Methodenartikel

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante Clostridium difficile Strain R20291

DOI:

10.3791/54850

⸱

10 december 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile is een anaërobe, gram-positieve, sporenvormende enterische ziekteverwekker die geassocieerd wordt met toenemende morbiditeit en mortaliteit en daarom een dringende bedreiging vormt voor de volksgezondheid. Recidief van een C. difficile infectie (CDI) na succesvolle behandeling met antibiotica is hoog, het komt voor bij 20-30% van de patiënten, wat de ontdekking van nieuwe therapieën tegen deze ziekteverwekker noodzakelijk maakt. Huidige diermodellen van CDI resulteren in hoge sterftecijfers en benaderen dus niet de chronische, insidiose ziektemanifestaties gezien bij mensen met CDI. Om therapieën te evalueren tegen C. difficile, is een muismodel nodig dat de menselijke ziekte benadert met behulp van een klinisch relevante stam. Dit protocol beschrijft het cefoperazone muismodel van CDI met behulp van een klinisch relevante en genetisch benadeerbare stam, R20291. Technieken voor klinisch ziektemonitoring, C. difficile bacterietelling, toxinecytotoxiciteit en histopathologische veranderingen tijdens CDI in een muismodel worden gedetailleerd beschreven in het protocol. In vergelijking met andere muismodellen van CDI is dit model niet uniform dodelijk bij de toegediende dosis, waardoor de observatie van een langdurig klinisch verloop van infectie mogelijk is, in overeenstemming met de menselijke ziekte. Daarom bewijst dit cefoperazone muismodel van CDI een waardevolle experimentele platform om de effecten van nieuwe therapieën op de verbetering van klinische ziekte en op de herstel van kolonisatieresistente tegen C. difficile te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile is een anaërobe, grampositieve, sporenvormende bacil die levensbedreigende diarree 1 veroorzaakt. C. difficile infectie (CDI) is geassocieerd met een verhoogde menselijke morbiditeit en mortaliteit en resulteert in meer dan $ 4800000000 in de kosten van de gezondheidszorg per jaar 1-4. In 2013, de Centers for Disease Control and Prevention gecategoriseerd C. difficile als een dringende antibioticaresistentie risico, wat aangeeft dat het een dringende bedreiging voor de volksgezondheid 1 vormt. Op dit moment, antibiotische behandeling met vancomycine en metronidazol worden beschouwd als de standaard van zorg voor CDI 5. Helaas, herhaling van CDI na een succesvolle behandeling met antibiotica is hoog, optreedt in 20-30% van de patiënten 2,5-7. Daarom is de ontdekking van nieuwe therapieën tegen deze darmpathogeen noodzakelijk. Om therapieën te onderzoeken tegen C. difficile, een diermodel benadert de ziekte bij de mens in aclinically relevante stam nodig is.

Aanvankelijk werden postulaten vastgesteld voor C. difficile in 1977 met een clindamycine behandeld Syrische hamster model 8. Dit model wordt nog steeds gebruikt om de effecten van C. difficile toxinen onderzoeken naar pathogenese 9,10. Echter, CDI in het hamstermodel resulteert in hoge sterfte en niet nader chronische sluipende ziektemanifestaties die kunnen worden gezien bij mensen met CDI 10,11. Gebaseerd op de toegankelijkheid en reagens beschikbaarheid van murine platforms in onderzoek, een muismodel van CDI relevant.

In 2008, een robuust muismodel van CDI werd opgericht door de behandeling van muizen met een antibioticum cocktail in drinkwater (kanamycine, gentamicine, colistine, metronidazol en vancomycine) gedurende 3 dagen, gevolgd door een intraperitoneale injectie van clindamycine 12. Dit teruggegeven muizen gevoelig voor CDI en ernstige colitis. afhangening op de entstof dosis toegediend, kan een reeks klinische symptomen en sterfte worden geobserveerd met behulp van dit model. Sindsdien zijn diverse antibiotische regimes onderzocht dat de murine darmflora verandert, aflopend kolonisatieweerstand tot het punt waar C. difficile het maagdarmkanaal kan koloniseren (beschreven door Best et al. En Lawley & Young) 13,14.

Meer recent is een breed spectrum cefalosporine, cefoperazon, gezien in het drinkwater gedurende 5 of 10 dagen maakt reproduceerbaar muizen gevoelig voor CDI 15. Aangezien toediening van de derde generatie cefalosporinen geassocieerd met een verhoogd risico van CDI bij mensen gebruik van de cefoperazon model beter weergeeft nature voorkomende ziekte 16. -Cefoperazone behandelde muizen gevoelig voor C. difficile werden uitgedaagd met zowel C. difficile sporen en vegetatieve cellen van verschillende stammen variërend in klinischerelevantie en virulentie 17. Ondanks dat een aantal van de oorspronkelijke studies gebruik te maken van C. difficile vegetatieve cellen als de besmettelijke vorm, C. difficile sporen beschouwd als de belangrijkste wijze van overdracht 18.

In het laatste decennium, C. difficile R20291, een NAP1 / BI / 027 stam, is ontstaan, waardoor epidemieën van CDI 19,20. Wij hebben geprobeerd om het klinisch beloop van de ziekte te bepalen wanneer-cefoperazon behandelde muizen werden uitgedaagd met de klinisch relevante en genetisch handelbaar C. difficile stam, R20291. Dit protocol geeft de klinisch verloop, zoals gewichtsverlies, bacteriële kolonisatie, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in het maagdarmkanaal van muizen geprikkeld met C. difficile R20291 sporen. Kortom, dit muismodel blijkt een waardevolle experimenteel platform voor CDI benaderen van ziekten bij de mens zijn. Dit kenmerk muismodel kan dus worden gebruikt om de effecten te evaluerenvan nieuwe therapieën voor de verbetering van de klinische ziekte en het herstel van kolonisatieweerstand tegen C. difficile.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische verklaring:
De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) goedgekeurd deze studie. De NCSU Animal Care en gebruik beleid geldt normen en richtlijnen uiteengezet in de Animal Welfare Act en Health Research Extension Act van 1985. proefdierfaciliteiten bij NCSU voldoen aan richtlijnen uiteengezet in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De dieren 'gezondheidsstatus werden dagelijks geëvalueerd en stervende dieren werden op humane wijze gedood door CO 2 stikken, gevolgd door secundaire maatregelen. Opgeleide technici dier of een dierenarts uitgevoerd veehouderij in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit tijdens deze studie.

1. Beheer van het antibioticum Cefoperazone in drinkwater aan Gevoeligheid bereiken C. difficile kolonisatie en Ziektepreventie

OPMERKINGEN: 5- tot 8 weken oude C57BL / 6 WT-muizen (vrouwtjes en mannetjes)werden gekocht en in quarantaine geplaatst gedurende 1 week vóór het begin van het antibioticum water administratie. Na quarantaine werden de muizen ondergebracht bij geautoclaveerd voedsel, beddengoed en water. Cage veranderingen werden uitgevoerd wekelijks door laboratorium personeel in een laminaire stroming kap.

  1. Bereid cefoperazon (0,5 mg / ml) in steriel gedestilleerd water 7 dagen voor de dag van gerichte challenge (figuur 1).
  2. Vul geautoclaveerd water flessen met cefoperazon water (0,5 mg / ml) en plaats ze in elke muis kooi.
    LET OP: Vers bereide cefoperazon water moet worden gemaakt en veranderde uit elke 2 dagen gedurende een periode van 5 dagen, zoals aangegeven in de stappen 1.1 en 1.2. Een goede afvoer van water cefoperazon volgende institutionele milieu en gezondheid en veiligheid richtlijnen wordt aanbevolen.
  3. Na 5 dagen op cefoperazon water, de plaats van de flessen met geautoclaveerd water flessen gevuld met steriel gedestilleerd water. Geef muizen moet drinkwater voor de duur van het experiment.

2. Voorbereiding van de C. difficile Spore Inoculum en de orale sondevoeding van de Muizen

LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items in de anaërobe kamer worden geplaatst voor ten minste 24 uur: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, zie Materials), taurocholaat cycloserine cefoxitine fructose agar (TCCFA) platen (zie Materialen en de aanvullende bestand ) en een steriele L-vormige spreader.

LET OP: De muizen uitgedaagd met C. difficile sporen moeten worden ondergebracht in een Biosafety Level 2 dier faciliteit.

  1. Verkrijgen van een C. difficile spore stock van de gewenste rek (in casu R20291) dat eerder was bereid en bewaard bij 4 ° C in steriel water 21,22. Bepaal de opsomming van de spore voorraad vóór gebruik.
  2. Gebaseerd op de bekende concentratie (sporen / ml) van de spore beelden, berekent de gewenste verdunning tot 10 5 sporen verkrijgen per 25 ul. Verzekeren het inoculum volume voldoende om alle entenmuizen in het experiment (25 pi per muis), de opsomming van het inoculum (ongeveer 30 ui) uitvoeren, en die rekening pipetteerfout.
  3. Vortex de originele C. difficile spore voorraad. Dan, resuspendeer de berekende volume (uit stap 2.2) van de oorspronkelijke C. difficile spore voorraad in steriel water binnen een schroef bedekte microcentrifugebuis. Voer deze aëroob in een laminaire stroming kap. Identificeer deze verdunde mengsel als de "spore inoculum."
  4. Plaats de spore entstof in een 65 ° C waterbad en verwarm het voor 20 min.
    LET OP: Deze stap zal ervoor zorgen dat alleen actief C. difficile sporen achterblijven na de warmtebehandeling.
  5. Binnen de laminaire stroming kap, nemen 50 pl van verhitte spore entstof, plaats het in een steriele microcentrifugebuis, en geef het in de anaerobe kamer 23. Gebruik dit monster voor spore opsomming.
  6. Binnen de laminaire stroming kap, laadt de resterende verwarmde spore entstof intoa 1-ml spuit bevestigd aan een steriele-lamp getipt maag maagsonde naald. Maken gebruik van een handmatige injectiespuit stepper om ervoor te zorgen accurate en snelle herhaling doseren tussen muizen. Controleer of de sondenaald gevuld met de verwarmde spore inoculum voor gebruik.
    OPMERKING: Een nieuwe steriele sondenaald voor elke muis is niet vereist. Indien verscheidene doses C. difficile sporen worden toegediend, een nieuwe maagsonde naald wordt aanbevolen voor elke dosis.
    OPMERKING: C. difficile sporen zijn zeer resistent tegen traditionele ontsmettingsmiddelen. Daarom is het gebruik van een sporicidal desinfectiemiddel, zoals # 62 Perisept Sporicide ontsmettingsmiddel, noodzakelijk. De fabrikant adviseert een 2-min contacttijd van C. difficile sporen te vernietigen.
  7. Gavage elke muis met 25 ul van de spore inoculum. Beperken elke muis voorzichtig door grijpen het dier door de losse huid van de nek en rug teneinde het hoofd te immobiliseren. Met de wijsvinger verdere immobiliseren hoofd van het dier enlangwerpige de slokdarm. Zorg ervoor dat het dier niet hardop of vertonen andere tekenen van nood tijdens de terughoudendheid.
    Opmerking: Het totale volume aan muizen door gavage niet meer dan 10 ml / kg lichaamsgewicht (0,1 ml / 10 g).
  8. Handhaving van de muis in een rechtopstaande, verticale positie en voorzichtig langs de maagsonde naald in de zijkant van de mond. Richt de maagsonde naald langs het dak van de mond en langzaam vooruit de maagsonde naald in de slokdarm.
    LET OP: Als er weerstand wordt ondervonden, de maagsonde naald kan het aangaan van de luchtpijp en dus moeten niet worden gevorderd, maar eerder verwijderd en onmiddellijk verplaatst.
  9. Na de sondenaald ongeveer halverwege de slokdarm Injecteer 25 pi van de verwarmde spore inoculum en zachtjes trekken de maagsonde naald uit de slokdarm.
    OPMERKING: Krachtig bevorderen van de maagsonde naald kan leiden tot het scheuren van de slokdarm of maag. Daarom, als weerstand wordt ondervonden bij het bevorderen van de maagsonde naald, Is het het beste om onmiddellijk te verwijderen en de positie van de maagsonde naald.
  10. Breng het dier naar zijn kooi en acht het voor elke hoesten of tekenen van ademnood, omdat dit onbedoelde tracheale toediening of aspiratie van de verwarmde spore entstof kunnen wijzen.
    OPMERKING: Muizen zijn zeer gevoelig voor C. difficile na antibiotische behandeling; daarom voorzorgsmaatregelen om kruisbesmetting te voorkomen tussen de kooien is essentieel. Dit is vooral belangrijk bij het beheren antibiotica behandelde maar onbetwiste muizen als controles.
  11. Na het inenten van alle muizen, plaatst u de resterende verwarmde spore entstof in een steriele microcentrifugebuis en doorgeven in de anaerobe kamer voor spore opsomming.
  12. Voor telling van de verwarmde spore inoculum (uit stap 2.4) en de resterende gavaged verwarmd spore inoculum maken 01:10 seriële verdunningen van elk inoculum in 1x PBS. Het wordt aanbevolen om de plaat en 4-5 verdunningen (bijvoorbeeld 10 tot -110 -5).
  13. Met behulp van aseptische techniek, overdracht 100 pi van elke seriële verdunning op een individuele TCCFA plaat.
  14. Met behulp van een steriele L-vormige spreader, gelijkmatig verspreid de op het medium over de plaat verdund. Gelijkmatige verspreiding van het verdunde inoculum is essentieel voor een nauwkeurige telling van sporen.
  15. Incubeer de platen anaëroob gedurende 24 uur bij 37 ° C. Na 24 uur, kan C. difficile-kolonievormende eenheden (CFU's) worden genoemd als het infectieuze dosis toegediend aan muizen in de 25 pl (0,025 ml) volume (zie aanvullend bestand "Voorbeeld Berekeningen") te verkrijgen. C. difficile kolonies zijn plat en lichtgeel en hebben onregelmatige randen en een geslepen glas uiterlijk 24.
    NB: De detectiegrens voor bacteriële opsomming 10 2 CFU.

3. Toezicht Mouse Weight Loss en klinische symptomen van de ziekte in heel C. difficile infectie

  1. Weeg eennimals vóór en na 5 dagen cefoperazon antibiotische behandeling, na 2 dagen herstel off antibiotica (dag 0) en vervolgens gedurende de duur van het experiment.
    OPMERKING: Zorg gewichten op een consistente tijd elke dag. Gewichten verkregen de dag uitdaging (dag 0) worden gebruikt als de initiële basislijn gewicht voor vergelijking hele C. difficile infectie.
  2. Plaats een digitale weegschaal in een bioveiligheid kast. Plaats een steriele plastic beker op de weegschaal en tarra gewicht van de kunststof beker. Dan voorzichtig pak de muis door de basis van de staart en plaats deze in de plastic beker.
    1. Plaats de beker terug op de schaal. Zweven hand over de bovenkant van de beker dat de muis niet ontsnapt. 3 sec om een ​​stabiel gewicht te krijgen - het kan 2 duren. Vervolgens plaats voorzichtig de muis terug in de kooi. Noteer dit gewicht en herhaal het proces voor elke muis in die kooi.
      LET OP: Het is noodzakelijk dat maatregelen worden genomen om cross-verontreinigingen te voorkomentie tussen de kooien bij het verkrijgen van gewichten. Elke kooi van muizen moet haar eigen plastic beker voor het wegen te hebben. De plastic bekers moeten worden ontsmet met een sporicide middel tussen elk gebruik en bedekt met steriele aluminiumfolie.
  3. Bewaak de gewraakte dieren tweemaal daags (minimaal) op tekenen van klinisch ernstige C. difficile infectie, met inbegrip van lethargie, verlies van eetlust, diarree, en gebogen houding.
  4. Humaan euthanaseren dieren die 20% van hun aanvankelijke basislijn lichaamsgewicht verliezen en / of ontwikkelen ernstige klinische symptomen van C. difficile infectie (in stap 3,3 opgesomd).
    OPMERKING: Muizen die klinische symptomen van C. difficile infectie duiden dient te worden afgewogen indien nodig tijdens het experiment te verzekeren dat zij niet verloren 20% van hun aanvankelijke basislijn lichaamsgewicht. Tijdens de vroege tijdstippen in het experiment, zou dit betekenen tweemaal daags metingen.

4. Bacteriële opsomming van C. difficilevan Mouse Uitwerpselen en cecal Content

LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items in de anaerobe kamer worden geplaatst voor ten minste 24 uur: 1x PBS (zie Materials), TCCFA platen (zie Materials), een steriele L-vormige spreader en steriele microcentrifugebuizen en / of PCR platen voor verdunningen.

  1. Het verkrijgen van monsters voor C. difficile opsomming
    NB: Voorafgaand aan het verkrijgen van feces of blindedarm inhoud, wegen steriele microcentrifugebuizen op een analytische schaal. Neem de buis gewicht op de zijkant van de buis, afgerond op vier decimalen (bijvoorbeeld 0,9864 g). Duiden dit gewicht als de "tube gewicht." Elk verzameld monster moet in een steriele, gewogen microcentrifugebuis geplaatst.
    1. Steriele collectie van de muis uitwerpselen
      1. Voorzichtig beperken elke muis door grijpen het dier door de losse huid van de nek en rug teneinde het hoofd te immobiliseren. Gebruik de pink om voorzichtig te beperken de staart van het dier, thus blootstellen van de anus. Zorg ervoor dat het dier niet hardop of vertonen andere tekenen van nood tijdens de terughoudendheid.
      2. Houd een steriele, gewogen microcentrifugebuis direct onder de anus van het dier. Het is noodzakelijk dat de buis niet in direct contact met de muis komt.
        1. Als het dier ontlasting, het verzamelen van de fecale pellet in de buis. Houd de buis bij kamertemperatuur totdat alle fecale monsters verzameld. Het kan enkele minuten duren voordat een muis om te poepen, dus noodzakelijk herhaal pogingen om uitwerpselen te verzamelen.
      3. Weeg de buisjes met uitwerpselen op de analytische schaal. Noteer de buis gewicht, afronden tot op vier decimalen (bijvoorbeeld 1,0021 g). Duiden de verkregen gewicht als de "laatste tube gewicht."
      4. Passeer de fecal samples in de anaerobe kamer voor bacteriële telling direct na de ontlasting collectie.
    2. Steriele verzameling muizen blindedarm inhoud ten tijde van de necropsie
      1. Na humane euthanasie door CO 2 stikken, gevolgd door secundaire maatregelen, het uitvoeren van een autopsie om de blindedarm 25 te verkrijgen. De blindedarm is de grote, komma-vormig deel van het maagdarmkanaal.
      2. Plaats de blindedarm naar een steriele plastic petrischaal. Gebruik een disposable, steriel nee. 10 scalpel aan de blindedarm opengesneden uit de blinde einde van het zakje aan de blindedarm inhoud bloot te leggen.
        1. Voorzichtig pak de blindedarm inhoud door het toepassen van lichte druk met de scalpel en het vegen van de inhoud naar het ingesneden deel van de blindedarm.
          OPMERKING: Men dient de blindedarm weefsel, dat voor histopathologisch onderzoek wordt voorgelegd niet verstoren.
      3. Plaats de blindedarm inhoud in een steriele, woog microcentrifugebuis onmiddellijk na collectie. Slechts ongeveer 10 mg blindedarm inhoud vereist voor bacteriële telling.
      4. Weeg de buisjes met blindedarm inhoud op de analytische scale. Noteer de buis gewicht, afronden tot op vier decimalen (bijvoorbeeld 1,0021 g). Duiden de verkregen gewicht als de "laatste tube gewicht."
      5. Passeer de blindedarm inhoud samples in de anaerobe kamer voor bacteriële opsomming.
  2. Bacteriële opsomming van C. difficile
    1. Bereken het eindgewicht van de inhoud (faeces of blindedarm) die worden opgesomd voor C. difficile. Voerde dit door het aftrekken van de "laatste tube gewicht" van de "tube gewicht."
    2. Bereken een 1:10 verdunning van de inhoud in 1X PBS en dienovereenkomstig te resuspenderen. Voor fecale pellets, gebruikt u de punt van de pipet om voorzichtig te verstoren de pellet in de oplossing (zie de aanvullende bestand "Voorbeeld Berekeningen").
    3. Anaëroob geïncubeerd deze geresuspendeerd monsters bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, waarvan de inhoud bezinken.
    4. Maak seriële verdunningen voor elk monster in 1x PBS voor enumking van de CFU per g inhoud (feces of blindedarm). Voer deze anaëroob.
    5. Met behulp van aseptische techniek, overdracht 100 ul van elke seriële verdunning tot TCCFA platen. Met behulp van een steriele L-vormige spreader, verspreid het op de media verdunning gelijkmatig verspreiden over de plaat. Gelijkmatige verspreiding van de verdunning is essentieel voor een nauwkeurige telling van de kolonies.
    6. Incubeer de platen anaëroob gedurende 24 uur bij 37 ° C. Momenteel sommen C. difficile kolonies op de CFU per g inhoud (faeces of blindedarm) te verkrijgen. C. difficile kolonies zijn plat en lichtgeel en hebben onregelmatige randen en een geslepen glas uiterlijk 24.
      Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt voor C. difficile opsommen van andere murine GI inhoud, waaronder ileum en colon inhoud. PCR platen kunnen worden gebruikt voor het maken van seriële verdunningen.

5. Vero cel cytotoxiciteit Assay te kwantificeren C. difficile Toxine Cytotoxistad

OPMERKING: Aanbevolen wordt deze test worden uitgevoerd na afloop van het muismodel monsters bij autopsie verzameld en bewaard bij -80 ° C. Aseptische celcultuur zijn essentieel voor het voorkomen van besmetting van Vero-cellen in deze assay. Dit protocol duurt 2 dagen uit te voeren. Alle uitwerpselen en intestinale inhoud gebruikt in deze test moet worden opgeslagen in een gewogen, steriele microcentrifugebuis (aangeduid met de "tube gewicht," zie sectie hierboven). De uiteindelijke buis gewicht (inclusief de inhoud) wordt gemeten via een analytische schaal naar de dichtstbijzijnde vier cijfers na de komma (zie bovenstaande paragraaf). Gebruik van een multi-channel pipet wordt aanbevolen voor deze test.

LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items zijn beschikbaar: Vero Cells, wijziging Dulbecco's van Eagle medium (DMEM) 1x met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine media (aangeduid als "DMEM 1x media; "zie Materialen en de aanvullende-bestand), 0,25%Trypsine-EDTA, 1 x PBS, 0,4% trypan blauw, een 96-well celcultuur platte bodemplaat, een 96-well filterplaat, Clostridium difficile toxine A (aliquot in 3 pl van 1 ug / ul in ultrazuiver water en Bewaren bij -80 ° C), Clostridium difficile Antitoxin, een werkblad (voor berekeningen en plaat kaarten, zie aanvullende bestanden).

LET OP: Voorzichtigheid moet worden genomen tijdens deze test voor het personeel blootstelling aan C. difficile en zijn toxine.

  1. Het splitsen van de Vero-cellen (dag 1)
    1. Verwarm de DMEM 1x media, 0,25% trypsine-EDTA en 1x PBS in een 37 ° C waterbad.
    2. Het verkrijgen van een kolf van Vero-cellen uit de celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) en plaats deze in de steriele celkweek laminaire stroming kap. Gebruik 70% ethanol vegen van de kap en apparatuur voor gebruik. Met behulp van een serologische pipet, zuigen de media uit de weefselkweek kolf om hem van de Vero-cellen te verwijderen en gooi het in een verspilling container.
    3. Spoel de Vero cellen met 5 ml 1x PBS (voorverwarmd) in weefselkweek kolf. Zuig het PBS en gooi het in een afvalbak.
    4. Voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA op de weefselkweek kolf. Laat een contacttijd van 2-3 min. Gedurende deze tijd, moeten de cellen beginnen te komen uit de kolf oppervlak. Schud de weefselkweek kolf links naar rechts om de Vero-cellen los te maken.
    5. Na contact tijd met trypsine-EDTA, direct 5 ml DMEM 1x media toe te voegen in de weefselkweek kolf. Hierdoor wordt de trypsine-EDTA neutraliseren. Gebruik deze oplossing voor een losse Vero-cellen voorzichtig te wassen van de achterkant van de kolf. Gebruik vervolgens een serologische pipet aan dit mengsel over in een 15-ml conische buis.
    6. Centrifugeer de Vero-cellen in de conische buis gedurende 5 minuten bij 180 xg en 25 ° C. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd. Na centrifugeren observeren zichtbare pellet van Vero-cellen op de bodem van de conische buis. Zorg ervoor dat u DISRupt deze pellet. Aspireren uit de bovenstaande vloeistof uit de conische buis en gooi deze weg.
    7. Resuspendeer de Vero-cellen in 3 ml DMEM 1x media.
  2. Het tellen van de Vero-cellen
    1. Voeg 100 ul van de celsuspensie Vero (gemaakt in stap 5.1.7) aan 100 ui 0,4% trypan blauw. Meng door pipetteren de oplossing op en neer.
    2. Voeg 10 ul van dit mengsel aan elke kamer van een hemocytometer.
    3. Tel het aantal levensvatbare cellen in de vier kwadranten van de hemocytometer. Dode Vero cellen zullen nemen van de trypan Blue en dus zullen worden gekleurd blauw (deze cellen mag niet worden meegeteld). Noteer deze nummers in de "Vero Cell werkblad," voorzien.
    4. Som het totale aantal levensvatbare Vero-cellen in alle vier kwadranten en bereken het gemiddelde. Vermenigvuldigen van de verdunningsfactor die sinds 2 100 gl cellen in een totaal van 200 pl vloeistof.
    5. Vermenigvuldigen met de correctiefactor om de te geven ", het aantal cellen / ml "Bij gebruik van een hemocytometer, de correctiefactor altijd 10 4 Vermenigvuldig het totale volume aan de geven. 'totaal aantal cellen"..
  3. Het bepalen van het aantal putten voor elke Experiment
    LET OP: Een enkel monster (ofwel feces of darminhoud) vergt 24 afzonderlijke bronnen moeten worden uitgevoerd in tweevoud. Een concentratie van 10 5 Vero cellen per putje (totaal volume van 90 gl) vereist.
    OPMERKING: Indien men wenst de Vero cellen 96 putjes incubeer overnacht bij 37 ° C, een concentratie van 10 3 Vero cellen per well aanbevolen overeenkomt met het verlengde incubatietijd. Berekeningen in de Vero Cell werkblad zou moeten worden aangepast om rekening te houden met deze verandering.
    1. Bepaal het aantal putten die gebruikt kunnen worden gebaseerd op de hoeveelheid Vero cellen aanwezig (in stap 5,2, gebruiken de Vero cel werkblad, voorzien).
    2. Bepaal de hoeveelheidVero celsuspensie nodig om het gewenste aantal putten te vullen (gebaseerd op het aantal monsters getest). Zorg ervoor dat eventuele extra volume wordt toegevoegd om rekening te houden voor het pipetteren fout (gebruik de meegeleverde Vero Cell-werkblad).
    3. Verdun de suspensie Vero cellen (verkregen in stap 5.1.7) in DMEM 1x media om het gebruikte volume van het experiment te verkrijgen.
  4. Zaaien Vero cellen in een 96 putjes celkweekplaat
    1. Met de Vero cel resuspensie uit stap 5.3.2, gebruikt een multi-channel pipet 90 ul van de Vero celsuspensie aan elke well van een 96-well celcultuur platte bodemplaat.
    2. Incubeer de plaat met de Vero-cellen in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 4 uur voor het toevoegen van toxine (monsters) aan de putjes. Deze incubatietijd zal de Vero cellen hechten aan de bodem van elk putje.
  5. Het creëren Stock oplossingen van de monsters (faeces ofIntestinal Content)
    LET OP: Alle monsters moeten de "tube gewicht 'en' final tube gewicht" gemeten via een analytische schaal te hebben. Gebruik Vero Cell werkblad voor berekeningen.
    1. Bereken het gewicht van de inhoud. Converteren g tot mg, vervolgens mg tot ul. Bereken het uiteindelijke totale aantal pi-oplossing nodig is om een ​​1:10 verdunning in 1x PBS te maken. Bereken de totale hoeveelheid 1x PBS toe te voegen aan het monster.
    2. Voeg de totale 1x PBS (hierboven berekend) aan het monster. Voer deze aëroob, en het gebruik van aseptische techniek. Fecale pellets, met de punt van de pipet zachtjes verstoren de pellet in de oplossing.
    3. Vortex de monsters en centrifugeer ze op 3522 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren en resuspendeer de sample in de oplossing.
      OPMERKING: Tijdens stap 5.5.3, al was het maar een paar voorbeelden worden verwerkt, de inhoud kan worden gesteriliseerd doorpasseren ze door een 0,22 urn filter in plaats van een 96-well filterplaat. Sommige monsters kunnen meerdere filters verplicht de gehele volumegehalte met deze techniek steriliseren.
    4. Steriliseer het monster / PBS mengsel door middel van 150 pi supernatant en te plaatsen in afzonderlijke putjes op 96-well filterplaat. Plaats de filterschijf stevig op een 96-well celcultuur vlakke bodem aangebracht, zodat de inhoud ervan filter in deze plaat.
    5. Centrifugeer de filter plaat / celcultuur plaat stack bij 431 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd is en dat de filter plaat / celcultuur plaat stapel strak uitgelijnd en zal niet verschuiven tijdens het centrifugeren.
      LET OP: Deze gefilterd inhoud zijn de 10 -1 voorraad die zullen worden gebruikt in de verdunning platen.
    6. Plaats de plaat met gefilterde monsters op ijs.
  6. Het creëren van Verwatering Plate # 1
    LET OP: Verwatering Plate # 1 (DP # 1) zal 6 wells per monster, met inbegrip van positieve (C. difficile toxine A) en negatieve (1x PBS) controles (zie de DP # 1 lay-out op de Vero Cell-werkblad) vereisen.
    1. De positieve controle (C. difficile toxine A) voor deze test te bereiden, te vinden 3-ul aliquots (1 ug / ul) van -80 ° C en voeg 297 ul ultrazuiver water, waarbij een uiteindelijke concentratie van 0,01 pg / pl. Leg ze op ijs.
    2. Label de wells met hun verdunningen (10 -1 10 tot -6) voor elk monster en geven de positieve en negatieve controles (zie DP # 1 layout).
    3. Voeg geschikte hoeveelheden 1x PBS aan elk putje. In de 10 -1 putjes, voeg NO PBS. Voor de 10 -2 tot -6 10 putjes, voeg 90 pl 1x PBS.
    4. Voeg geschikte hoeveelheden van de monsters aan elk putje. In de 10 -1 putten, voeg 100 ul van de 10 -1 voorraad voor elk monster (zie stap 5.5.7 uit het filter plate). Voor de 10 -2 tot -6 10 putjes, maken seriële verdunningen; beginnen door 10 pl van de 10 -1 goed en toe te voegen aan de 10 -2 goed. Ga door met de seriële verdunningen naar de 10 -6 verdunning.
    5. Bedek de DP # 1 plaat met een doorzichtige plastic kleefband en plaats het op ijs.
  7. Het creëren van Verwatering Plate # 2
    LET OP: Verwatering Plate (DP # 2) zal vereisen 2 rijstroken van 6 putjes voor elk monster, met inbegrip van positieve en negatieve controles (zie de DP # 2 lay-out op de Vero Cell-werkblad).
    1. Label de wells met hun verdunningen (10 -1 10 tot -6) voor elk monster en geven de positieve en negatieve controles (zie DP # 2 layout). Label de putjes met het monster naam (aangeduid als "monsterputjes") of monsteromschrijving met antitoxine (aangeduid als "antitoxine putjes").
    2. Bereken de hoeveelheid antitoxine vereist voor deze assay. NB: Het tegengif is een 25x voorraadoplossing die moet worden verdund 1:25 in 1 x PBS. Plaats de voorbereide tegengif 1x oplossing op het ijs.
    3. Voor "monsterputjes," voeg 20 pl 1x PBS aan elk putje voor alle verdunningen (10 -1 tot 10 -6) in dit monster. Voor "antitoxine putten," voeg 20 pl 1x Antitoxin aan elk putje voor alle verdunningen (10 -1 tot 10 6) in dit monster.
    4. Overdracht 20 pi van het verdunde monster in putjes van DP # 1 in de aangegeven putjes op DP # 2 rijen 1-6 en rijen 7-12 (zie de DP # 2 lay-out op de Vero Cell-werkblad). Meng de oplossing voorzichtig door en neer te pipetteren.
    5. Bedek DP # 2 met een doorzichtige plastic kleefband en laat 40 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Deze incubatie is om de antitoxine te binden en daardoor inactiveren en neutraliseren van de C. difficile toxine.
    6. Na de incubatie, voeg 10 ul van het mengsel van DP # 2 aan de juiste putjes Vero cel (zie Vero cel plaatindeling de Vero Cell-werkblad). Voorzichtig de oplossing en neer te pipetteren, en zorg dat niet verstoren Vero cellen die zijn gehecht aan het onderoppervlak van de putjes te mengen.
    7. Incubeer de Vero cel plaat 's nachts in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
  8. Beoordelen van Vero-cellen voor het afronden van het gebruik van een lichtmicroscoop (dag 2)
    NB: Bedenk dat de verdunningsfactor veranderingen met een factor 10 bij het toevoegen van het monster mengsels naar de Vero cel plaat (bijvoorbeeld 10 -3 is nu 10 -4). Wells dat antitoxin moment hebben moeten hebben weinig tot geen Vero cel afronding opgemerkt. Vero cel afronding (cytotoxiciteit) zal worden opgemerkt in monsters die C. difficile toxine bevatten. Als de cytotoxische activiteit wordt geneutraliseerd in concentraties die het monster en de antitoxine, is de aanwezigheid van C. difficile toxine resulteert in Vero cel cytotoxiciteit bevestigd.
    1. Onderzoek voor Vero cel afronding met behulp van een light microscoop bij 200X vergroting. Voor monsterputjes (met inbegrip van de positieve controle), registreren de verdunning van de put die de laatste 80% Vero celronding hebben opgemerkt.
    2. Bereken de cytotoxische titer, die wordt gedefinieerd als de reciproke van de hoogste verdunning die 80% Vero celronding per gram monster geproduceerd. Bijvoorbeeld, als de hoogste verdunning 10 -5, dan zou de verdunningsfactor 10 -6 voor dit monster. Zo is de log [uiteindelijke verdunning factor] / g van het monster zou worden log [10 6], die een wederzijdse titer van 6 oplevert.
      OPMERKING: - 4 passages en niet meer dan 30 passages vóór het gebruik bij deze proef 26 Vero cellen moeten minstens 3 hebben ondergaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedurende een representatieve studie werden 5 weken oude C57BL / 6-muizen voorbehandeld met WT cefoperazon in hun drinkwater (0,5 mg / ml) gedurende 5 dagen en men liet 2 dagen spoelen regelmatig drinkwater. Muizen werden geprikkeld met 10 5 sporen van C. difficile R20291 via orale sondevoeding op dag 0 (Figuur 1A). De muizen werden gevolgd voor gewichtsverlies en klinische symptomen (lusteloosheid, gebrek aan eetlust, diarree en gebogen houding) van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol karakteriseert het klinische beloop, inclusief gewichtsverlies, bacteriële kolonisatie, toxinecytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in het maag-darmkanaal, van antibiotica-behandelde muizen die worden uitgedaagd met C. difficile R20291 sporen. Er zijn verschillende kritische stappen binnen het protocol waarbij aandacht voor detail essentieel is. Nauwkeurige berekening van het C. difficile spore-inoculum is cruciaal. Deze berekening is gebaseerd op de originele C. difficile<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben op dit moment niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Trevor Lawley van het Wellcome Trust Sanger Institute bedanken voor C. difficile R20291 sporen en James S. Guy van de North Carolina State University College of Veterinary Medicine voor Vero cellen, beide gebruikt in dit manuscript. Dierlijke histopathologie werd uitgevoerd in de LCCC Animal Histopathology Core Facility aan de University of North Carolina at Chapel Hill, met speciale hulp van Traci Raley en Amanda Brown. De LCCC Animal Histopathology Core wordt gedeeltelijk ondersteund door een NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) aan het UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We willen ook Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie en Cassie Schumacher bedanken voor nuttige discussies over het protocol voor de Vero-celcytotoxiciteitstest. JAW wordt gefinancierd door de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training Grant T32OD011130 van NIH. CMT wordt gefinancierd door de career development award in metabolomics grant K01GM109236 van de NIGMS van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner SSS Navigator48027Dit product dient te worden verdund zoals aanbevolen door de fabrikant
0.22 μm filterFisherbrand09-720-3Alternatief voor filterplaat voor individuele monsters getest in de Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056Moet worden verwarmd in een waterbad op 37 °C voor gebruik
0.4% Trypan BlueGibco15250-061
1% Peniciilin/StreptomycinGibco15070-063
10% verwarmde inactieve FBSGibco16140-071Moet worden verwarmd in een waterbad op 37 °C voor gebruik
1 ml plastic spuit BD Medical Supplies309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml Micro Centrifuge SchroefkapCorning430917
96 well celkweek plaat met platte bodemCostar CorningCL3595
96 well filterplaatMilliporeMSGVS2210
Zelfklevende verzegelingThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Bacto Proteose PeptonBecton Dickinson211684Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Clostridium difficile Antitoxine KitTech LabsT5000Gebruikt als controle voor Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin AList Biological Labs152CPositieve controle voor Vero Cell Assay
D-cycloserineSigmaC6880Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Gedestilleerde WaterGibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-092Moet worden verwarmd in een waterbad op 37 °C voor gebruik
FructoseFisherL95500Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
HemocytometersBright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
MgSO4 (watervrij)SigmaM2643Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Millex-GS 0.22 μm filterMillex-GSSLGS033SSFilter voor TCCFA platen 
Na2HPO4SigmaS-0876Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
NaClFisherS640-3Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Nr. 10 wegwerp scalpelbladMiltex, Inc4-410
PCR PlatesFisherbrand14230244
Kunststof petrischaalKord-Valmark Brand2900
Steriele kunststof L-vormige celverspreiderFisherbrand14-665-230
Spuit StepperDymax CorporationT15469
TaurocholateSigmaT4009Onderdeel van TCCFA platen (zie hieronder)
Ultrapuur gedestilleerd waterInvitrogen10977-015
C57BL/6J MuizenThe Jackson Laboratory664Muizen moeten 5 - 8 weken oud zijn
Olympus BX43F lichtmicroscoopOlympus Life Science
DP27 cameraOlympus Life Science
cellSens Dimension software Olympus Life Science

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787(2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114(2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045(2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102(2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cefoperazone Mouse ModelClostridium difficile InfectionBacterial EnumerationToxin CytotoxicityHistopathologic ChangesFecal Sample CollectionSpore Inoculum PreparationAnaerobic Chamber UseClinical Disease MonitoringColony Forming Units

Gerelateerde artikelen