De dood van eilandje-β-cellen gaat vooraf aan de ontwikkeling van type 1 diabetes, en het detecteren van dit proces kan vroege therapeutische interventie mogelijk maken. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van hoe je differentieel gemethyleerde INS DNA-soorten in menselijk serum kunt meten als een biomarker van β-celdood.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van differentieel gemethyleerde
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De dood van eiland-α-cellen wordt geacht ten grondslag te liggen aan de pathogenese van vrijwel alle vormen van diabetes en gaat vooraf aan de ontwikkeling van openbare hyperglykemie, vooral bij type 1 diabetes. De ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare biomarkers van α-celdood kan vroege therapeutische interventie mogelijk maken om de ontwikkeling van diabetes te voorkomen of uit te stellen. Onlangs hebben verschillende groepen, waaronder de onze, gemeld dat celvrij, differentieel gemethyleerd DNA dat preproinsuline codeert (INS) in de circulatie gecorreleerd is met α-celdood bij pre-type 1 diabetes en nieuw-onset type 1 diabetes. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol dat digitale PCR gebruikt voor het meten van celvrij INS DNA dat differentieel gemethyleerd is op cytosine op positie -69 bp (relatief ten opzichte van de transcriptionele startplaats). We tonen aan dat de assay kan onderscheiden tussen gemethyleerd en ongemethyleerd cytosine op positie -69 bp, lineair is over verschillende ordes van grootte, absolute kwantificering van DNA-kopienummers biedt en kan worden toegepast op monsters van menselijk serum van individuen met nieuw-onset type 1 diabetes en ziektevrije controles. Het hier beschreven protocol kan worden aangepast aan elke DNA-soort waarvoor detectie van differentieel gemethyleerde cytosines gewenst is, of dit nu uit de circulatie of uit geïsoleerde cellen en weefsels is, en kan absolute kwantificering van DNA-fragmenten bieden.
Inleiding
Type 1 diabetes (T1D) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de vernietiging van insuline producerende eilandjes β cellen door autoreactieve T-cellen 1. De diagnose van type 1 wordt gewoonlijk plaats na meting van hyperglycemie (bloedglucose> 200 mg / dl) in een slanke jonge individu, dat met ketoacidose zou voorstellen als bewijs van insulinedeficiëntie. Ten tijde van de diagnose van type 1, blijken er aanzienlijk verlies van β celfunctie en massa (50-90%) 2. In klinische studies, verschillende immuun modulerende geneesmiddelen die op het ogenblik van de diagnose werd ingesteld resulteerde in de stabilisatie van β celfunctie (en vermoedelijk massa), maar niets hebben geleid tot klinische remissie van de ziekte, een bevinding dat de oproep voor de ontwikkeling heeft verhoogd van biomerkers voor vroege detectie van de ziekte en de lengterichting volgen van de effectiviteit van combinatietherapieën 3,4. Inspanningen van internationale consortia, zoals eenis de Human Islet Research Network Consortium bij de National Institutes of Heath 5, hebben benadrukt de noodzaak om biomarkers die zich richten op β cel stress en dood in T1D ontwikkelen.
9 - In lijn met deze inspanningen, hebben onze groep en anderen onlangs biomarkeranalyses Deze maatregel circuleren, epigenetisch gemodificeerd DNA fragmenten die in de eerste plaats het gevolg zijn van stervende cellen β 6 ontwikkeld. In alle gepubliceerde onderzoeken tot nu toe heeft de nadruk gelegd op de kwantificering van het menselijk gen dat codeert voor prepro (INS), die een grotere mate van ongemethyleerde CpG posities in de coderende en promotergebieden vergelijking met andere celtypen blijkt. De bevrijding van niet-gemethyleerd INS DNA-fragmenten werd de hypothese als in de eerste plaats als gevolg van het sterven (necrotische, apoptotische) β-cellen. Onze recente studies is gebleken dat in de jeugd, verhogingen in zowel niet-gemethyleerd en gemethyleerd DNA INS op positie -69 bp (ten opzichte van thij transcriptionele site en start) werden waargenomen in nieuwe-onset T1D, en samen diende als specifieke biomarkers voor deze populatie 6. Deze biomarkeranalyses omvatten de isolatie van celvrije DNA uit serum of plasma met behulp commerciële kits rotatie, gevolgd door een bisulfiet omzetting van het geïsoleerde DNA (die niet-gemethyleerde cytosines omzetten uracils, waardoor gemethyleerde cytosines intact).
In dit rapport beschrijven we de technische aspecten van het serum monstername, isolatie van cel-vrij DNA uit serum, bisulfiet conversie, en de prestaties van de druppel digitale PCR (voortaan digitaal PCR) voor het differentieel gemethyleerd INS DNA.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethische verklaring: Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Indiana University. Ouders van proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming en kinderen ouder dan 7 jaar gaven toestemming voor hun deelname.
1. Serumverwerking
OPMERKING: De assay zoals beschreven, is grondig getest met menselijk serum dat als volgt werd geïsoleerd.
- Verzamel bloed in één rode top (geen toevoeging; ongecoat) bloedopnamebuisje.
- Laat 30 min op kamertemperatuur staan om het stolsel te laten vormen.
- Centrifugeer de buis bij 2.000 x g gedurende 10 min op kamertemperatuur. Breng de supernatant (serum) over naar een nieuwe buis bestemd voor serumopslag (polypropyleen schroefdopbuisjes, grootte afhankelijk van monsters).
- Bewaar monsters bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor DNA-isolatie.
2. DNA-extractie uit serum
OPMERKING: DNA wordt geëxtraheerd met een DNA-extractiekit met behulp van 50 μl serum (aanbevolen), volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen.
- Bereid 200 μl lysisbuffer + 1 μl poly(A) (5 μg) per monster in een microcentrifugeerbuisje. Vortex gedurende 15 sec. Zet opzij tot stap 2.3.
- Neem serummonsters uit de -80 °C vriezer en laat ze op kamertemperatuur ontdooien. Breng het volume van het serummonster op 200 μl totaal met behulp van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, met calciumchloride en magnesiumchloride).
- Lyseer het monster door 20 μl protease (1,4 Anson eenheden/ml) toe te voegen aan het monster, gevolgd door 200 μl lysisbuffer/polyA-mengsel (uit stap 2.2) en vortex gedurende 8 sec. Incubeer het monster gedurende 10 min bij 56 °C, en centrifugeer vervolgens kort gedurende 7 sec op volle snelheid in een microcentrifugeerbuisje (>10.000 x g).
- Precipiteer DNA door 230 μl 100% ethanol toe te voegen aan het monster en vortex gedurende 8 sec. Centrifugeer kort gedurende 7 sec op volle snelheid (>10.000 x g).
- Breng het DNA aan op de spinkolom door 600 μl monstermengsel toe te voegen aan de mini-spinkolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g. Gooi de flow-through weg en plaats de kolom in een schone buis.
- Was het DNA door 500 μl wasbuffer 1 toe te voegen aan de kolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g. Gooi de flow-through weg en plaats de kolom in een schone buis. Voeg 500 μl wasbuffer 2 toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 3 min op volle snelheid (>10.000 x g). Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugeerbuis en centrifugeer weer gedurende 1 min op volle snelheid.
- Elueer het DNA door de kolom in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugeerbuis te plaatsen en 60 μl elutiebuffer direct op het filter toe te voegen. Het is belangrijk om de puntjes tussen monsters te wisselen om kruisbesmetting te voorkomen. Incubeer gedurende 5 min op kamertemperatuur, en centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 6.000 x g. Voeg nog eens 60 μl elutiebuffer toe en centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g.
- Bewaar DNA bij -20 °C voor later gebruik of ga direct door met bisulfietconversie.
3. Bisulfietconversie
OPMERKING: Bisulfietconversie wordt uitgevoerd met behulp van een bisulfietconversiekit, volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen.
- Voeg 130 μl bisulfietconversiereagens toe aan 20 μl DNA uit stap 2.7 in een PCR-buisje (enkele 0,2 ml PCR-buis of 8-strip PCR-buisjes) om ongemethyleerde cytosines om te zetten in uracils. Bewaar de resterende 40 μl DNA voor later gebruik of gebruik in replicareacties. Mix 20 keer door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat er geen druppels op de zijden of het deksel zitten. Incubeer in een waterbad of thermische cycler als volgt: 98 °C gedurende 8 min, 54 °C gedurende 60 min, 4 °C gedurende 5 min.
- Ga naar stap 3.2 of bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 20 uur.
- Voeg 600 μl bindingsbuffer toe aan de spinkolom en plaats de kolom in de meegeleverde opvangbuis. Breng het bisulfiet behandelde DNA aan op de kolom en mix door 10 keer op en neer te pipetteren. Centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g). Gooi de flow-through weg.
- Was het DNA door 100 μl wasbuffer aan de kolom toe te voegen en centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g).
- Voer desulfomering uit om de sulfonaatgroep te verwijderen om de conversie van ongemethyleerde cytosines in uracil te finaliseren door 200 μl desulfomeringsbuffer aan de kolom toe te voegen. Laat 20 min op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g).
- Was het DNA door 200 μl wasbuffer aan de kolom toe te voegen en centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid. Gooi de flow-through weg en herhaal deze wasstap.
- Plaats de kolom in een 1,5 ml microcentrifugeerbuis. Elueer DNA door 10 μl elutiebuffer direct toe te voegen aan het kolomfilter. Incubeer gedurende 1 min. Centrifugeer gedurende 3
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om gegevens op de juiste wijze te interpreteren, maken we gebruik van plasmide controles voor zowel de niet-gemethyleerde en gemethyleerde doelwit INS DNA in elk digitaal PCR run. Deze controles zorgen ervoor dat signalen die overeenkomen met gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA zijn duidelijk te onderscheiden. Figuur 1 toont de 2-D spreidingsdiagrammen overeenkomt met druppeltjes van plasmide controles met bisulfiet geconverteerd niet-gemethyleerd INS...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Methylering van cytosinen van DNA-methyltransferase maakt de epigenetische controle van transcriptie van veel genen. De INS-gen bij de mens is bijna uitsluitend tot expressie gebracht in eilandje β-cellen, en er lijkt een correlatie tussen de frequentie van methylering van cytosines in de INS gen silencing van de 11 transcriptie. Als zodanig, de meeste celtypen hebben substantieel hogere frequenties van methylatie van de INS-gen bij verschillende cytosines vergelijking met cellen P ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie UC4 DK104166 (aan RGM). We wensen de assistentie van het Indiana Diabetes Research Center Translation Core te erkennen, ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie P30 DK097512.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | geen additief, ongecoat binnenkant, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropyleen, schroefdopbuis, elke maat |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | opgelost in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) tot 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (met CaCl2 en MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0,2 ml PCR 8-stripbuizen | MidSci | AVST | |
| 8-stripdoppen, koepel | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control voor Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil voor Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge voor Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips voor Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins voor Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
Referenties
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
