Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Een protocol voor het onderzoeken van het paringsgedrag van de dennennematode, Bursaphelenchus xylophilus, wordt gepresenteerd. Gedragskenmerken van B. xylophilus worden beschreven in het paringsproces.

Abstract

Een methode voor de waarneming en kwantificeren van het paargedrag van het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, werd opgericht in het kader van een stereomicroscoop. De paring efficiëntie van B. Xylophilus verbeteren en de kans op paring observatie te vergroten, maagdelijk volwassenen werden gekweekt en gebruikt voor het onderzoek. Eieren werden verkregen door het houden van de aaltjes in het water en het toestaan ​​van de vrouwtjes om eieren te leggen gedurende 10 min. De tweede fase juvenielen (J2) werden gesynchroniseerd door het incuberen van de eieren voor 24 uur bij 25 ° C in het donker, en het begin J4 werden verkregen door het kweken van de J2 met grijze schimmel, Botrytis cinerea, nog eens 52 uur. Op dit tijdstip konden de meeste J4 nematoden duidelijk onderscheiden als zijnde mannelijke of vrouwelijke genitale behulp van hun morfologie. De mannelijke en vrouwelijke J4 werden verzameld en gekweekt in twee afzonderlijke Petrischalen voor 24 uur tot maagdelijke volwassen nematoden krijgen. Een maagd mannelijke en een vrouwelijke maagd werden gekoppeld in een druppel water in de put van een concave slide. Het paringsgedrag werd gefilmd met een videorecorder onder een stereomicroscoop. De gehele duur van de paring proces was 82,8 ± 3,91 min (gemiddelde ± SE) en kan worden opgedeeld in 4 verschillende fasen: zoeken, contact op te nemen, copuleren, en slepende. De gemiddelde notulen van duur waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 en 7,2 ± 0,5, respectievelijk. Elf sub-gedragingen werden beschreven: het kruisen, het naderbij komen, ontmoeten, aanraken, hooping, het opsporen, het bevestigen, ejaculeren, het scheiden, rust, en roaming. Interessant, werd duidelijk intraseksueel concurrentie waargenomen wanneer een vrouwtje was gegroepeerd met 3 mannen of een man met 3 vrouwen. Dit protocol is nuttig en waardevol, niet alleen bij het onderzoek het paringsgedrag van B. xylophilus, maar ook als een referentie voor ethologische studies van andere nematoden.

Introduction

De dennenematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner en Buhrer) Nickle, is een van de meest destructieve invasieve soorten, die het verwelken en uiteindelijk de dood van dennen veroorzaakt. Men neemt aan dat deze pathogene nematode inheems is in de VS, maar hij is getransporteerd naar verschillende landen, waaronder China, Japan, Zuid-Korea en Portugal. Onlangs is hij ook gemeld in Spanje, waarbij miljoenen dennen zijn omgekomen met enorme economische verliezen en een bedreiging voor de bosproductie en ecologische stabiliteit^1-5.

Zodra een gastheerden is geïnfecteerd door dennenematoden, worden er snel duizenden miljoenen nakomelingen in de stam geproduceerd. Dit veroorzaakt disfunctie van het xyleem, wat resulteert in verwelking en uiteindelijk de dood van de gastheerboom⁶. Er is echter momenteel geen efficiënte manier om deze ziekte te bestrijden. Paringsgedrag kan een belangrijke rol spelen in de hoge vruchtbaarheid van deze nematode⁷. Daarom hebben we het paringsgedrag van B. xylophilus in het laboratorium onderzocht en geprobeerd een effectieve manier te vinden om zijn paring te verstoren en zijn vruchtbaarheid te verminderen.

Dit protocol is bedoeld om de gedetailleerde methoden te introduceren voor het verkrijgen van de maagdelijke volwassenen van B. xylophilus en om het paringsgedrag te observeren en te analyseren met behulp van een videorecorder en een stereomicroscoop. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een referentie voor gedragsstudies van andere nematoden.

Protocol

1. Verwerving van Virgin Adult Nematoden

1. Pinewood nematode isolaat en kweekomstandigheden
   NB: De B. xylophilus isoleren Nxy61 werd oorspronkelijk gewonnen uit een zieke Pinus massoniana in de Ningbo gebied van de provincie Zhejiang in China.
   1. Bereid Potato Dextrose Agar (PDA, zie tabel van Materialen) platen voor de teelt van Botrytis cinerea.
   2. Voor enting, punch een stuk schimmel mat met een diameter van 10 mm uit een B. cinerea mat en zet het in het midden van een nieuwe PDA plaat. Cultuur de B. cinerea gedurende 5 dagen bij 25 ° C in het donker.
   3. Cultuur dennennematoden de gevulde petrischaaltje met B. cinerea bij 25 ° C in het donker.
2. Overname van B. xylophilus eieren
   1. Plaats een vastgeklemd rubberen slang onder een trechter en houd de voorbereide trechter in een rek aan de assemblerenBaermann trechter apparaat. Plaats twee lagen van filterpapier in plaats van gaas in de mond van de trechter.
   2. Breng de schimmel culturen aan de trechter setup en voeg water toe tot de schimmel mat is ondergedompeld. Wacht 2 uur, en nematoden zal komen uit de schimmel cultuur, steek de filter papier, en zich te vestigen in het laagste deel van de Baermann trechter.
   3. Verzamel de eerste paar druppels water van de bodem van de buis in een 15 ml buis en laat nematoden door langzaam vrijgeven van de klem op de buis.
   4. Centrifugeer de bovengenoemde verzamelingen bij 3000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder de bovenste laag water met een pipet en resuspendeer met 1 ml steriel dubbel gedestilleerd (dd) H ₂ O.
   6. Met een pipet de bovenstaande resuspensie naar een nieuwe glazen petrischaal (6 cm diameter). Voeg 3 ml steriel dd _H2O de petrischaal zodat de nematoden vrij kunnen zwemmen.
   7. Houd de aaltjes in het glass petrischaal gedurende 10 min bij 25 ° C in het donker. De eieren worden gelegd door zwangere vrouwen. Vanwege hun glycoproteïne oppervlak, zal de eieren aan de bodem van de glazen petrischaal.
   8. Verwijder het water en wormen voorzichtig, zonder de eieren te storen. Voeg 3 ml steriel dd _H2O de glazen petrischaal onmiddellijk te voorkomen dat de eieren uitdrogen.
   9. Herhaal stap 1.2.8 3x alle larven en volwassenen te verwijderen en het zuivere eieren te verkrijgen. Voeg een extra 2 ml (5 ml in totaal) steriel dd H ₂ O aan de petrischaal.
3. Overname van de vierde etappe jongeren (J4 larven)
   1. Hatch verzamelde eieren voor 24 uur in het donker bij 25 ° C J2 larven te verkrijgen.
   2. Breng de J2 larven met een pipet in een 15 ml buis, centrifuge bij 3000 xg gedurende 2 minuten, en verwijder de bovenste laag van het water.
   3. Resuspendeer de J2 larven met 200 pl steriel dd H ₂ O, en vervolgens overbrengen naarde PDA plaat met B. cinerea.
   4. Cultuur J2 larven gedurende 52 uur bij 25 ° C in het donker. Op dit tijdstip zullen de meeste J2 larven hebben ontwikkeld in de vroege fase van J4 larven.
4. Overname van maagdelijke volwassen nematoden
   1. Bereid een naald voor het oppakken van aaltjes door het tekenen van een glazen capillaire na verhitting het over een alcohol brander.
      OPMERKING: De tip van de capillaire naald moet meestal 50 urn in diameter, ongeveer lichaam breedte van een volwassen nematode, zodat het kan worden gebruikt als instrument voor het oppakken van een nematode.
   2. Monteer een Baermann trechter en extraheren nematoden uit de fungale culturen 2 uur, zoals beschreven in stap 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Breng de J4 met water in een schone petrischaal.
   4. Neem de nematoden onder een stereomicroscoop en onderscheid tussen mannen en vrouwen met genitale morfologie, zoals beschreven door Mamiya en Kiyohara ⁸ (figuur 1 ). Pick-up een nematode van het gewenste seks met de voorbereide capillaire naald en breng het naar de juiste schimmel-cultuur plaat voor mannen of vrouwen.
      LET OP: Er zijn meer vrouwen dan mannen, met het percentage van de vrouwtjes bij 60 - 70%. De vrouwelijke vulva is duidelijk verschillend van de mannelijke spicule. In vergelijking met de volwassen, de spicule of vulva in startende J4 kleiner, maar nog goed te zien en onderscheiden. De nematode is altijd in beweging in het water, die soms moeilijk te onderscheiden mannetjes en vrouwtjes verhoogt.
   5. Cultuur J4 larven nog eens 24 uur bij 25 ° C in het donker.
      OPMERKING: Alle aaltjes moet zich ontwikkelen tot volwassenen, maar omdat ze ongedempte, worden ze beschouwd als maagd volwassenen.
   6. Monteer twee Baermann trechters en pak de maagd volwassenen uit de schimmel kweken gedurende 2 uur, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 - 1.2.3, en de overdracht van de maagd volwassen mannen en vrouwen in twee afzonderlijke, schone Petri gerechten.

2. Observatie en video-opname van paargedrag

1. Bereid meerdere concave dia en voeg 200 ul steriel dd H ₂ O aan elk van de putjes.
2. Pick-up de voorbereide maagd volwassen mannelijke of vrouwelijke en met een capillaire naald en zet slechts één nematode in het water van elke concave glijbaan.
3. Houd de maagd volwassenen in de put gedurende 1 uur om hen te laten passen aan de nieuwe waterige omgeving.
4. Combineer een maagd mannelijk en vrouwelijk door de overdracht van één van hen van de ene put naar de andere met behulp van een pipet.
5. Let op de paargedrag van de 1♀ + 1♂ combinatie in het concave dia onder een stereomicroscoop.
6. Om de paring efficiëntie van virgin volwassenen te analyseren, berekenen hun paring slagingspercentage (R) en te vergelijken met die van willekeurig geselecteerde volwassen paren. Bereken R als het percentage herhalingen waarin copulatie werd waargenomen vergeleken met het totale aantal duplo onderzocht.
7. Om de paring keuze en intraseksuele concurrentie, de groep te onderzoeken en te observeren maagdelijke nematoden van twee verschillende combinaties: 1♀ + 3♂ en 3♀ + 1♂.
8. Om de gegevens te verzamelen voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse, filmen het paargedrag met behulp van video-microscopie. Gewoonlijk wordt de gehele paring, vanaf het moment waarop de nematoden in de put van het concave dia moment worden geplaatst wanneer zij zich na copulatie verplaatsen, voltooid binnen 2 uur. Daarom gaat opnemen de paring gedurende minstens 2 uur als een herhaling. Volledige tenminste 30 repliceert in totaal voor elke combinatie.
   NB: Voeg meer steriel dd _H2O (gewoonlijk 50 pl) per 0,5 h naar de bron om te compenseren voor verdamping tijdens het opnameproces.

3. Data Collection

1. Alle video voorzichtig op een computerscherm en karakteriseren van de sub-gedrag kwalitatief.
2. Meet de tijdsduur van de paring met behulp the beeld-voor-beeld-functie van de videorecorder. Handmatig aftrekken van de starttijd van het eindpunt.
3. Voor de 1♀ + 1♂ combinatie, analyseert elke video-opname en het meten van de duur van de volgende evenementen:
   1. Meet de duur van het zoeken (dwz de tijd tussen de vrouwelijke en mannelijke worden ingebracht in de put van het concave dia aan het moment dat ze ontmoeten en elkaar raken).
   2. Meet de duur van contact (dat wil zeggen de tijd vanaf het eerste contact tot het moment waarop de mannelijke juist is gepositioneerd op de vrouwelijke vulva voor de eerste paring).
   3. Meet de duur van copulerende (dat wil zeggen, de tijd vanaf het moment dat de man precies is gepositioneerd op vulva van het vrouwtje tot hij glijdt uit het lichaam van het vrouwtje na de zaadlozing). Opmerking: Sommige nematoden kan meerdere keren copuleren in 2 uur. In dit geval meet de duur van paring van de eerste paring aan het einde van de last een, inclusief de tijd daartussen.
   4. Meet de duur van aanhoudende (dat wil zeggen de periode na de paring tot de mannelijke en vrouwelijke zwemmen afstand van elkaar en zijn gescheiden door een afstand van meer dan de lichaamslengte nematoden (meestal 1 mm)).
4. Tel de copulatie frequentie en duur van elke copulatie en de gemiddelde duur van alle copulaties in 2 uur voor elk van de verschillende combinaties (dat wil zeggen, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ en 1♀ + 3♂).
5. Bereken het percentage paring succes voor het eerste contact (P) voor de verschillende combinaties van de slaagkans van paring na het eerste contact, die onmiddellijk en zonder onderbreking plaatsvindt. In het contact op te nemen fase, kan enkele contacten in acht worden genomen voordat de werkelijke copulatie.
   1. Wanneer de afstand tussen twee individuen is dan de lichaamslengte, eens een contact voorbij. Voor één repliceren, opnemen P 100% bij copulatie is waargenomen onmiddellijk na het eerste contact, zonder onderbreking, of 0,00% indien er geen copulatie werd waargenomen of als er copulatie maar na twee of meer contacten.
      LET OP: Er waren 30 herhalingen voor elke hier beschreven combinatie.

Results

De paring succespercentage (R) van maagdelijke volwassenen bedroeg 86,67% gemiddeld, die aanzienlijk hoger is dan die van de willekeurig geselecteerde volwassenen bedroeg: 13,33 ± 4,65% (V = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figuur 2). Deze bevinding suggereert dat het gemakkelijker is om de paring gedrag van B. xylophilus met Virgin volwassenen dan met willekeurig geselecteerde volwassenen nemen.

Discussion

Behavioral tests zijn een fundamenteel aspect van de chemische ecologie, neurobiologie, moleculaire biologie en genetica. Nematoden, met name C. elegans, worden veelvuldig gebruikt voor onderzoek op dit gebied. Het paargedrag van C. elegans is eerder ^10-11 onderzocht. Echter, B. xylophilus gonochoristic en verschillend van de tweeslachtige C. elegans en de paring heeft verschillende gedragskenmerken ^9. Onlangs heeft het paargedrag van Bursaphelenchus okinawae...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolaat Nxy61			Geëxtraheerd uit Pinus massoniana in Ningbo-gebied van China
Grijze schimmelstam			Verkregen van Forestry Academy of China
Baermann trechters	Sengong
falconbuizen	Sengong
centrifuge	Sengong
pipet	Sengong
steriele dd H2O			Gesteriliseerd door hoge druk van stoom bij 121 °C gedurende 30 min.
Petrischalen	Sengong
PDA-medium	Huankai Bio.	021050
incubator	Sengong
laminaire stroom	Sengong
glas capillair	Sengong
stereoscoop	Leica	LED5000 RL
invers stereomicroscoop	Zeiss	A1
concave glijbanen	Sengong