High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Samenvatting

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

Samenvatting

Traditionele maatregelen van intracellulair antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit afhankelijk eindpunt assays. Dergelijke eindpunt assays vereisen een aantal extra experimentele stappen voorafgaand aan het uitlezen, zoals cellysis, kiemgetal bepaling of reagens toevoeging. Bij het uitvoeren van duizenden testen, bijvoorbeeld tijdens high-throughput screening, de stroomafwaartse inspanning vereist voor deze soorten tests is aanzienlijk. Daarom bij hoge doorvoer antimicrobiële ontdekking vergemakkelijken, hebben we een real-time test gelijktijdig remmers van intracellulaire bacteriële groei bepalen en beoordelen eukaryote cel cytotoxiciteit. Specifiek werd realtime intracellulaire groei van bacteriën detectie mogelijk gemaakt door het markeren bacteriële screening stammen met ofwel een bacteriële lux operon ^(1e generatie-test) of fluorescerend eiwit reporters (2 ^e generatie, orthogonale test). Een niet-toxisch, celmembraan-impermeante, nucleïnezuurbindende dyewerd toegevoegd tijdens aanvankelijke infectie van macrofagen. Deze kleurstoffen zijn uitgesloten van levensvatbare cellen. Echter, niet-levensvatbare gastheercellen verliezen membraan integriteit waardoor binnenkomst en tl-etikettering van nucleair DNA (desoxyribonucleïnezuur). Met name DNA binding is geassocieerd met een grote toename van fluorescentie kwantumopbrengst dat een oplossing op basis uitlezen van ontvangst celdood verschaft. We hebben deze gecombineerde test gebruikt om een ​​high-throughput screen in microplate format uitvoeren en intracellulaire groei en cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van microscopie. Met name kan antimicrobiële synergie waarin het gecombineerde effect van twee of meer antimicrobiële stoffen wanneer zij samen toegepast groter dan wanneer afzonderlijk toegepast demonstreren. Testen op in vitro synergie tegen intracellulaire pathogenen gewoonlijk een wonderbaarlijke taak combinatoriële permutaties van antibiotica bij verschillende concentraties worden beoordeeld. Toch vonden we dat onze real-time analyse in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie permitted facile synergie testen. Met behulp van deze benaderingen konden we systematisch overzicht werking van een groot aantal antimicrobiële alleen en in combinatie met het intracellulaire pathogeen, Legionella pneumophila.

Inleiding

Ziekteverwekkers die in intracellulaire compartimenten groeien of verblijven tijdelijk moeilijk te therapeutisch roeien. Verplichten of relatief obligaat intracellulaire pathogenen zoals Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis en Mycobacterium spp. vereisen vaak langdurige cursussen van de antimicrobiële therapie voor de genezing die kunnen variëren van maanden tot zelfs jaren. Bovendien kan extracellulaire ziekteverwekkers tijdelijk bezet intracellulaire niches en zo ontsnappen goedkeuring door normale levels van antimicrobiële therapie en later ontstaan ​​nieuwe serie virulente infectie te veroorzaken. Staphylococcus aureus ¹ en uropathogene Enterobacteriaceae ^2,3 infecties zijn twee steeds meer erkend voorbeelden. Daarom is een fundamentele ontdekking van geneesmiddelen doel is om nieuwe antibiotica die doordringen in intracellulaire compartimenten identificeren. Optimale therapie om snel uit te roeienintracellulaire organismen en de ontwikkeling van resistentie door middel van sub-remmende antimicrobiële blootstelling te voorkomen is in het bijzonder wenselijk.

Hiervoor hebben we een high-throughput screening technologie intracellulaire penetrant antimicrobiële targeting naar de intracellulaire groei van het model pathogeen, Legionella pneumophila identificeren. ⁴ Vorige klinische observaties wijzen erop dat standaard antimicrobiële gevoeligheid testen niet nauwkeurig te voorspellen in vivo therapeutische werkzaamheid tegen dit organisme. ⁵ In het bijzonder, was dit omdat grote klassen van antimicrobiële middelen, zoals β-lactamen en aminoglycosiden, hoewel zeer effectief tegen axenisch gegroeid Legionella, onvoldoende doordringen in de intracellulaire compartimenten waarin Legionella woont. ^5,6 Later bewijs suggereerde dat technisch complexer intracellulaire groei assays effectief voorspeld klinische werkzaamheid. ⁷ Helaas zijn deze assays bewerkelijk eindpunten assays vereisen geïnfecteerde macrofagen behandeld met antimicrobiële stoffen, worden gelyseerd op verschillende tijdstippen punten kiemgetal opsomming. Dergelijke assays zijn onpraktisch te doen op grote schaal en niet geschikt voor high-throughput drug discovery.

Daarom ontwikkelden we technologie voor real-time bepaling van intracellulaire groei van bacteriën. ⁶ Dit werd bereikt door het gebruik van een bacteriële stam gemodificeerd door integratie van zowel een bacteriële luciferase operon ⁸ (eerste generatie assay hierboven beschreven) ⁴ of fluorescerend eiwit ⁹ reporters (tweede generatie orthogonale test hier beschreven) in het bacteriële chromosoom. Zo luminescerende of fluorescerend signaal verschaft een surrogaat, real-time uitlezen van aantal bacteriën.

Echter, deze attributen niet te pakken een belangrijke verstorende factor in de intracellulaire infection assays, off-target effecten op gastheercellen. In het bijzonder, de dood van de gastheercel beperkt inherent intracellulaire groei en leidt tot vals positieve identificatie van antimicrobieel effect. Zoals veel verbindingen in screening bibliotheken eukaryote cel giftig, zoals valse positieven zou gelden antimicrobiële overweldigen, noodzakelijk een groot aantal van de follow-up, endpoint cytotoxiciteit assays voor een oplossing.

Het was dus van groot belang om te kunnen eukaryote levensvatbaarheid van de cellen en intracellulaire groei tegelijkertijd beoordelen. Met name, een kenmerk van niet-levensvatbare eukaryote cellen is het verlies van celmembraanintegriteit. Probes die de permeabiliteit van de celmembraan testen kunnen daarom gebruikt worden om cellevensvatbaarheid te bepalen. We eerder gekarakteriseerde het vermogen van een reeks vermoedelijk celmembraan-impermeante, fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen om vlekken en nucleaire DNA van dode cellen. ⁴ op binding nucleair DNA, deze kleurstoffen vertonen een grote toename van Quantum fluorescerende opbrengst resulteert in een verhoogde signaal over achtergrond oplossing fluorescentie. Als zodanig zijn deze kleurstoffen heeft het een kwantitatieve uitlezing van eukaryote celdood. ⁴ name, vonden we dat verschillende waren niet giftig zich tijdens langdurige co-incubatie met J774 macrofagen. Wanneer toegevoegd tijdens de eerste infectie, mits hij realtime de fluorescentie van eukaryote celdood kan worden gemeten met een microplaat fluorimeter of geobserveerd microscopisch.

Daarom combineert het gebruik van een bacteriële reporter en niet-toxisch, membraan-impermeante, DNA-bindende kleurstoffen, konden we een eenvoudige, niet-destructieve, real-time bepaling van zowel bacteriologische belasting en eukaryote cel cytotoxiciteit tegelijk meten. Deze test heeft ons toegelaten om het scherm in 384-well plaat formaat ~ 10.000 bekende bioactieve stoffen, waaronder ~ 250 antimicrobiële stoffen en> 240.000 kleine moleculen met functioneel uncharacterized activiteit voor de mogelijkheid om intracellulaire groei van de remmenLegionella pneumophila, terwijl tegelijkertijd het genereren eukaryote cel cytotoxiciteit voor elke verbinding. ⁶ Onze analyse van bekende antimicrobiële middelen tegen intracellulaire groei van Legionella was de meest uitgebreide verkenning van dit type tot nu toe. ⁶

Op basis van de efficiëntie van onze testformaat we vervolgens onderzocht de mogelijke synergistische effecten van bekende antimicrobiële stoffen bij gebruik in combinatie. Een van de meest voorkomende synergie proeven, de zogenaamde dambord assay wordt uitgevoerd door het bepalen standaard combinatorische effecten van tweevoudige seriële verdunningen van twee of meer antimicrobiële middelen. ¹⁰ In deze testen wordt synergie bepaald door de waarneming van groter effect wanneer twee of meer antimicrobiële middelen samen dan de som van de effecten van elk gemonteerde toegepast. Van de nota, tot nu toe, alleen gericht en selectieve synergie testen werden uitgevoerd tegen intracellulaire Legionella pneumophila vanwege de grote inspanning bij het traditionele eindpunt assays vermenigvuldigd met de combinatorische permutaties vereist.

Synergie kunnen testen, maakten we gebruik van onze real-time intracellulaire groei / eukaryotische cytotoxiciteit assay in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie ^6. Deze automatisering mogen wij seriële verdunningen van verbindingen opgelost in DMSO of waterige oplossing alleen of in combinatie in 384 putjes afgeven. ¹¹ Bovendien, zo krachtige vloeistofverwerking technologie mogen wij eenvoudig uitvoeren hogere resolutie, vierkantswortel van twee (in plaats van de standaard, resolutieverschillen verdubbeling) verdunning combinaties met hogere specificiteit in onze tweedimensionale bereiken, schaakbord synergie analyse. Deze resolutie is bijzonder waardevol bij het aanpakken van problemen op het gebied van synergie over de reproduceerbaarheid bij het gebruik van tweevoudige verdunningsreeks ^12. Tenslotte onze test was kwantitatief en ook therefore gemeten gradaties van remming. Als resultaat was de zuiverheid gevangen het geheel van remmende informatie expressie in isocontour isobolograms waarin isolijnen verbinding combinatorische concentraties met een vergelijkbaar niveau van groeiremming. ⁶ Deze plotten strategie liet visualisatie van combinatorische dosis-respons curves. Om onze methodologie te illustreren, beschrijven we ons protocol voor het uitvoeren van deze testen en tonen representatieve resultaten.

Protocol

1. Real Time Intracellulaire groei en eukaryote cel cytotoxiciteit Assay

1. Het voorbereiden van gastheercellen (J774A.1 Cells)
   1. Cultuur J774A.1 Mus musculus macrofaag-achtige cellen in suspensie in RPMI 1640 met 9% ijzer aangevuld kalfsserum. Aanvankelijk passage in weefselkweek kolven. Na cellen confluent in een 75 ^cm2 weefselkweek kolf in 15 ml medium geworden, gesplitst door schrapen en verdunnen tot 65 ml met hetzelfde type medium, waarvan 15 ml wordt teruggevoerd naar de weefselkweek kolf en 50 ml overgebracht een 250 ml schudkolf bacteriën.
   2. Voor opschaling cultuur in suspensie in 250 ml en / of 1000 ml bacteriële kolven gevuld tot een vijfde volume met weefselkweekmedium. Beluchten door rotatiesnelheid ongeveer 120 omwentelingen per minuut. Voor een consistente groei incuberen bij precies _5% CO2 en 37 ° C.
   3. Oogst cellen wanneer ze de dichtheid te bereiken in het bereik van 2,5 x 10 ⁶ cellen/ ml tot 5 x 10 ⁶ cellen / ml. Zorg ervoor dat dode cel percentage (het gemakkelijkst bepaald door trypan blauwe vlekken) niet meer dan 25%, zoals dode cellen achtergrondgeluid in cytotoxiciteit assays zal toenemen.
   4. Plaat in het wit, weefselkweek behandeld, 384-putjes 5 x 10 ⁴ J774A.1 cellen in 30 ul weefselkweek medium per well. Incubeer overnacht microplaten tot 90% confluentie op de dag van het experiment bereiken.
2. Het voorbereiden van Lichtgevende of Fluorescent Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux ⁸⁾ bacteriën op geschikt medium, dat wil zeggen, gebufferd houtskool gistextract (BCYE) medium. Bij gebruik van een thymidine auxotrofe stam medium aangevuld met 100 ug / ml thymidine. Bereid stukjes bacteriën experimenten door het verspreiden organismen dik op een nieuwe BCYE plaat en incuberen van één dag (of een eerdere passage plaat) of 2:58 (waar van ingevroren voorraad) te verkrijgen confluentegroei.
      1. Bereid BCYE platen door het oplossen van 10 g gistextract, 10 g N - (2-aceetamido) -2-aminoethaansulfonzuur, 0,35 g K ₂ HPO ₄ en 1 g monobasisch kaliumfosfaat α-ketoglutaraat in 950 ml gedeïoniseerd water. Op pH 6,9 met kaliumhydroxide (11,9 ml ≥2.5 molaire oplossing).
      2. Voeg 15 g agar en 2 g geactiveerde kool; en breng aan 1 L eindvolume. Voeg een magnetische roerstaaf en autoclaaf. Koel medium tot 55 ° C en voeg filtergesteriliseerd oplossingen die 0,4 gram L-cysteïne en 0,42 g ammonium ijzer (III) citraat, opgelost in gedeïoniseerd water. Gebruik magneet roer plaat te mengen voorafgaand aan het gieten van Petri platen.
      3. Voor het testen van L. pneumophila groei in axenic groeimedium, bereiden ACES-gistextract bouillon (AYE) door het combineren van alle chemische reagentia gebruikt voor BCYE niet voor houtskool agar. Filter steriliseren en onmiddellijk te gebruiken, of de vriezer bewaren voor latere experimenten.
   2. Resuspendeer organismen in de same kweekmedium weefsel voor J774A.1 cellen met 100 ug / ml thymidine suppletie waar nodig.
3. macrofaag Infectie
   1. Voeg testverbindingen plaats (screenen van verbindingen en positieve en negatieve controles voor bacteriële groeiremming en eukaryote cel lysis). Bij voorkeur lossen voorraadoplossingen in ≥500x in DMSO (dimethylsulfoxide) of een waterige oplossing voldoende verdunning van voertuig mogelijk.
      1. Hoewel de voorraad oplossingen bevroren kunnen worden opgeslagen, vermijd vries-dooi cycli voor labiele verbindingen en antimicrobiële middelen.
   2. Verdun lichtgevende bacteriën targeten van 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonievormende eenheid) / m en fluorescerende reporter-gemerkte bacteriën 1,0 x 10 ⁷ CFU / ml in weefselkweekmedium en voeg geschikte niet-toxische, membraan-impermeante, nucleïnezuur- bindende kleurstof bij 2,5x eindassayconcentratie.
   3. Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de definitieve test volume50 pl, bacteriële uiteindelijke concentratie 1 x 10 ⁶ CFU / ml (lux operon reporter) of 4 x 10 ⁶ 10 CFU / ml (reporter fluorescent eiwit).
   4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen in _5% CO2 bij 100% relatieve vochtigheid verdamping randeffecten te voorkomen.
4. assay uitlezing
   1. Lees bacteriegroei en eukaryote cel toxiciteit op een microplaat luminometer en fluorimeter afhankelijk van reporters gebruikt.
      1. To-temperatuur geassocieerde randeffecten te vermijden, thermisch evenwicht microplaten vóór luminescentie lezing plaatsing in een enkele laag op een laboratoriumtafel met deksels kier ongeveer 20 minuten (of in een biologische veiligheidskast met deksels ongeveer 10 min).
   2. Terug microplaten om incubator als real-time uitlezing op latere tijdstippen gewenst is.

2. Data Analysis

1. Normaliseren van gegevens naar positieve en negatieve conbedieningstoetsen aan procent of fold-remming te berekenen voor intracellulaire groei van bacteriën en het percentage cytotoxiciteit voor eukaryote cellen.
2. Om assay robuustheid beoordelen, berekenen statistische scheiding tussen positieve en negatieve controles voor zowel bacteriegroei inhibitie en cytotoxiciteit via Z-factor (Z) meten waarbij Z '= 1-3 (σ _p + σ _n) / | p _p + p _n |. In deze vergelijking, σ σ _p en _n de standaardafwijkingen van de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk; μ _p p en _n zijn de gemiddelde waarden voor de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk.
   1. Voor high-throughput screening assays, berekent standaard z-scores (of andere alternatieve kwantitatieve statistische maten) effecten van testverbindingen plaats bepalen. Als alternatief, berekenen een eenvoudige fold-reductie of log-voudige verlaging als een potentieel fysiologisch relevanter maatregel effect magnitude voor geometrisch repliceren bacteriën.

3. Single en multi-dimensionale (dat wil zeggen, Synergy) Dosis-respons testen en interpretatie van gegevens

1. Bereid macrofagen en bacteriën zoals beschreven in protocol paragraaf 1.
2. Juist voorafgaand aan infectie of axenic incubatie antimicrobiële experimentele toevoegen belang in een seriële, verdubbeling verdunning serie, met het doel spanning aan de hoge kant een concentratie die groei volledig elimineert (dwz de minimale remmende concentratie of MIC) en de lage uiteindelijk een concentratie die geen duidelijke activiteit toont.
3. Gebruik een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsysteem enkelvoudige dosis-respons en combinatorische synergie meetopstelling via directe, geautomatiseerde toevoeging van antimicrobiële verdunningen volgens het protocol van de fabrikant vergemakkelijken.
4. Overweeg gebruik van verder tweevoudige verdunningen, bijvoorbeeld,841 / 54841eq1.jpg "/> - voudige verdunning series en assay repliceert om de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de gegevens te verhogen.
5. Voor macrofaag infectie, verdunnen lichtgevende bacteriën te richten van 2,5 x 10 ⁶ CFU (kiemgetal) / ml in weefselkweek medium. Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de uiteindelijke assay volume 50 pl, uiteindelijke bacteriële concentratie 1 x 10 ⁶ CFU / ml; en incuberen bij 37 ° C in 5% CO ₂ bij 100% relatieve vochtigheid.
   1. Voor axenic groei testen verdund lichtgevende bacteriën tot een eindconcentratie van 1 x 10 ⁶ CFU / ml in AYE medium, voeg 50 ul aan elk putje van een 384-wells plaat en incubeer bij 37 ° C in 5% CO ₂ bij 100% relatieve vochtigheid.
6. Bereken fractionele remmerconcentratie index antimicrobiële combinaties die bacteriegroei te remmen. Voor elk geneesmiddel in de combinatie (a, b,.. N) die leidt tot volledige of> 99% remming van bacteriële gGROEI Bereken de afzonderlijke fractionele remmende concentratie (FIC _{a, b, n...)} als volgt: FIC _a = de concentratie van de verbinding "a" gedeeld door de minimale concentratie van inhibitor "een" als zodanig. _. Met behulp van dezelfde formule, bereken FIC _b, enz. Bereken vervolgens de combinatorische FIC-index of FIC = FIC _a + _b + FIC. . .FIC _N voor elke remmende combinatie.
   1. Gebruik de combinatorische index die het verst afwijkt van 1,0 tot synergie te beoordelen. Overweeg een cutoff van ≤0.5 als een conservatieve indicatie van een synergetisch effect en ≥4, een antagonist effect. ¹²
   2. Plot isobolograms, isocontour isobolograms, en / of isosurface isobolograms ⁶ als alternatieve grafische voorstellingen van combinatorische effecten.

Resultaten

Microplate intracellulaire groei assay

Figuur 1 schema de test stappen. De geautomatiseerde getoonde stappen kunnen handmatig worden uitgevoerd. Echter doorzet aanzienlijk vergemakkelijkt middels vloeistofverwerking systemen.

Figuur 2 toont representatieve resultaten van een 384-well microplaat, dual-uitlezing, real-time intracellul...

Discussie

We beschrijven real-time assays voor gelijktijdige detectie van intracellulaire groei van bacteriën en gastheercellen cytotoxiciteit. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Ten eerste, voor robuuste test prestaties, moet er voldoende spectrale scheiding tussen bacteriële en cytotoxiciteit uitlezingen zijn. Een dergelijke scheiding is intrinsiek voor combinaties van luciferase operon reporters en TL-DNA-bindende kleurstoffen. Op basis van onze ervaring (Tabel 1-3, figuur 2),

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
J774A.1 cellen	American Type Culture Collection	TIB-67	Gastcel
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Gistextract, ultragefilterd	Becton-Dickinson/Difco	210929	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; lagere kwaliteiten kunnen verminderde groei en/of veranderde gevoeligheid van Legionella voor groeiremmende middelen veroorzaken
Alfa-ketoglutaarzuur, monokaliumzout	Sigma-Aldrich	K2000	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Natriumpyruvaat	Sigma-Aldrich	P5280	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Kaliumfosfaat, dibasisch	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
L-cysteïne	Sigma-Aldrich	C-7755	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Ammonium ijzer (III) citraat	Sigma-Aldrich	F5879	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; ferric pyrofosfaat kan in plaats daarvan worden gebruikt, maar is moeilijker nauwkeurig af te wegen
Kaliumhydroxideoplossing, geconcentreerd	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Thymidine (weefselkweekkwaliteit)	Sigma-Aldrich	T1895	Voor het suppleren van zowel RPMI 1640 als buffered yeast extract agar/medium — lagere kwaliteit thymidine kan voor het laatste worden gebruikt, maar kan verminderde celgroei en/of celdood in RPMI 1640 veroorzaken
RPMI 1640, standaardformulering	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Voor het kweken van J774A.1 cellen voorafgaand aan het plateren; bevat 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 zonder fenolrood	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Voor het plateren van J774A.1 cellen in 384-well platen (niet geschikt voor groei voorafgaand aan plateren); bevat ook geen L-glutamine — aanvullen tot 2 mM vóór gebruik
L-glutamine, 200 mM in 0,85% NaCl (weefselkweekkwaliteit)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Voor het suppleren van RPMI 1640 zonder L-glutamine, tot 2 mM eindconcentratie
IJzer-gesupplementeerd calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	Voor het suppleren van RPMI 1640, tot 9,1% eindconcentratie
Trypanblauw oplossing	Sigma-Aldrich	T8154	Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood terwijl de celdichtheid wordt geteld
SYTOX Green, 5 mM oplossing in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood door fluorescendometring of epifluorescentiemicroscopie (in combinatie met oranje-rode of verre rode fluorescente bacteriën). Gebruik op 125 nM eindconcentratie.
Celkweekincubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Voor incubatie van J774A.1 cellen (zowel voor als na infectie); kan ook worden gebruikt voor incubatie van bacteriën, of een standaard atmosfeer incubator kan in plaats daarvan worden gebruikt)
Orbitale shaker	BellCo Glass	7744-01010	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; past binnen de celkweekincubator; inclusief shakerbasis 7744-01000 en tray 7740-01010 (deze zijn ook afzonderlijk verkrijgbaar)
Scheiderflessen (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderklemmen voor flessen (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderflessen (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderklemmen voor flessen (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Sponsapschuim doppen voor flessen (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; vermindert het risico op besmetting ten opzichte van standaard metalen doppen
MultiDrop Combi programmeerbare multikanaals peristaltiekpomp	Thermo Fisher Scientific	5840300	Voor het doseren van J774A.1 cellen, medium en bacteriesuspensie met fluoroforen naar grote aantallen 384-well platen
Combi standaard boring manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Standaard vooraf doseervolume van 20 μl is onvoldoende om te compenseren voor sedimentatie — verhogen naar 80 μl
Witte 384-well platen behandeld voor weefselkweek	Corning	3570	Voor het lezen van luminescentie en fluorescendie; Greiner catalogus # 781080 ook succesvol getest
DMSO (weefselkweekkwaliteit, in verzegeld ampullen)	Sigma-Aldrich	D2650	Voor het oplossen van positieve controle en testverbindingen
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibioticum positieve controle
Saponine (uit Quillaja schors)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cy