Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Samenvatting

Genexpressie heterogeniteit is een interessante functie om te onderzoeken in lymfoïde populaties. Genexpressie in deze cellen varieert gedurende celactivering, stress of stimulatie. Eencellige multiplex genexpressie gelijktijdige beoordeling van tientallen genen ^{1, 2, 3.} Bij de single-cell niveau, multiplex genexpressie bepaalt bevolking heterogeniteit ^{4, 5.} Het maakt het onderscheid van de bevolking door heterogeniteit om zowel de waarschijnlijke precursor mengsel van verschillende stadia bij rijpe cellen en ook de diversiteit van cel responsen op stimuli.

Aangeboren lymfoïde cellen (ILC) zijn recent beschreven als een populatie van aangeboren effectoren van het immuunrespons ^{6, 7.} In dit protocol, cel heterogeniteit van de ILC hijpatic compartiment is onderzocht tijdens homeostase.

Momenteel is de meest gebruikte techniek om genexpressie te beoordelen is RT-qPCR. Deze methode maatregelen genexpressie slechts één gen per keer. Bovendien kan deze methode niet inschatten heterogeniteit van genexpressie, aangezien meerdere cellen zijn nodig voor één test. Dit leidt tot de meting van de gemiddelde genexpressie van de bevolking. Bij de beoordeling van een groot aantal genen, RT-qPCR wordt een tijd-, reagens- en-sample in beslag methode. Vandaar dat de trade-offs beperking van het aantal genen of celpopulaties die kunnen worden geëvalueerd, waardoor het risico van het missen van de globale beeld.

Dit manuscript beschrijft hoe ééncellige multiplex RT-qPCR kan worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen. Deze techniek heeft geprofiteerd van de recente technologische vooruitgang microfluidics ^{1, 2.} Reacties die zich in multiplex RT-qPCR chips niet exceed de nanoliter-niveau. Derhalve eencellige genexpressie, en gelijktijdige meervoudige genexpressie, kan worden uitgevoerd in een reagens-, bemonster- en kosteneffectieve manier. Het is mogelijk om cellen genen profiel heterogeniteit testen op klonale niveau tussen celsubsets binnen een populatie in verschillende ontwikkelingsstadia of onder verschillende omstandigheden ^{4, 5.} Aan zeldzame populaties met een groot aantal omstandigheden op de single-cell niveau niet langer een beperking.

Inleiding

In de afgelopen jaren, aangeboren lymfoïde cellen (ILC) in toenemende mate onderzocht. Ondanks het ontbreken van antigeen-specifieke receptoren, zij behoren tot de lymfoïde afstamming en vormen belangrijke wachters voor weefsel homeostase en ontsteking. ILC's worden momenteel onderverdeeld in drie groepen op basis van hun expressie van specifieke transcriptiefactor en combinaties van hun vermogen om cytokinen ^{6, 7} produceren.

ILC tot talrijke homeostatische en pathofysiologische situaties in diverse organen via specifieke cytokineproductie ^{8, 9.} Om de rol van deze cellen te begrijpen, is het belangrijk om de verschillende subpopulaties ILC per orgaan bepalen en hun ontwikkeling relaties aan te geven. Bovendien zijn verschijnselen plasticiteit tussen de verschillende subgroepen gerelateerd. Door het bestuderen van de heterogeniteitvan de onderhavige in een orgaan cellen, is het mogelijk om het stadium van rijping te bepalen en hun specifieke functies te onderscheiden.

Om de techniek van single-cell multiplex RT-qPCR te illustreren, werden de lever ILC gekozen, met een bijzondere nadruk op de heterogeniteit binnen dezelfde ILC groep (type 1 ILC) ^10. Enerzijds door middel van flowcytometrie, werden drie verschillende populaties ILC kenmerk in de lever. Groep 1 ILC vertegenwoordigt ongeveer 80% van het aangeboren effectoren, terwijl de twee andere populaties zeldzame hepatische ILC populatie (minder dan 5% van het aangeboren effectoren). Die populaties werden gesorteerd met behulp van algemeen voor het celoppervlak markers van ILC populaties. Hierdoor gesorteerd ILC populaties in de lever kijken grote lijnen gelijk aan elkaar.

Eencellige multiplex RT-qPCR heeft ontpopt als een van de beste technieken om onmiddellijk een onderzoek in de heterogeniteit van deze populaties ¹¹ . Twee belangrijke eigenschappen worden bepaald door gebruik te maken van de eencellige multiplex RT-qPCR techniek. Ten eerste, door naar de klonale niveau, is het mogelijk om cel-specifieke genexpressie herstellen gedurende vergelijking van cellen die blijkbaar vergelijkbaar ontwikkelingsstadia geven. Vervolgens, door naar een vooraf geselecteerde combinatie van genexpressie, zullen we nieuwe genen handtekeningen bepalen gebaseerd op de gelijktijdige genexpressie patronen op één tijdstip. Deze aspecten staat hem toe allerlei expressie gegevens voor een groot aantal cellen, zelfs op zeldzame populatie, omdat de techniek wordt uitgevoerd op klonale niveau. Daardoor kan ILC heterogeniteit in de lever voldoende beoordeeld.

Vervolgens sorteert alle cellen met een globaal ILC fenotype, een breed overzicht van de meervoudige genexpressie van de lever ILC populaties wordt verkregen, hoewel ze vertegenwoordigen uiterst zeldzaam populaties. A-microfluïdische gebaseerde chip maakt het mogelijk experimenteren met nogeen kleine hoeveelheid celmateriaal. Bijgevolg kan de genexpressieprofielen van zeldzame celpopulaties worden verkregen. Met behulp van online gen handtekening analyse software, mobiele bevolking clusters en potentiële cel relaties kunnen worden onderzocht. Bijgevolg kunnen functionele tests worden uitgevoerd om de clustering gegevens op in vivo niveau valideren.

Tientallen genexpressies kunnen gelijktijdig worden beoordeeld op honderden of meerdere elementaire cellen op dezelfde chip ^{3, 11, 12.} Uitvoering van de test is het langste en belangrijkste deel van het experiment. De bepaling van de genen voor de hypothese relevant beproeven essentieel om relevante resultaten te verkrijgen. Ten tweede, interne controle (zoals bekend oppervlaktemerkers gebruikt voor sorteren) en specifieke controles nodig. Dit is belangrijk om de primer amplificatie specificiteit, de efficiëntie van de amplificatie en t testenHij afwezigheid van primer concurrentie. Daarom werken met eencellige multiplex RT-qPCR is een tijdbesparende techniek als meervoudige genexpressie van een cel wordt beoordeeld tegelijkertijd.

Met dezelfde chip en mengeling van reagentia voor alle cellen beperkt de mogelijke fouten van manipulatie en maakt reproduceerbaarheid tussen monsters. Geheel, de verschillende aspecten van eencellige multiplex RT-qPCR maakt de productie van zeer betrouwbare resultaten op klonale niveau met een grote mate van gevoeligheid voor diverse monsters en genen. De behaalde resultaten bieden krachtige en betrouwbare gegevens voor biostatistical testen.

Dit kan worden bereikt door de microfluïdische aspect van de methode, waarmee het werk aan zeer kleine hoeveelheden materiaal en leidt tot uitgebreide gegevens. Bovendien zullen, met online software, is het mogelijk om de gewenste populaties vergelijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Pasteur Instituut commissie Veiligheid in overeenstemming met het Franse Ministerie van Landbouw en de EU-richtlijnen.

1. Maak een 96-well Single-cell sorteren Plate

1. Bereid voorversterking mix in een 1,5 ml buis door het toevoegen van 5,0 pi specifieke retro-transcriptie buffer, 1,3 pl lage ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) TE-buffer (10 mM TE, pH 8, en 0,1 mM EDTA oplossing, 0,2 uM gefiltreerd ) en 0,2 pi Taq DNA polymerase per putje (figuur 1a).
2. Op een 96-well plaat, verdelen 6,5 ul voorversterking mengsel in elk putje (maximaal 48 putjes). Deze plaat is de 96-well eencellige sorteren plaat.
   OPMERKING: Met behulp van een elektronische pipet wordt aanbevolen voor dit protocol. Het zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare volumemetingen en bespaart tijd.

Figuur 1: 96-well plaat laadproces. Het laden van de 96-well platen moet zeer zorgvuldig gebeuren, omdat het invloed de rest van het experiment. (A) In de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat, wordt de pre-amplificatie mengsel eerst verdeeld, gevolgd door 0,2 x analysemengsel. (B) Het verslag van elke single-cell positie moet op een spreadsheet worden gehouden. Een goed zonder cel een "geen invoer" goed genoemd en kan worden gebruikt als een controle. Twee rijen kunnen worden gespaard om primer efficiëntie cDNA verdunning (sequentieel één op de tien verdunningen van het equivalent van 10 ⁵ cellen tot één cel) te controleren. (C) Op de 96-well assay plaat, wordt de test laden reagens eerst verdeeld, gevolgd door de toevoeging van de primers. Vergeet niet om een ​​lay-out van elke primer positie te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereid een 0,2 x testmengsel in een 1,5 ml buis door het toevoegen van 1,4 pi van elke primer (primers 20x, maximaal 48 verschillende probes; zie Tabel 1). Pas het uiteindelijke volume tot 140 ul met lage EDTA TE-buffer.
4. Verdeel 2,5 ui van het 0,2x analysemengsel de 48 putjes in 96-well enkelvoudige celsortering plaat met de voorversterking mix.
   Opmerking: Het eindvolume in elk putje van de 96-well plaat monster moet 9 pl.
5. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het neer op 280 xg gedurende 45 sec. Bewaar de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

2. Single Cell Dissociatie

1. Met een CO ₂ afgiftesysteem, euthanaseren een muis door hypoxie. Bevestig de muis op een dissectie bord en open de buikholte in de lengte met een schaar.
2. Recover ILC's uit de lever.
   1. Voorafgaand aan de lever isolement, flush het liver-circulerende cellen.
      1. Om de poortader uit te brengen, bewegen de dunne en de dikke darm naar de linkerkant van de muis; de poortader wordt de grootste ader in de peritoneale holte.
      2. Met een 10 ml spuit en 0,45 mm naald Spoel de lever met fosfaatgebufferde zoutoplossing medium (PBS) door de poortader. Om lever blozen te vergemakkelijken, snijd de maag slagader met een schaar.
      3. De galblaas, knijpt de basis van de galblaas met een tang en scheiden van de lever met een schaar.
      4. Naar de lever te isoleren, knijpt de basis van de lever met een tang en met een schaar, scheiden van de lever van de rest van de peritoneale holte.
      5. Breng de lever in een potter buis met 5 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 2% foetaal kalfsserum (FCS).
3. Distantiëren de lever met een monteur dissociatie met behulp van een stamper. Breng het medium om een ​​15 ml buis. Breng het totale volumetot 14 ml met RPMI 2% FCS. Laat de celsuspensie op ijs gedurende 15-20 minuten naar de hepatocyten decanteren.
4. Herstel de supernatant (zonder hepatocyten) in een nieuwe 15 ml buis met een 1 ml pipet (12 ml supernatant kan worden verwacht). Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant na centrifugeren.
5. Resuspendeer de pellet verkregen in stap 2.4 in 14 ml dichtheidsgradiënt medium (bijvoorbeeld 40% Percoll). Spin neer op 600 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant door afzuigen.
6. Resuspendeer de pellet in 1 ml kaliumacetaat (ACK). Reactie bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Na 1 min, komt het totale volume op 14 ml Hank's gebalanceerde Gezouten Solution (HBSS) 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant.
7. Vlekken op de cellen.
   1. Resuspendeer de pellet in 300 pi van gebiotinyleerd antilichaam mix (zie de tabel Materials; voeg alle gebiotinyleerde antilichamen noemened) en breng de cellen in 1,5 ml buis. Laat het in het donker gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
   2. Breng het totale volume tot 1 ml met HBSS 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Resuspendeer de pellet in 300 ul-fluorochroom gekoppeld antilichaam mix en fluorochroom-geconjugeerde streptavidine (zie de tabel Materials; voeg alle fluorochroom-gekoppelde antilichamen genoemd). Laat het in het donker gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
8. Breng het totale volume tot 1 ml met HBSS 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet 1 ml. Resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS en propidiumjodide (PI; 1: 4000).
   LET OP: Bij gebruik van de algemeen voor ILC celoppervlak markers, worden 3 populaties gedefinieerd: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ en NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Alle populaties worden naargelang afkomst ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Single-cell fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

1. Gebruik FACS om enkele cellen ¹³ sorteren.
   OPMERKING: Verschillende celtypen kunnen worden gesorteerd op dezelfde 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat (figuur 2).
   1. Gebruik FACS sorteren naar één cel per putje dat de 0,2x analysemengsel en de pre-amplificatie mengsel op 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat. Gebruik een vers bereide 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat of ontdooien indien bewaard bij -20 ° C.
      1. Zet een verzegelde 96-well plaat op de FACS plaat houder. Met een lege 96-well plaat als test. Plaats de plaat met de A1-well links en naar de experimentator.
      2. Stel de plaathouder een daling in het midden van het A1-wells met controle kralen te verkrijgen.
      3. Herhaal stap 3.1.1.2 met alle putten in lijn A.
      4. Verwijder de afdichting van de 96-putjesplaat en sorteer 100 controle korrels per putje. Controleer op dvorming rop in het midden van de putten.
      5. Bij goed afgesteld, plaatst u de 96-well eencellige sorteren plaat op de plaathouder. Teken de plaat lay-out en sorteren 1 cel per putje.
         OPMERKING: De juiste positionering van elke cel op de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat essentieel. Een plaat lay-out moet op een spreadsheet-software worden gehouden. De plaatindeling wordt gebruikt in de volgende verschillende stappen (figuur 1b) ^14. Laat één putje met 0,2x assay mix en pre-amplificatie mix van de 96-well steekproefplaat zonder cellen. Dit wordt gebruikt en een niet-invoerbesturingselement. Laat twee rijen 6 putjes een cDNA verdunning. Deze putten worden gebruikt als controles voor primer efficiëntie (Figuur 1b).
      6. Bewaar de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

4. Pre-amplificatie

1. Gebruik een vers of ontdooide 96-well eencellige sorteren plaat obtained in stap 3.1.1.6. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec).
2. Plaats de 96-well eencellige sorteren plaat op de thermocycler. Voeren reverse transcriptie en voorversterking volgens het genoemde programma in figuur 3 en tabel 2.

Figuur 3: Pre-amplificatie programma. Om voldoende materiaal heeft, wordt pre-amplificatie van specifieke doelgenen op gesorteerde enkele cellen vereist. De 96-well enkelvoudige celsortering plaat wordt geladen op een thermocycler voor de pre-amplificatie te volgen. De pre-amplificatieproducten worden verdund met lage EDTA TE-buffer en kan direct worden gebruikt of ingevroren bij -20 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Verdun de voorversterkerlified monsters door het toevoegen van 36 pi van lage EDTA TE buffer in elk putje.
4. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Bewaar de voorversterkte, 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

5. Bereid een 96-well Sample Plate

1. Bereid 191 pi master mix door het toevoegen van 175 pi van qPCR master mix en 17,5 pl monster laden reagens.
2. Een nieuwe 96-well plaat, distribueren 3,6 pi Master Mix van elke well (maximaal 48 putjes). Dit is de 96-well plaat sample.
3. Transfer 2,9 pi pre-geamplificeerde cDNA van de 96-well monsterplaat de nieuwe 96-well plaat. Houd dezelfde positie voor elk monster tussen de 96-single celsortering plaat en de 96-well sample plaat.
4. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Plaats de nieuwe 96-well plaat op ijs beschermd tegen licht. Bewaar de 96-well sruime plaat bij -20 ° C of gebruik het onmiddellijk.

6. Bereid een 96-well Assay Plate

1. Een nieuwe 96-well plaat, distribueren 3 pl assay geladen reagens in elk putje (maximaal 48 putjes). Deze plaat is de 96-well assay plaat genoemd.
2. Voeg 3 ul van primers aan elke well. Houd een indeling op een spreadsheet software (figuur 1c en Tabel 1, gebruik maken van alle primers in tabel 1 vermeld). De juiste positionering van elke primer op de 96-well assay plaat is essentieel voor de komende stappen.
   1. Indien het aantal monsters is dan 48, voeg water in plaats van primers ongebruikte wells.
3. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Bewaar de 96-well assay plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.
   OPMERKING: herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de primers voor de 96-wel vermijden distribueren primers voor voorversterking en mixl testplaat tegelijk.

7. Single-cell gen-expressie Chip

1. Plaats de geïntegreerde microfluïdische schakeling (IFC) op de bank en controleer de kleppen met behulp van de afgetopte spuit. Open de spuit, plaats deze loodrecht op de klep, en druk stevig. De O-ring moet bewegen. Vul de chip met controle lijn vloeistof (0,3 ml tuberculine).
2. Herhaal stap 7.1 met de tweede klep.
   LET OP: geen vloeistof moet worden gemorst over de chip.
3. Verwijder de blauwe film van de bodem van de chip. Laad de chip in de IFC controller. Op de controller scherm IFC, selecteer "PRIME" en vervolgens op "RUN." De regeling van de microfluïdische lijnen duren 10 minuten.
4. Werp de chip en opnieuw afdichten van de blauwe folie aan de onderzijde van de chip.

Figuur 4: Single-cell multiplex genexpressie chip laden. Deze stappen vereisen great precisie, vooral tijdens de overdracht van de 96-well plaat om de eencellige multiplex genexpressie chip. Om het laden fouten en misplaatsingen te voorkomen, wordt het sterk aanbevolen om na elkaar te werken. Het volume genomen voor elke overdracht moet worden gecontroleerd tijdens het pipetteren proces. Tenslotte is het belangrijk om luchtbellen te vermijden en om ze bij formatie te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Onder toepassing van een 8-kanaals Pipetteer 5 ul van de 96-well assay plaat aan de zijde A1 (links) van de chip. Vul de linkerkant van de chip, zoals in figuur 4. Wees voorzichtig om altijd hetzelfde volume in de tips te trekken.
   1. Niet bellen creëren. Als er bellen verschijnen, verwijder ze met behulp van 10 pi tips. tips verandering voor elk putje van de chip.
6. Herhaal stap 7,5 rechts of de chip met behulp van 5 pl van de 96-well sample plaat.
7. Verwijder de blauwe film van de bodem van de chip. Laad de chip in de IFC controller. Op de controller scherm IFC, selecteer "Script" en vervolgens op "RUN." Het laden van de microfluïdische lijnen duurt 45 min.
8. Werp de chip en opnieuw afdichten van de blauwe folie aan de onderzijde van de chip.

8. Voer de Chip

1. Op de microfluïdische qPCR computer, selecteert u de "Data Collection" software. Zodra het begint, selecteer "Nieuwe Run."
2. Selecteer "uitwerpen," verwijder de blauwe film van de bodem van de chip, en laadt de chip. Plaats de chip A1 gezond worden links en naar de experimentator.
3. On "Project instelling," selecteert u "Geen" en vervolgens op "Next."
4. Selecteer "Nieuwe chip run ',' Nieuwe chip directory" (maak een map voor het experiment), en "Next."
5. On "genexpressie" te selecteren "; Passief reference = ROX '(carboxy-x-rhodamine) en' Single probe, "selecteer de juiste filter volgens de primers selecteren." Next ".
6. Selecteer "Bladeren" en selecteer het juiste programma op basis van de gebruikte primers.
   LET OP: "Default-10min-Hotstart.pcl" is de meest gebruikte programma voor het single-cell multiplex RT-qPCR.
7. Selecteer "Start Run". De reactie duurt ongeveer 90 minuten.
8. Eenmaal klaar, selecteer "Eject-Done."

9. Data Analysis

1. Open de "real-time PCR-analyse" software, selecteer "File" en "Open", zoek de map experiment, en kies "ChipRun.bml bestand."
2. Klik op "Analysis View ',' Resultaten Tabel 'en' Heat kaart;" dozen gemarkeerd met een "X" zijn onder de drempel detectie-niveau en / of had slechte versterking curves.
3. Noem de monsters. Ga naar "Sample Setup" en select "Nieuwe SBS 96." Klik op "Mapping" en selecteer "..." Kopieer en plak de steekproef lay-out ontwerp van de spreadsheet-software. Definieer de geplakte layout als "Sample Naam."
4. Noem de testen. Herhaal stap 9.3 met de primer namen in "Detector Setup." Definieer de geplakte layout als "Detector Naam."
5. Klik op "Analyse view" en "te analyseren;" het monster en primer krijgen automatisch toegekend aan de monsters en primers (Figuur 7).
6. Bereken Ct, Delta Ct en Fold Change voor elk monster. Gebruik een housekeeping gen als een interne controle (hier, GAPDH):
   ACt = Ct _sample - Ct _{interne controle}
   Vouw Change = 2 ^{- (ΔCtsample-ΔCtnegative control)}
   1. Klik op "Detector Setup" en selecteer het goed met geen input controle (gebruik de huishoud-gen als een interne controle om genexpressie te normaliseren). Selecteer "Editor, "" te definiëren referentie, "en" Update. "
   2. Selecteer alle putjes waaraan de hierboven gedefinieerde interne controle wordt toegepast. Selecteer "Editor" en "te definiëren als Test." Kies een geschikte referentie-gen en klik op "Update."
   3. Selecteer "Sample Setup" om de negatieve controle goed te selecteren. Selecteer "Editor" en definieer "Reference." Klik op "Update."
   4. Selecteer "Analysis View" en "te analyseren;" de Delta Ct en Fold Change wordt automatisch berekend.
7. De gegevens exporteren. Selecteer "File" en "Export, opslaan als" Table Resultaten, "selecteert u de doelmap en klik op" Save "en" Exit. "
8. Herhaal stap 9.7, maar in plaats van "Table Resultaten," Opslaan als "HeatMap resultaten."

Resultaten

Lymfoïde populatie weer grote diversiteit in genexpressie. In dit protocol, werd de lever ILC compartiment heterogeniteit onderzocht met behulp van single-cell multiplex RT-qPCR genexpressie. In tegenstelling tot andere genexpressie technieken eencellige multiplex RT-qPCR genexpressie laat werken op verschillende populaties, zelfs de meest zeldzame, tegelijkertijd. Deze specificiteit in combinatie met een hoge gevoeligheid op klonale niveau maakt het onderzoek van verschillen in gen hand...

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe uitputtend genexpressie informatie op het klonale niveau te verkrijgen. Hier, onderzochten we de lever ILC compartiment heterogeniteit. Na eencellige sorteren van de verschillende ILC populaties (gebaseerd op algemeen voor ILC oppervlak markers), monsters werden voorversterkte voor specifieke vooraf geselecteerde genen. Vervolgens worden de verkregen cDNA en primers werden op een multiplex RT-qPCR microfluïdische chip. Tenslotte kregen we de expressie van 48 genen van verschillende 48 individ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cells Direct One Step qRT-PCR kit	Applied Biosystems	11753100	Primer probe detectiekit.Bevat 2x reactiemix, SSIII Platinium enzym.
Low TE EDTA Buffer	Affymetrix	75793 100ML
96-well plates	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-well plates aangepast voor celsortering en thermocycling
Cover film	Dominique Dutscher	106570	aluminium cover film; vermijdt vervuiling en verdamping
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x primer
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x primer
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x primer
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x primer
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x primer
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x primer
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x primer
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x primer
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x primer
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x primer
Cxcr6	Thermofisher Scientific	Mm02620517_s1	20x primer
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x primer
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x primer
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x primer
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x primer
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x primer
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x primer
Hes1	Thermofisher Scientific	Mm01342805_s1	20x primer
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x primer
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x primer
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x primer
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x primer
Il-1rl1	Thermofisher Scientific	Mm00434237_s1	20x primer
Il-22	Thermofisher Scientific	Mm001226722_s1	20x primer
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x primer
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x primer
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x primer
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x primer
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x primer
Lef1	Thermofisher Scientific	Mm00550265_s1	20x primer
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x primer
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x primer
Notch1	Thermofisher Scientific	Mm00435249_s1	20x primer
Notch2	Thermofisher Scientific	Mm00803069_s1	20x primer
Rora	Thermofisher Scientific	Mm01173766_s1	20x primer
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x primer
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x primer
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x primer
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x primer
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x primer
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x primer
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x primer
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x primer
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x primer
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x primer
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x primer
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x primer
qPCR Master mix	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000736	Specifiek dichtheidsmedium om assays in multiplex RT-qPCR microfluïdische chip te laden.
2x Sample Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000735	Specifiek dichtheidsmedium om monsters in multiplex RT-qPCR microfluïdische chip te laden.
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Dynamic Array IFC voor genexpressie;chip voor enkele cel multiplex RT-qPCR reactie
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller	Fluidigm	89000020	48.48 IFC Controller; best