High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Samenvatting

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

Samenvatting

Traditionele maatregelen van intracellulair antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit afhankelijk eindpunt assays. Dergelijke eindpunt assays vereisen een aantal extra experimentele stappen voorafgaand aan het uitlezen, zoals cellysis, kiemgetal bepaling of reagens toevoeging. Bij het uitvoeren van duizenden testen, bijvoorbeeld tijdens high-throughput screening, de stroomafwaartse inspanning vereist voor deze soorten tests is aanzienlijk. Daarom bij hoge doorvoer antimicrobiële ontdekking vergemakkelijken, hebben we een real-time test gelijktijdig remmers van intracellulaire bacteriële groei bepalen en beoordelen eukaryote cel cytotoxiciteit. Specifiek werd realtime intracellulaire groei van bacteriën detectie mogelijk gemaakt door het markeren bacteriële screening stammen met ofwel een bacteriële lux operon ^(1e generatie-test) of fluorescerend eiwit reporters (2 ^e generatie, orthogonale test). Een niet-toxisch, celmembraan-impermeante, nucleïnezuurbindende dyewerd toegevoegd tijdens aanvankelijke infectie van macrofagen. Deze kleurstoffen zijn uitgesloten van levensvatbare cellen. Echter, niet-levensvatbare gastheercellen verliezen membraan integriteit waardoor binnenkomst en tl-etikettering van nucleair DNA (desoxyribonucleïnezuur). Met name DNA binding is geassocieerd met een grote toename van fluorescentie kwantumopbrengst dat een oplossing op basis uitlezen van ontvangst celdood verschaft. We hebben deze gecombineerde test gebruikt om een ​​high-throughput screen in microplate format uitvoeren en intracellulaire groei en cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van microscopie. Met name kan antimicrobiële synergie waarin het gecombineerde effect van twee of meer antimicrobiële stoffen wanneer zij samen toegepast groter dan wanneer afzonderlijk toegepast demonstreren. Testen op in vitro synergie tegen intracellulaire pathogenen gewoonlijk een wonderbaarlijke taak combinatoriële permutaties van antibiotica bij verschillende concentraties worden beoordeeld. Toch vonden we dat onze real-time analyse in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie permitted facile synergie testen. Met behulp van deze benaderingen konden we systematisch overzicht werking van een groot aantal antimicrobiële alleen en in combinatie met het intracellulaire pathogeen, Legionella pneumophila.

Inleiding

Ziekteverwekkers die in intracellulaire compartimenten groeien of verblijven tijdelijk moeilijk te therapeutisch roeien. Verplichten of relatief obligaat intracellulaire pathogenen zoals Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis en Mycobacterium spp. vereisen vaak langdurige cursussen van de antimicrobiële therapie voor de genezing die kunnen variëren van maanden tot zelfs jaren. Bovendien kan extracellulaire ziekteverwekkers tijdelijk bezet intracellulaire niches en zo ontsnappen goedkeuring door normale levels van antimicrobiële therapie en later ontstaan ​​nieuwe serie vi....

Protocol

1. Real Time Intracellulaire groei en eukaryote cel cytotoxiciteit Assay

1. Het voorbereiden van gastheercellen (J774A.1 Cells)
   1. Cultuur J774A.1 Mus musculus macrofaag-achtige cellen in suspensie in RPMI 1640 met 9% ijzer aangevuld kalfsserum. Aanvankelijk passage in weefselkweek kolven. Na cellen confluent in een 75 ^cm2 weefselkweek kolf in 15 ml medium geworden, gesplitst door schrapen en verdunnen tot 65 ml met hetzelfde type medium, waarvan 15 ml wordt teruggevoerd naar de weefselkweek kolf en 50 ml overgebracht een 250 ml schudkolf bacteriën.
   2. Voor opschaling cultuur in suspensie in 250 ml en / of 1000 ml bacteriële k....

Resultaten

Microplate intracellulaire groei assay

Figuur 1 schema de test stappen. De geautomatiseerde getoonde stappen kunnen handmatig worden uitgevoerd. Echter doorzet aanzienlijk vergemakkelijkt middels vloeistofverwerking systemen.

Figuur 2 toont representatieve resultaten van een 384-well microplaat, dual-uitlezing, real-time intracellul.......

Discussie

We beschrijven real-time assays voor gelijktijdige detectie van intracellulaire groei van bacteriën en gastheercellen cytotoxiciteit. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Ten eerste, voor robuuste test prestaties, moet er voldoende spectrale scheiding tussen bacteriële en cytotoxiciteit uitlezingen zijn. Een dergelijke scheiding is intrinsiek voor combinaties van luciferase operon reporters en TL-DNA-bindende kleurstoffen. Op basis van onze ervaring (Tabel 1-3, figuur 2),

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
J774A.1 cellen	American Type Culture Collection	TIB-67	Gastcel
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Gistextract, ultragefilterd	Becton-Dickinson/Difco	210929	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; lagere kwaliteiten kunnen verminderde groei en/of veranderde gevoeligheid van Legionella voor groeiremmende middelen veroorzaken
Alfa-ketoglutaarzuur, monokaliumzout	Sigma-Aldrich	K2000	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Natriumpyruvaat	Sigma-Aldrich	P5280	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Kaliumfosfaat, dibasisch	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
L-cysteïne	Sigma-Aldrich	C-7755	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Ammonium ijzer (III) citraat	Sigma-Aldrich	F5879	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; ferric pyrofosfaat kan in plaats daarvan worden gebruikt, maar is moeilijker nauwkeurig af te wegen
Kaliumhydroxideoplossing, geconcentreerd	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium
Thymidine (weefselkweekkwaliteit)	Sigma-Aldrich	T1895	Voor het suppleren van zowel RPMI 1640 als buffered yeast extract agar/medium — lagere kwaliteit thymidine kan voor het laatste worden gebruikt, maar kan verminderde celgroei en/of celdood in RPMI 1640 veroorzaken
RPMI 1640, standaardformulering	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Voor het kweken van J774A.1 cellen voorafgaand aan het plateren; bevat 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 zonder fenolrood	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Voor het plateren van J774A.1 cellen in 384-well platen (niet geschikt voor groei voorafgaand aan plateren); bevat ook geen L-glutamine — aanvullen tot 2 mM vóór gebruik
L-glutamine, 200 mM in 0,85% NaCl (weefselkweekkwaliteit)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Voor het suppleren van RPMI 1640 zonder L-glutamine, tot 2 mM eindconcentratie
IJzer-gesupplementeerd calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	Voor het suppleren van RPMI 1640, tot 9,1% eindconcentratie
Trypanblauw oplossing	Sigma-Aldrich	T8154	Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood terwijl de celdichtheid wordt geteld
SYTOX Green, 5 mM oplossing in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood door fluorescendometring of epifluorescentiemicroscopie (in combinatie met oranje-rode of verre rode fluorescente bacteriën). Gebruik op 125 nM eindconcentratie.
Celkweekincubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Voor incubatie van J774A.1 cellen (zowel voor als na infectie); kan ook worden gebruikt voor incubatie van bacteriën, of een standaard atmosfeer incubator kan in plaats daarvan worden gebruikt)
Orbitale shaker	BellCo Glass	7744-01010	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; past binnen de celkweekincubator; inclusief shakerbasis 7744-01000 en tray 7740-01010 (deze zijn ook afzonderlijk verkrijgbaar)
Scheiderflessen (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderklemmen voor flessen (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderflessen (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Scheiderklemmen voor flessen (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie
Sponsapschuim doppen voor flessen (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; vermindert het risico op besmetting ten opzichte van standaard metalen doppen
MultiDrop Combi programmeerbare multikanaals peristaltiekpomp	Thermo Fisher Scientific	5840300	Voor het doseren van J774A.1 cellen, medium en bacteriesuspensie met fluoroforen naar grote aantallen 384-well platen
Combi standaard boring manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Standaard vooraf doseervolume van 20 μl is onvoldoende om te compenseren voor sedimentatie — verhogen naar 80 μl
Witte 384-well platen behandeld voor weefselkweek	Corning	3570	Voor het lezen van luminescentie en fluorescendie; Greiner catalogus # 781080 ook succesvol getest
DMSO (weefselkweekkwaliteit, in verzegeld ampullen)	Sigma-Aldrich	D2650	Voor het oplossen van positieve controle en testverbindingen
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibioticum positieve controle
Saponine (uit Quillaja schors)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cy