het gebrek aan efficiënte homologe genomische integratie. Een willekeurige insertie verstoring bibliotheek is in aanbouw, in combinatie met de identificatie van de verstoorde site, tot nu toe waardoor een bekleed set van 1935 in kaart gebracht verstoringen die 1562 genen ^3. Deze benadering (naar verwachting in het algemeen null mutaties) geldt niet essentiële genen. Temperatuur-gevoelige (ts) mutaties kunnen worden recovered in essentiële genen, en recente werkwijzen maken efficiënte identificatie van het gemuteerde gen en de veroorzakende lesie. Fenotypische analyse bij hoge temperatuur verschaft vervolgens direct informatie over de functie van het gemuteerde gen. We verslag uit over de isolatie en karakterisering van ts letale mutaties in ~ 70 essentiële genen in Chlamydomonas, met bijzondere aandacht voor genen betrokken bij celcyclus progressie en controle ^1,4.

Ts dodelijke schermen hebben een steunpilaar van genetische analyse is in microorganismen decennia ^5,6. In principe kan een gewenst kenmerk is "verzadiging", wat betekent dat alle genen kunnen muteren tot letaliteit ts worden geïdentificeerd door ten minste één mutant, waardoor een volledige analyse benaderen. Echter, in de praktijk een aantal factoren beperken de aanpak verzadiging. Eerst, terwijl bijna alle genen worden gemuteerd om verlies van activiteit bij hoge temperatuur, de efficiëntie van terugwinning van dergelijke mutanten varieert over ten minsteeen orde van grootte ^7,8. Daarom begint een willekeurig scherm op te halen terugkerende hits in "frequent flyers", lang voordat de verzadiging is benaderd. Ten tweede, terwijl ts mutaties meestal resulteren in vermindering van de functie, ze niet waar zijn nullen op een restrictieve temperatuur (en omgekeerd, vaak niet volledig functioneel bij een permissieve temperatuur). Dit probleem kan worden aangepakt deels door het vergelijken van meerdere allelen; dat deze allemaal een gemeenschappelijk fenotype delen, dit is waarschijnlijk een gevolg van de eenvoudige inactivering van het gen weerspiegelen. Meerdere allelen zijn ook zeer nuttig zijn voor de definitieve moleculaire identificatie van de veroorzakende letsel ^1. Echter, de "frequent flyer" probleem betekent dat meerdere allelen in zelden getroffen genen die moeilijk te herstellen zijn.

Om deze redenen hebben we de ontwikkeling van een verbeterde pijplijn te isoleren en fenotypisch karakteriseren ts mutanten. We hebben meer dan 3000 ts-mutanten tot nu toe verzameld, including ongeveer 200 nieuwe kandidaat celcyclus mutaties. Moleculaire en fenotypische analyse van deze collectie, die al waarschijnlijk omvat mutaties in de meeste of alle cel-essentiële trajecten moeten nieuwe inzichten en hypotheses in plantaardige celbiologie bieden. Belangrijk, kan deze leiding worden toegepast op elk micro-organisme dat groeit op agar ts mutant collecties efficiënt te construeren.

Een opmerking over uitrusting: twee robots zijn erg belangrijk voor de efficiëntie in deze procedure (een kolonie picker en een combinatie replica Plater / hoogwerker). Plukkers hebben meestal metalen pinnen. Geplukt kolonies worden gehouden in de lucht op deze pinnen voor een bepaalde periode (seconden tot minuten, afhankelijk van het model). Chlamydomonas sterft in ongeveer 20 seconden op een metalen pin in de lucht. Dit beperkt model keuze voor het organisme. Nauwkeurigheid zaken. Onze kolonie picker is redelijk nauwkeurig; echter enigszins gewelddadig haar optreden en heeft enkele mogelijkheid met sprays kruisbesmetting. Het is niet te hooger is dan de 384 dichtheid (4,5 mm midden-hart gemeten); Dit dichtheid, de nauwkeurigheid is volledig acceptabel. De replica plating / cherry picking robot (verschillende uitrusting gebruikt voor deze toepassingen) veel langzamer op plukken, maar is nauwkeurig genoeg voor de 1536 densiteit (6144 is een uitdaging, zelfs voor deze zeer nauwkeurige robot, we deze dichtheid geëvalueerd maar niet gekozen te gebruiken vanwege de verschillende moeilijkheden). De robot zal niet goed werken als platen ongelijk worden geladen, enz. Het is belangrijk om ter plaatse te controleren om zeker te zijn van de juiste dingen gebeuren; Uiteraard zal de robot zonder toezicht en in het algemeen alle gaat veel als de eerste paar platen correct waren.

Protocol

1. UV Mutagenese

1. Bereid een partij van 100-200 rechthoekige agarplaten met Tris-acetaat-fosfaat (TAP) gemiddeld ^9,10. Bereid deze platen enkele dagen vóór en bewaar ze op de bank te drogen om snelle opname van de gesuspendeerde cellen te waarborgen in de volgende stappen.
2. Cultuur Chlamydomonas cellen tot 0,2-0,5 optische dichtheid (OD _750; ~ 2 dagen) in 100 ml vloeibaar TAP onder licht bij 25 ° C en schudden bij 100 rpm.
   LET OP: UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden: Mat- Hygro ^r (resistentie tegen hygromycine B) en Mat + Paro ^r (resistentie tegen Paromomycin). Antibioticum keuze arbitrair, mits de twee parende typen complementaire Geneesmiddel resistentie.
3. Bekijk een monster van elk van de kweken onder de microscoop dat de cellen levensvatbaar en gezond (zwemmen en intact) en zonder vervuiling.
   LET OP: Overgrown culturen "crash" enverliest levensvatbaarheid, verschijnen als "geesten" in fase contrast microscopie. Bewaar geen shaker culturen gaan zodra ze verzadiging te bereiken. De "geest" fenomeen is gemakkelijk te detecteren in stap 1.3.
4. Verdun de cultuur tot 0,003 OD _750. Wikkel de fles met aluminiumfolie homogene dichtheid te verzekeren, omdat de stam beweeglijke en zwemt directioneel in reactie op licht.
   1. Pas de dichtheid van de suspensie op basis van de geplande dosis UV, zodat goed voor celdoding, 200 - 600 zullen overlevende kolonies vormen op de platen (figuur 1). Zie tabel 1 voor informatie over UV-blootstelling tijden.
5. Bevestig een kleine buis cassette die een vloeistof afgeefinrichting past en voeren een reeks wassingen voor sterilisatie volgens de instructies van de fabrikant, om verontreiniging te voorkomen.
6. Met een doseerpomp 8 x 12, afzien 4 x 96 druppels 2 pi elk op rechthoekige platen (figuur 1 ). Tik lichtjes aan de rand van de plaat de samenvoeging van druppels te verzekeren in een dunne laag vloeistof en meteen daarna de platen om de blootstelling aan licht.
   1. Zeer zelfs enkele cel verspreiding waarborgen, gebruik droge platen, zoals hierboven vermeld, en snel de plaques bedekken om te voorkomen dat de cellen van het zwemmen in reactie op licht. Houd het rekenbordjes niveau en in het donker totdat alle vocht is opgenomen.
7. Plaats de platen onder een kiemdodende UV-lamp (30 watt kiemdodend UV buis) gedurende tijdsperioden empirisch bepaald om een ​​optimale opbrengst aan TS- mutanten tussen de overlevenden geven. Hier gebruiken tijden van 0,5-1,5 min bij een afstand van 40 - 50 cm leiden tot 90-99,9% doding. Overlevenden bevatten 100 - 1000 UV-geïnduceerde puntmutaties, waarvan ~ 10% mutatie coderende sequenties.
   1. Met het oog op maximale kracht van UV-bestraling geen terugkeer te verzekeren als gevolg van licht-afhankelijke DNA-reparatie ^11,12, werken in het donker bij deze stap en meteen inpakkenplaten in een donkere doos na bestraling.
8. Houd de platen in het donker gedurende 8-24 uur bij kamertemperatuur.
9. Plaats de platen in een 21 ° C incubator met verlichting kolonies vormen. Kolonie formatie duurt ~ 10 dagen. Zorg ervoor dat de platen wrap met plastic zakken en voeg absorberend papier binnen te wissen vloeibaar condensatie. Verdamping en condensatie cycli anders vloeistoffilm routes voor verontreinigingen aan de platen voeren.
10. Laad de platen in de desbetreffende stapels als bronnen voor robot kolonie picking (figuur 2). Pick kolonies 384-arrays op rechthoekige platen, en ze groeien bij 21 ° C met verlichting (~ 1 week).
11. Condenseren 384-arrays in een 1536-arrays (4: 1) met een replica-plating robot (figuur 3), en laat de platen groeien ~ 3 dagen in de 21 ° C incubator.
12. Een kopie van de 1536-arrays om twee platen elkaar en plaats een in de 21 ° C incubator (permissievetemperatuur) en de ander in een 33 ° C incubator (restrictieve temperatuur). Na 24 uur, een kopie van de platen in 33 ° C om een ​​nieuwe reeks van voorverwarmde borden en leg ze in de 33 ° C incubator.
    OPMERKING: De reden hiervoor is dat secundaire plating ts letale mutanten kan in sommige gevallen accumuleren aanzienlijke biomassa, zelfs wanneer de cellen worden aangehouden in de eerste celcyclus na uitplaten. De secundaire replica elimineert dit signaal en verhoogt de gevoeligheid.
13. Fotograferen van de platen met een digitale camera na 3 dagen groei bij 33 ° C en 5 dagen kweek bij 21 ° C. Houd de platen in een vast frame. Gebruik een "raster-plate" gemerkt met negen alignment indicatoren die samen wordt gefotografeerd met de kweekplaten (figuur 4). Foto kweekplaten als afwisselende gepaarde 21 ° C en 33 ° C (21/33) beelden.
    OPMERKING: verschillende incubatietijden worden gebruikt om groei gelijk omdat de wildtype aanzienlijk groeitsneller bij 33 ° C dan bij 21 ° C.

2. Identificatie van de ts Mutant Kandidaten: eerste scherm

1. Verwerk de gepaarde 21/33 plaat beelden met een aangepaste Matlab beeldanalyse software om de achtergrond en het segment van de afbeeldingen in een 1536-serie te elimineren. Het programma zal de gedetecteerde biomassa (totaal pixel intensiteit) in elke positie (figuur 5) te bepalen.
   LET OP: De software (meegeleverd in de SI samen met instructies) zal het de grid-plaat gebruiken om de locaties van cellen (individuele inzendingen) in een 1536-serie op de vergroting en de plaat alignment gebruikt te bepalen en te berekenen totale pixel intensiteit in elke cel . Deze waarden voor elke mutant worden vervolgens vergeleken met instelbare parameters om gewenste groei bepalen bij 21 ° C ten opzichte van een ts + standaard en de mate van temperatuur-gevoeligheid, gedefinieerd als: S (Mut ₃₃₎ / S (WT ₃₃₎ / S (Mut ₂₁₎ / S (WT _21), waarbij S signaal (pixelintensiteit na achtergrond aftrek), Mut een individuele mutant en "WT" is een willekeurig gekozen niet-temperatuurgevoelige kolonie (gemutageniseerde stam die ts + fenotype hadden). Groei bij 21 ° C wordt gedefinieerd als S (Mut ₂₁₎ / S (WT _21). In dit eerste scherm, gelden relaxed selectiecriteria (waardoor een relatief lage groei bij 21 ° C en een relatief lage mate van temperatuurgevoeligheid) om de valse negatieve rente laag te houden.
2. Laad de lijst van geselecteerde kolonies die door de software een instructie bestand voor de enkelvoudige kolonie picking robots (meestal in een 384-array). Bereid de bron en doel platen volgens de instructies robotica en kies kolonies array (figuur 6).
   LET OP: Conventionele plukkers vereisen een instructie-bestand in sommige formaat, zoals .csv, .txt of .xls. Alle plukkers zal de capaciteit hebben om bestand te zijn gedreven te hebben; verschillende formaten zullen kleine bewerking van de MATLAB-code (broncode) vereisen.
3. Leg het doel platen in de 21 ° C incubator voor ~ 5 dagen te groeien van een voorraad plaat.

3. Het identificeren van ts Mutants: Second Screen

1. Herhaal stap 2.1 tot geplukt kolonies opnieuw te testen. Gewoonlijk 30 - 50% van de kolonies test opnieuw zo duidelijk ts letale mutaties, voor een opbrengst van 2% - 5% ts letale opzichte van aanvankelijke kolonies overleven UV mutagenese.
2. Herhaal stap 2.2 voor het plukken van twee gescreende ts letale mutaties, maar met een gewijzigde instructiebestand ontworpen array kolonies in blokken van 100 kolonies op rechthoekige platen bij een 384-dichtheid. Dit is handig voor microscopisch onderzoek in de volgende stap. De instructie bestandsindeling wordt opgegeven tijdens runtime door de MATLAB-code.
3. Zorg ervoor dat meerdere WT kolonies als controle omvatten en plaats de platen bij 21 ° C gedurende ~ 5 dagen.

4. Eerste Fenotype Bepaling

1. Een kopie van de 100-blok platen bekleed met stap 3.2 en plaats ze in de 21 ° C Incubator voor ~ 2 dagen vers groeiende kolonies te verkrijgen.
2. Een kopie van de nieuwe kopie van de 100-blok platen (4.1) tot drie exemplaren. Plaats een exemplaar in de 21 ° C incubator en een in de 33 ° C incubator als controle.
3. Plaats de derde exemplaar ( "screening platen") in een robot setup, en ter plaatse de kolonies met lange pinnen aangeraakt met gesteriliseerd water.
   LET OP: Chlamydomonas cellen vastgemaakt aan agar robot hebben de neiging om in eerste instantie het land als een vrij dichte plek van cellen, met weinig enkele cellen beschikbaar voor microscopische inspectie. Voor het optimaliseren van de kolonies van de microscoop, spot het aanvankelijk overgedragen cellen met een druppel water (de hoeveelheid water overgebracht door de robot lange pennen ~ 100 nl). Dit leidt tot dispersie van de cellen in een kleine straal (~ 1 mm) over de eerste pinning centrum met veel geïsoleerde enkelvoudige cellen.
4. Neem microfoto van een gebied van elke plek van de screening platen op tijdstip 0 (terwijl nog steeds single, onverdeelde cellen) (Figuur 7) en plaats de platen bij 33 ° C incuberen. Bepaal image locatie aan de handmatige fase controle van een gemodificeerde viertal dissectie microscoop ingesteld stopt bij de 4,5-mm hart op hart afstand van een 384-density matrix geven.
5. Verwijder de screening platen uit de 33 ° C incubator en neem microfiches, zoals in stap 4.4, op verschillende tijdstippen (10 uur, 20 uur, 48 uur). Zorg ervoor dat het podium, de plaat houder, en het podium controller zijn nauwkeurig gekalibreerd om beelden van dezelfde cellen te krijgen in elk tijdstip. Voer snel photomicrograph acquisitie (~ 10 min).
6. Gebruik het tweede exemplaar in de 33 ° C incubator naar de ts fenotype te verifiëren en om ervoor te zorgen dat de temperatuurschommelingen tijdens beeldacquisitie hebben geen grote invloed op ts fenotype.
   1. Analyseren microscopische afbeeldingen en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria (Figuur 8). Spot de laatste geselecteerde set in een 96-array agar plaat. Zorg ervoor dat elkeplaat bevat mutanten van hetzelfde type paring en resistentie tegen geneesmiddelen.
   2. Voor elke plaat, voorzien van de laatste twee kolommen een positieve (vraag mutatie) en een negatieve (WT) controle voor de complementatie assay.

5. Complementatie en scharniermechanisme Testen van New Mutants aan "Frequent Flyer"

1. Transfer grote hoeveelheden van de array kolonies stikstofvrije gameet-inductiemedium ¹⁰ in 96 putjes microplaten (dichtheid van elke kolonie duurt ongeveer 0,2 OD). Incubeer de platen onder licht (13-20 W kwik lampen) voor ~ 5 uur tot gametogenese mogelijk te maken.
   LET OP: Deze stap kan worden uitgevoerd ofwel met een repliceren robot setup of handmatig met een eenvoudige plating apparaat.
2. Opschorten queries met de andere voortplantingstypes het herbergen van de alternatieve weerstand cassettes in buizen met stikstof-vrije gameet-inductie medium ¹⁰ voor gametogenese.
3. Meng de monsters in een doel plaat in een paring mixture volume van 20 pl (figuur 9). Na ~ 10 min onder het licht, spot 5 ul van elk putje twee keer: een keer op een TAP plaat voor koppeling testen en eenmaal op TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro voor complementatie testen.
4. Incubeer de koppeling platen in de 21 ° C incubator 's nachts, en vervolgens wikkel ze in folie. Houd ze in het donker gedurende 5 dagen om zygospore vorming mogelijk te maken.
5. Incubeer complementatie-testplaten voor ~ 10 dagen in het donker staan ​​bij 21 ° C.
   OPMERKING: De drug bedragen zijn afgestemd op overleving dubbel heterozygote diploïde mogelijk, maar nog voldoende om de dekking haploïden elimineren. Deze bedragen werden gekalibreerd voor standaard weerstand cassette integraties die in dit specifieke project; met nieuwe integraties, moet de dosis opnieuw worden gekalibreerd. De meeste biomassa wordt geverifieerd diploïde met flowcytometrie (Figuur 9), hoewel voor variërende haploïden (waarschijnlijk van meiose en groei dubbel resistentesegreganten) wordt meestal waargenomen ook.
6. Repliceren de-complementering testen platen in twee exemplaren voor de TS-fenotype identificatie. Plaats een kopie bij 21 ° C en een kopie bij 33 ° C gedurende ~ 5 dagen.
7. Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals beschreven in paragraaf 2.1 (Figuur 5). Kolonies die geen aanvulling met de vraag vertegenwoordigen waarschijnlijk allelen van hetzelfde gen als de query (diploïden hetero-allelische mutaties in hetzelfde gen).
8. Voor koppeling testen, volgende stap 5.4, verschuiven de borden terug aan het licht meiose en uitgroei van haploid segreganten voor ~ 7 dagen mogelijk te maken.
9. Repliceren koppeling testplaten TAP + 10 pM en 10 pM Paro Hygro selecteren voor dubbele resistente nakomelingen (voorspelde 25% van de haploïde nageslacht, aangezien de cassettes gekoppelde) en incubeer bij 21 ° C gedurende een week.
   OPMERKING: Verhoging van de drug dosering voor dubbel resistente haploïden.
10. Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals ikn stap 2.1.
    LET OP: Een TS-fenotype wordt verwacht (en waargenomen) voor mutanten in dezelfde complementatie groep als de query. Daarnaast is een TS-fenotype in de binding assay, een mutant die de query aanvult, kan vast verband tussen de query en de nieuwe mutatie weerspiegelen. Mutanten die de geteste query aanvulling waarschijnlijk nieuwe genen die de pijpleiding bioinformatic identificatie van de veroorzakende laesie voor verdere fenotypische analyse voeren en uiteindelijk.

Results

We tonen een versnelde pijpleiding voor het isoleren van ts-mutanten in Chlamydomonas. Cellen worden afgegeven op agarplaten, en kort daarna snel validering onder de microscoop voor eenmalig celdichtheid, platen UV bestraald (figuur 1). Typische bestraalde kolonies worden geïdentificeerd en opgepikt in een array format na 10 dagen kweek bij een permissieve temperatuur (figuur 2). De resulterende platen in de vorm 384 worden gecombineerd in een 1536-array (figuur 3). Uit deze eerste stappen van het verzamelen van bestraalde kolonies, hebben we gekleed ~ 200.000 kolonies tot nu toe. De dichtheid van de suspensie wordt aangepast op basis van de geplande dosis UV zodat goed voor dood, 200-600 overlevende kolonies op de platen vormen. Drie UV belichtingstijden (1,5 min, 1 min en 0,5 min) en drie dichtheden dienovereenkomstig getest (Tabel 1). Empirisch de 1,5 min belichtingstijd leverde meeste ts- Mutanten (~ 50%); Verreweg, 1 min leverde meeste celcyclus kandidaten. Daarom werden geen UV mutagenese ronden gedaan met slechts 1 min. Een belangrijk aandachtspunt is het spetteren tijdens de eerste plukken en de kruisbesmetting (vooral in de high-density formats). Dit kan leiden tot duplicatie en verdere fenotypering van dezelfde mutant tweemaal. Om de kans op een dergelijk scenario te minimaliseren, zorg om kolonies te halen bij de optimale grootte, en zorg ervoor dat aangrenzende kolonies niet in de eerste test worden geplukt.

Vervolgens twee opeenvolgende TS-fenotype assays (figuur 5) uitgevoerd, en ongeveer 3000 TS-mutanten werden geïsoleerd en fenotypisch gekarakteriseerd door time-lapse microscopie (Figuur 8). Als gevolg van de biologische focus op het bestuderen van de celcyclus van interesse in fenotypes die aan bepaalde criteria voldoen, we zijn niet geïnteresseerd in het verzamelen van meer dan twee allelen in elke doelgroep gene. Daarom voerden we complementatie en koppeling immuniteitsonderzoek met reeds kenmerk genen met meer dan twee allelen (Query) tegen nieuw verzamelde kandidaten sterk terugkerende genen van de stroomafwaartse leiding (Figuur 9) te verwijderen.

Figuur 1: Uniform Verspreiding van gemutageniseerde cellen en UV-mutagenese. (a) 384 x 2 pl druppels worden afgegeven op een agarplaat zonder reagens dispenser. (b) Willekeurig platen onderzocht onder de microscoop eencellige density verifiëren en UV bestraald met een 1-min blootstelling. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. UV-gemutageniseerde Kolonies pakte voor de 384-arrays. (a) één UV-bestraalde cellen worden gekweekt ~ 10 dagen van zichtbare kolonies. Schaal bar = 2 cm. (b) Beeldanalyse programma herkent scheiden kolonies op basis van bepaalde parameters en robot arrays ze in 384 platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. samenvoegen tot de 1536-serie. Vier 384-formaat platen worden samengevoegd tot een 1536-plaat; eenmaal plaatsvinden, worden ze weer herhaald om te testen op de TS-fenotype. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Imaging voor kwantificering. (a) De platen worden vastgehouden in een frame onder een document photography stand zodat alle platen in een reeks zijn gefotografeerd bij dezelfde vergroting en positionering. (b) Het eerste beeld is van een 1536-well microtiterplaat met rode stippen geplaatst op de hoeken en middelpunten. Dit "net-plate" beeld bepaalt de positie van de array. (c) Voorbeeld van een 1536-serie na incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Identificatie van de TS-fenotype Semi-automated Image Analysis. Plate beelden worden geanalyseerd door aangepaste MATLAB software (meegeleverd in het SI). Het beeld wordt automatisch gesegmenteerd in cel arrays (96, 384 of 1536), en het signaal in elke cel wordt gekwantificeerd. Groei bij 21 ° C wordt aangegeven in blauw, en groei bij 33 ° C wordt geel gemarkeerd. Kolonies vertoont significant hogere groei bij 21 ° C vergeleken met 33 ° C (gestandaardiseerd ts +) gekozen en gemerkt zwarte vierkanten met een groene stip. Deze keuzes kunnen handmatig worden bewerkt. Definitieve selecties worden overgebracht naar een bestand dat wordt gebruikt door de kolonie-picking robot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Robotic Plukken van de eerste ronde ts Lethal Kandidaten. De cherry-picking robot volgt instructies van een bestand gegenereerd zoals beschreven in stap 2.1 kandidaten kies een nieuwe array. Het bovenste paneel toont het laden van een gesteriliseerde pin. Het onderste paneel toont de precieze plukken van een bepaalde kolonie in de bron plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Time-lapse Screening voor Initial sorteren van ts Lethal Phenotypes. Klonen die de twee rondes van screening protocol in figuur 5 doorgegeven worden gerepliceerd naar platen bij een celdichtheid zodat individuele cellen microscopisch worden opgelost. Een gewijzigde tetrad dissectie microscoop wordt gebruikt om posities waarop microfoto's worden genomen na 0 uur, 10 uur en 20 uur incubaties een identificeren t 33 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: De Chlamydomonas celcyclus mutanten geïdentificeerd door Time-Lapse Microscopie. (a) Illustratie van de Chlamydomonas unieke celcyclus beschrijft de lange G1 fase gekenmerkt door cellulaire groei, gevolgd door splitsing SM cycli, die eindigen met het uitkomen van de pasgeboren dochter cellen. (b) Microscopische beelden tonen WT cellen tijdens de celcyclus en de identificatie van typische celcyclus mutanten die niet aan mitose voltooien. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 9: Complementatie en scharniermechanisme Test. (a) Een antibioticum resistent (bijv Hygro) vraag met een regelmatig herhalend gemuteerd gen stak in een 96-wells plaat met een aantal mutanten van de tegengestelde mating dat een tweede antibioticum resistentie cassette (bijvoorbeeld Paro) haven. Complementatie platen op grote fractie diploïde zaden zoals blijkt uit het nucleïnezuur kleuring en analyse flowcytometrie (linksonder in a). (b) De paring mengsel wordt getest zowel complementering in diploïde en koppeling in dubbel-resistente meiotische nageslacht. De positieve controle is de query zelf in tegengestelde mating type, en, zoals verwacht, geeft de TS-fenotype bij 33 ° C, terwijl de negatieve controle en toont de WT + ts fenotype. De omcirkelde koloniën tonen geen complementering met de vraag en zijn daarom new TS-allelen voor de query-gen. Deze zijn over het algemeen uitgesloten van verdere karakterisering, omdat alleen 'frequent flyers' zijn in de complementatie test set. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tijd	OD	Kolonies opgepikt (#)	TS-fenotype	Celcyclus kandidaten
1.5 '	0,012	6000 (Gem = ~ 200)	200 (3,3%)	7 (3,5%)
1 '	0,003	11.000	131 (1,19%)	15 (11,4%)
		(Gem = ~ 360)
0,5 '	6E-04	9000	40 (0,45%)	1 (2,5%)
		(Gem = ~ 300)

Tabel 1: De kalibratie van Bestraling Times om de opbrengst van de celcyclus Mutant Kandidaten maximaliseren. Drie bestraling tijden werden getest (30 platen elk) met bijbehorende ODS te overleven kolonie nummers (200-600) te waarborgen.

Discussion

De hier beschreven high yield isolatie van ts letale mutanten pijpleiding zodat vermoedelijk alle cellulaire essentiële routes van de Chlamydomonas genoom zijn weergegeven. De twee meest kritische stappen voor een efficiënte inzameling van potentiële celcyclus genen en voor de eliminatie van repetitieve "frequent flyer" allelen zijn: 1) de coherente definitie van de arrestatie fenotype kenmerken voor onvolledige cel cycli en 2) de parallelle complementatie test tegen al-geïdentificeerde opvragen genen aan de collectie met nieuw geïsoleerde degenen vergroten.

Wanneer gesynchroniseerd door licht-donker cyclus, Chlamydomonas groeit fotosynthetisch overdag en een toename van celgrootte> 10x zonder DNA-replicatie of celdeling ^13. Ongeveer samenvalt met het begin van de nacht, cellen vervolgens aan meerdere cycli van afwisselend DNA-replicatie, mitose en celdeling (Figuur 8). Deze regelgeving scheme een natuurlijke onderscheid tussen genen primair vereist voor groei en celintegriteit en genen specifieke vereisten van de celdelingscyclus. We vonden dat de 10-uur en 20-uur tijdstippen zeer informatief voor een eerste ruwe fenotypische gesneden ^1. De brede klassen van ts dodelijke mutanten die we op dit moment te herkennen, op basis van deze beelden (zie SI in Tulin en Cross, 2014) ^1, zijn: Notch, Popcorn, Ronde, Small, Medium, vroeg lysis en multiple-cyclus (figuur 8 ).

De drie meest relevante categorieën richten we ons op zijn Notch, Popcorn, en Round. De "Notch" en "popcorn" fenotypen werden eerder aangetoond kenmerk van de meeste celcyclus-specifiek laesies (bijvoorbeeld, mitotische cycline-afhankelijke kinase, DNA replicatie machines en topoisomerase II) ^1. De verschijning van een (Notch) of meervoudige (Popcorn) schijnbare vlakken van beginnende, maar mislukte celdeling is een handige Morphological indicator van de celcyclus initiatie. Deze mutanten vertonen in het algemeen weinig of geen groei afwijkingen, met stijgingen in celvolume Soortgelijke WT op de 10-uur mark. De Notch en Popcorn fenotypes zijn evident om 10 uur en worden volledig ontwikkeld (vaak geassocieerd met cellysis) met 20 uur. "Round" cellen groeien vergelijkbaar met WT, maar met een veel-verminderde productie van schijnbare beginnende divisie vliegtuigen, hetgeen aldus grote, ronde gearresteerd cellen. Vorige mutanten in deze categorie zijn gevallen in componenten van het anafase bevorderen complex ¹⁴ of genen die nodig zijn voor microtubule functie (-tubuline vouwen cofactoren, gamma-tubuline ring complex) ^1. Op latere tijdstippen, deze cellen vertonen vaak uitgesproken cellysis.

"Small" en "Medium" cellen groeien ofwel verwaarloosbaar (Small) of aanzienlijk minder dan WT (Medium). Veel van deze mutanten die tot nu toe hebben laesies in genen waarvan de annotaties suggereren rollen in basic cellular groeiprocessen (vertaling of membraan biogenese). De belangrijkste microscopische discriminatie tussen Medium and Round rust op het bedrag van de groei bij 10 uur (Round: zoals WT; Medium: gereduceerd). Omdat de kleine en middelgrote categorieën zijn vrij groot en waarschijnlijk weerspiegelen laesies in een groot scala van cellulaire routes, zijn we niet proberen om deze categorieën te verzadigen; Maar willen we moleculair identificeren vertegenwoordigers van de klasse tot fenotypes van het verlies te begrijpen in diverse trajecten. Twee unstudied categorieën: 1) Begin-lyserende mutanten die integriteit verliezen (verlies van groene kleur verloren refractility) Door de 10-uur merk, weinig aanwijzingen dat ook de voorafgaande cel en 2) de meerdere cycli. Prolifereren vergelijkbaar met WT bij 10 en 20 uur, hoewel zij volledig onvermogen proliferatie langere termijn uit te voeren vertonen.

We zijn vooral karakteriseren "notch", "popcorn" en "round" en sluiten van kleine en middelgrote round cellen, evenalszo lek mutanten die volledige aantal celdelingen. Dit is hoofdzakelijk te zorgen dat de fundamentele cellulaire functies, zoals groei en membraanintegriteit, functioneel en verrijken de kans op dienstbelang genen. Deze benadering blijkt empirisch efficiënt; echter kan het zijn dat een celcyclus gen pleiotrope en heeft extra rollen eerder G1, voordat de werkelijke deling. Dergelijke gevallen, waarvan wij verwachten zeldzaam te zijn, worden gemist. Meer in het algemeen, streven we naar homogene arrestatie, die in hoge mate van waarschijnlijkheid is te wijten aan een oorzakelijke mutatie die is een volledig disfunctioneel eiwit. Echter, om dezelfde reden als hierboven beschreven, kunnen er meerdere arrestatie punten en dus enige flexibiliteit is wenselijk bij het kiezen kandidaten.

Om de collectie met nieuw geïdentificeerde genen verrijken, worden de geselecteerde gegadigden getest op complementatie. Wij eisen TS-in de positieve controle (query vraag mutatie) en ts + in de negatieve controle (query tegen WT). Nieuwe mutanten in dezelfde complementatie groep als de TS-query. Het lidmaatschap in dezelfde complementatie groep weerspiegelt bijna altijd een moleculaire laesie in hetzelfde gen (dit is het geval voor elk van die genen die we hebben getest geweest). Daarom is voor 'frequent flyers,' dit criterium is uitsluiting voor verdere karakterisering. Mutanten die niet dezelfde complementatie groepen als de geteste query waren zijn kandidaten voor nieuwe genen en worden verder gekenmerkt door bioinformatica en experimentele gereedschappen. Zeer variabel herstel van TS-allelen in verschillende complementatie groepen is een bekend verschijnsel, dat wil zeggen variabiliteit is aanmerkelijk groter dan Poisson ruis als gevolg van de grote intrinsieke variabiliteit van veranderlijkheid te TS- tussen verschillende genen. Oorzaken intrinsieke thermolabiliteit verschillen kunnen onder meer; ander eiwit maten; de aanwezigheid van een eiwit als monomeer versus een groot, stabiel complex; en mutagene hot spots. Dit is bijna zuivere nuisaNVU. Echter, een resulterende gunstige resultaat is dat de "frequent flyer" lijst is niet lang (met slechts een paar doelen bezetten het grootste deel van de lijst), zodat de arbeidsintensieve complementatie testen is niet een enorme onderneming, totdat de latere fasen van het project.

Als een complementaire aanpak, hebben we een koppeling assay. In deze assay worden dubbel-resistente nakomelingen geselecteerd en getest op de TS-fenotype. Een TS-fenotype wordt verwacht (en waargenomen) mutanten in dezelfde complementatie groep als de vraag of nauw verbonden mutaties. Voor elk van de geteste genen, is een WT nageslacht verwacht (ts + fenotype) te verschijnen in een zekere waarschijnlijkheid afhankelijk van de genetische afstand. We schatten dat er ongeveer 100 zygospore voor elke paring in deze plaatsen. Uitgaande van 100% meiotische efficiency, resulteert dit in ongeveer 100 dubbel-resistente nageslacht uit de gekoppelde geneesmiddelresistentie cassettes (25% van de meiotische nakomelingen per vier meiose door Mendelian overerving). Dit zou ook voor TS-mutaties, waarbij 25% van de nakomelingen dubbele mutant zal zijn, en 25% zal WT als de query en test mutaties losgekoppeld. Daarom is uit de double-resistente nageslacht, zal 25% bedragen WT (ongeveer 25 cellen). Dit is het geval voor het volledig gekoppelde mutaties; echter matig koppeling (binnen ~ 20 cM, ongeveer 2 Mb of 2% van het genoom ¹¹⁵⁾ sterk zal verminderen of elimineren ts + signaal. Bij koppeling van de geteste mutatie het antibioticum cassette, ts + haploïden die dubbel resistente aanwezig in zeer kleine hoeveelheden. Dit manifesteert zich als duidelijk niet recombineren met alle geteste mutanten, ondanks aanvulling alle geteste mutanten een afwijkende zodat gemakkelijk vastgesteld; in dat geval wordt terugkruisen het probleem oplossen.

Zowel voorkennis en van sequentieanalyse, verwachten we celcyclus genen in de Chlamydomonas tot ongeveer 500 genen ^2, hoewel most, maar waarschijnlijk niet alle, zijn van essentieel belang. We zullen de noodzaak van bijkomende mutagenese rondes als meer mutanten worden verzameld en het verzadigingsniveau stijgt evalueren.

Deze procedure is speciaal ontworpen voor het bestuderen van essentiële biologische processen en de genen en eiwitten die ze uitvoeren. Andere methoden voor het genereren van verstoringen in essentiële genen bestaan (bijvoorbeeld omzetting van willekeurig gemutageniseerde allelen ^16, conditioneel getranscribeerd allelen ¹⁷ of hypomorfe allelen ^18). Echter, ze vereisen allemaal homologe recombinatie, die sterk wordt onderdrukt tijdens vegetatieve Chlamydomonas. De geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is opgericht als een krachtig hulpmiddel voor genetische modificatie ^19; Het is echter nog niet efficiënt in Chlamydomonas ²⁰ werken. Kritisch, al deze werkwijzen voorkennis van het doel nodig. Dit is een ernstige beperkingals men wil de mogelijkheid om iets nieuws te leren! Onze aanpak zal mutaties identificeren van essentiële genen, onafhankelijk van enige voorkennis op. Daarom is op het huidige niveau van de technologie, isolatie van willekeurige ts mutaties gevolgd door gen-identificatie door diepe sequencing kan de meest efficiënte methode van het verkrijgen van snelle inwerkingtreding microbiële celbiologie in de plant superkingdom zijn.

Identificatie van causale mutaties (uit ~ 100-coderende-sequentie veranderen mutaties in elke kloon) valt buiten het bestek van dit artikel. Deep sequencing van tankmelk segregant zwembaden ¹ is effectief, maar arbeidsintensief. Een combinatorische zwembad strategie voor de bepaling van mutaties in een groot aantal stammen, na sequentiëren een klein aantal pools, is zeer arbeidsintensief en kosten- effectief. Een nieuwe strategie voor combinatorische tankmelk segregant sequencing is in ontwikkeling, dat de identificatie van de oorzakelijke mutaties in tientallen mutanten sim zal toestaanultaneously in één sequencing run (in voorbereiding). De rendementen zijn bijzonder belangrijk dat de kritische gen identificatiestap gelijke tred houden met de snelle accumulatie van mutanten die mogelijk wordt gemaakt door de hier beschreven procedures.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
Hudson RapidPick colony picker	Hudson Robotics
MultiDrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small tube metal tip cassette	Thermo Scientific	24073295
Singer RotoR replica-plating robot	Singer Instruments		Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’)	Singer Instruments		Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020