Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54860

⸱

17 december 2016

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van zowel subunit co-expressie en postlysis subunit mengen voor een grondig onderzoek van recombinant proteasoom montage.

Samenvatting

Proteasomen worden gevonden in alle domeinen van het leven. Zij bieden de belangrijkste route voor intracellulaire eiwitafbraak in eukaryoten, hoewel hun assemblage wordt niet volledig begrepen. Alle proteasomen bevatten een structureel geconserveerd kerndeeltje (CP) of 20S proteasoom, die twee heptamere β subeenheid ringen tussen twee heptamere ringen α subeenheid. Archaea 20S proteasomen zijn compositorisch eenvoudiger in vergelijking met hun eukaryote tegenhangers, maar ze beiden delen een gemeenschappelijke vergadering mechanisme. Bijgevolg Archaea 20S proteasomen blijven belangrijke modellen voor eukaryote proteasoom montage zijn. Specifiek heeft recombinante expressie Archaea 20S proteasomen gekoppeld denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) veel belangrijke inzichten proteasoom biogenese opgeleverd. Hier bespreken we een manier te verbeteren op de gebruikelijke strategie van co-expressie van archaea proteasoom α en ß-subeenheden voorafgaand aan nondenaturing PAGE. We laten zien dat hoewel snel en efficiënt, een co-expressie aanpak alleen kan missen belangrijke assemblage tussenproducten. Bij het proteasoom, kan co-expressie geen detectie van de half-proteasoom, een tussenproduct dat een volledige α-ring en een volledige β-ring mogelijk. Echter, dit tussenproduct wordt gemakkelijk gedetecteerd via lysaat mengen. Wij stellen voor dat de combinatie van co-expressie met lysaat mengen een aanpak die is grondiger in het analyseren van de montage oplevert, maar toch blijft arbeid nonintensive. Deze benadering kan nuttig zijn voor het bestuderen van andere recombinante multiproteïnecomplexen zijn.

Inleiding

Multiproteïnecomplexen uit te voeren tal van kritische cellulaire activiteiten 1. Voor veel van deze complexen, meer bekend over hun structuur en functie dan ongeveer 2,3 de montage. Het proteasoom is zo'n complex en wordt in alle domeinen van het leven. In eukaryoten, deze moleculaire machine is de kern van het ubiquitine / Proteasome System (UPS) en geeft de belangrijkste route van intracellulaire eiwitafbraak 4. De eukaryote proteasoom (aangeduid als 26S proteasoom) bestaat uit twee belangrijke subassemblages: a 20S proteasoom of kerndeeltje (CP) 5, die kunnen worden afgesloten aan één of beide einden door een 19S Regulatory Particle (RP) 6.

Het 20S proteasoom is een groot gecompartimenteerd protease. De quaternaire structuur absoluut geconserveerd in alle levensdomeinen en bestaat uit een stapel van vier zevenringen die twee soorten structureel verwante subeenheden, α; en P 5,7,8. In eukaryoten worden de twee buitenringen elk bestaande uit zeven verschillende α subeenheden en twee binnenringen elk bestaan ​​uit zeven verschillende β subeenheden; proteolytische activiteit berust bij drie van de β subeenheden. Daarentegen worden de CP ringen archaea en bacteriën gewoonlijk samengesteld uit slechts één type α en één type β subunit. Archaea proteasomen hebben verstrekt een belangrijk model systeem om proteasoom assemblage studeren als gevolg van zowel hun compositorische eenvoud en het delen van een gemeenschappelijke vergadering mechanisme met hun eukaryote tegenhangers 9-13. Kortom, α subeenheden assembleren in α ringen eerste, die dienen als een stellage waarop ß-subeenheden assembleren. De resulterende half-proteasomen (α β 7 7) dimeriseren, wat tot volledig geassembleerd CP (α β 7 7 7 α β 7). Dimerisatie tijdens de propeptiden in over ß-subeenhedenautokatalytische worden verwijderd, waardoor de katalytische N-terminale threoninen. Het gebruik van proteasomen Archaea montage model houdt vaak gebruik van de productie van recombinante archaea proteasoom eiwitten in Escherichia coli. Dit is een waardevolle benadering omdat het stelt de subeenheden worden geproduceerd in verschillende combinaties, zowel WT en mutante versies in een gastheerorganisme dat zijn eigen proteasomen niet produceert.

Monitoring van de assemblage van multi-eiwitcomplexen biochemisch vereist enige vorm van fractionering methode die volledig gemonteerd complexen van assemblage tussenproducten en voorlopers scheidt. Vanwege de superieure oplossen capaciteit denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gebleken bijzonder bruikbaar bij de fractionering van diverse grote multiproteïnecomplexen 14-17 zijn. De combinatie van recombinant archaea proteasoom productie en denaturerende PAGE is uitgegroeid tot een krachtige aanpak in dissecting proteasoom montage 9,11,12,18. De gebruikelijke wijze waarop deze benadering wordt toegepast (bijv. Via de co-expressie van recombinant α en β-subeenheden) een belangrijk nadeel. Vergadering reacties zijn coöperatieve en sterk afhankelijk van de concentratie 3. Aangezien de eiwitconcentratie in cellen is zeer hoog 19 vanwege uitgesloten volume-effecten, assemblage reacties verlopen in vivo snel. Daarom is het mogelijk om belangrijke assemblage tussenproducten missen als α en β subeenheden co-expressie gebracht.

Hier, we pleiten voor een gecombineerde aanpak in het onderzoek naar proteasoomafhankelijke assemblage het gebruik van recombinante Archaea proteasoom subunits. In deze benadering worden zowel co-expressie en lysaat mengmethoden gebruikt. De voormalige zorgt voor een snelle analyse van de montage, omdat co-expressie is minder arbeidsintensief. De laatste is afhankelijk van afzonderlijke expressie van α en β-subeenheden, gevolgd door mengen. Hoewel dit requires met enige moeite dan co-expressie is meer dan gecompenseerd door de mogelijkheid om tussenproducten die worden gemist tijdens co-expressie te detecteren. Samen kunnen deze twee methoden een vollediger beeld proteasoomafhankelijke samenstel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bacteriële expressie.

Noot: Expressieplasmiden die in deze studie worden in Tabel 1. Oplossingen, media en buffers die in deze studie worden in Tabel 2. Het klonen van Archaea proteasoom subunit genen en het genereren van expressieplasmiden worden elders beschreven 18,20. Kortom, voor recombinante plasmiden co-expressie van subeenheden gebruik van een bicistronisch operon strategie die helpt bij het verkrijgen van vergelijkbare expressieniveaus van individuele subeenheden 18,20. De uitdrukking onderstaande parameters werden empirisch bepaald optimaal voor de proteasoom subunits in deze studie zijn. Het kan nodig zijn om expressie te optimaliseren voor andere proteasoom mutanten voor proteasomen uit andere archeale species of andere recombinant eiwit complexen (zie discussie).

  1. Transformeer expressieplasmide belangstelling in chemisch competente E. coli BL21 (DE3) cellen.
  2. Voeg 1-2 pl plasmide (typisch 50 - 100 ng) om een ​​hoeveelheid DE3 cellen die vers werden ontdooid op ijs en verder incuberen op ijs gedurende 20 min.
  3. Heat shock de cellen bij 42 ° C gedurende 45 s en de buis terug naar ijs additionl 2 min.
  4. Voeg 1 ml LB medium en incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende 1 uur.
  5. Spread 100-200 pl van het transformatiemengsel op LB-kan-platen (platen met vast LB-medium, aangevuld met kanamycine (alle plasmiden die in deze studie coderen resistentie tegen dit antibioticum)). Incubeer de platen bij 37 ° C O / N.
  6. De volgende ochtend, het enten van een enkele kolonie van de LB-kan plaat in 3 ml vloeibare LB-kan media in een glazen buis cultuur. Incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende ongeveer 2,5-3 uur, of totdat troebeling optreedt.
  7. Meet de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm (OD 600) in een spectrofotometer. Verdun de cel cultusure met een geschikte hoeveelheid voorverwarmde LB-kan media om een OD 600 van 0,4 in een eindvolume van 6 ml. Hervatten schudden bij 37 ° C gedurende 40 minuten.
  8. Induceren eiwitexpressie in de vloeibare kweken door toevoegen van IPTG een voorraadoplossing om een ​​eindconcentratie van 1 mM. Incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende ongeveer 6-7 uur.
  9. Oogst bacteriële celculturen in hun geheel in 1,5 ml microcentrifugebuizen.
  10. Voeg 1,5 ml van een cultuur in microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
  11. Verwijder het supernatant en voeg nog eens 1,5 ml van dezelfde cultuur aan de pellet. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
  12. Herhaal stap 1.11 totdat de hele cultuur wordt geoogst in de microcentrifugebuis.
  13. Bewaar de geïnduceerde pellets bij -80 ° C tot lysis.

2. Bacteriële Lysis en Lysate mengen.

Notitie: Voor monsters onderzocht via co-expressie, volg paragraaf 2.1 (en de onderdelen). Voor monsters die lysaat mengen, volg paragraaf 2.2 (en de onderdelen). De analyse TSP (Totaal, oplosbaar, Pellet) die is opgenomen in het protocol is handig zijn om eiwitexpressie die kunnen bijdragen dat ongeveer gelijke hoeveelheden α en β-subeenheden gecombineerd lysaat tijdens het mengen (zie discussie). Het biedt ook een belangrijke controle als downstream resultaten niet worden verwacht (dat wil zeggen dat controleert of eiwit werd tot expressie gebracht en oplosbaar). Dus, we raden met inbegrip van TSP analyse in eerste instantie. Zodra een optimale protocol is bereikt voor een bepaalde subeenheid combinatie is TSP analyse niet strikt noodzakelijk en daarom wordt beschreven als optionele hieronder.

  1. Lysis van bacteriële cellen en bereiding van oplosbare fracties.
    1. Ontdooi de geïnduceerde cel pellet op ijs gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 600 ui lysisbuffer.
    2. IncUbate de suspensie bij 30 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende 30 min de totale ruwe lysaat te genereren.
      Opmerking: de volgende stap en de subsectie die volgt zijn optioneel.
    3. Verwijder de twee 25 pi porties van het totale ruwe lysaat in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen en uitvoeren van TSP analyse als volgt.
      1. Om één van de twee 25 pi aliquots, voeg 5X SDS sample buffer tot een eindconcentratie van 1X. Label de buis met "T" voor "de totale ruwe lysaat".
      2. Incubeer de "T" monster bij 100 ° C gedurende 5 minuten volledig eiwitten denatureren.
      3. Ondertussen neemt u de tweede 25 pi aliquot en centrifuge het op 10.000 x g gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de kleine pellet, en over te dragen aan een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Label deze nieuwe tube "S" voor "oplosbare fractie".
      4. Om de kleine pellet links behind in de vorige stap, voeg 25 ul lysisbuffer en vortex te mengen. Label deze buis "P" voor "pellet-fractie".
      5. Voeg 6 ul 5X SDS monsterbuffer de "S" en "P" buizen en incubeer bij 100 ° C zoals hierboven beschreven.
        Opmerking: Als de monsters niet TSP die dag worden gebruikt om expressie te analyseren, kunnen deze worden ingevroren bij -20 ° C totdat het nodig is. Ontdooide, moeten ze opnieuw geïncubeerd bij 100 * C, zoals hierboven beschreven, onmiddellijk vóór het laden op 12% en / of 15% standaard SDS-PAGE gel.
    4. Terwijl de TSP analyse wordt uitgevoerd, centrifuge de resterende 550 pi van de totale ruwe lysaat bij 10.000 x g gedurende 10 min (of de gehele 600 ul van de totale ruwe lysaat als TSP analyse wordt niet uitgevoerd). Verzamel de bovenstaande vloeistof in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Dit is de oplosbare lysaat die wordt gebruikt voor zuivering.
  2. Lysaat mengen.
    1. Verricht lysis zoals beschreven in de stappen 2.1.1 en 2.1.2 hierboven.
    2. Meng 600 ui totaal ruw lysaat van bacteriën tot expressie de gewenste α-subeenheid met 600 gl totaal ruw lysaat van bacteriën tot expressie het gewenste β subeenheid. Incubeer bij 37 ºC met een trage schudden gedurende 30 min.
      Opmerking: Het kan nodig zijn om incubatietijd optimaliseren om maximale assemblage tijdens lysaat mengen te bereiken (zie Discussie). De tijd en temperatuur die hier zijn optimaal voor de recombinante eiwitten in deze studie en elders werden 18 bepaald.
    3. Centrifugeer de gemengde lysaat bij 10.000 xg gedurende 10 min oplosbare materiaal te scheiden van onoplosbare pellet. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik deze gemengde oplosbare lysaat voor eiwitzuivering.

3. Protein Purification via geïmmobiliseerd Cobalt affiniteitshars(ICAR).

  1. Equilibreren de hars.
    1. Grondig mengen van de hars door het omkeren van het flesje en breng 50 pl van de suspensie naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten tot pellet hars. Zorgvuldig aspireren supernatant.
      Let op: Wij voeren pipet aspiratie met behulp van een blauwe 1 ml pipet tip om het grootste deel van de vloeistof te verwijderen. Een wit 2 pi tip voor nauwkeurige controle van de verwijdering van het resterende supernatant, waardoor een zeer dunne vloeistoflaag die de korrels.
    2. Voeg 1 ml buffer A. Meng zachtjes hars en resuspendeer centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten hars pellet. Zorgvuldig aspireren het supernatans en herhaal deze wasstap nog een keer.
  2. Solliciteer oplosbare lysaat eerder verkregen in paragraaf 2.1 of 2.2 op de geëquilibreerde hars. Incubeer de buis met zachte rotatie bij 4 ° C gedurende 60 minuten. Centrifugeer de buis bij 700 x g </ Em> voor 5 min en voorzichtig zuig het supernatant.
  3. Was de hars als volgt specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.
    1. Resuspendeer hars met 1 ml buffer A en incubeer met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant. Herhaal deze wasstap nog een keer.
    2. Resuspendeer hars met 1 ml buffer B (Buffer A met 5 mM imidazool) en incubeer onder zacht schommelen bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant. Herhaal deze wasstap nog een keer.
    3. Resuspendeer hars met 1 ml Buffer C (Buffer A met 10 mM imidazool) en incubeer onder zacht schommelen bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant.
  4. Elueer het eiwit door het toevoegen van 400 gl buffer E (buffer A met 200 mM imidazool) to de hars. Incubate met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
  5. Transfer supernatant dat gezuiverd eiwit aan een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis.
  6. Ontzouten het gezuiverde eiwit door seriële centrifugatie als volgt.
    1. Aan 400 pi van gezuiverd eiwit, voeg 100 ul buffer A (vermindert Imidazool concentratie van 200 mM tot 160 mM). Toepassen gezuiverd eiwit aan 0,5 ml ultracentrifugale filters met een 10 kDa moleculair gewicht cut-off. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
    2. Werp het filtraat en voeg 400 ul buffer A aan het retentaat en centrifugeer opnieuw verdunnen. Voortzetting van de cycli van centrifugeren / verdunning tot imidazol concentratie lager dan 4 mm. Als voorbeeld, indien elk centrifugeren concentreert 500 pi naar ~ 70 gl (of ongeveer 7 maal), waarna twee cycli de start 160 mM imidazool concentratie (7 x 7 = 49-voudig) verminderen approximately 3,3 mM.
    3. Meet de eiwitconcentratie van het monster ontzout met behulp van de BCA assay 21.
      Noot: Het ontzouten moet imidazool beneden de tolerantiegrens voor de BCA assay verminderen, volgens de instructies van de fabrikant. Ons laboratorium voorkeur de BCA assay omdat het gevoelig is, heeft een groot dynamisch bereik, en vertoont minder eiwit tot eiwit variant. Echter, andere methoden om eiwitconcentratie bepaald worden gesubstitueerd voor de BCA assay. De sleutel is om de hoogte van de voordelen en beperkingen elke methode.
  7. Voeg 5X natieve monsterbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 1x en ga aan elektroforese. Als alternatief, monsters bewaar bij -20 ° C voor latere analyse.

4. denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE).

Let op: Ongepolymeriseerd acrylamide is een neurotoxine. Draag geschikte beschermende gear.

  1. Bereid de denaturerende PAGE gel als volgt.
    1. Bereid de gel cassette voor het gieten van het gebruik van schone glazen platen en gieten stand. Plaats gradient maker op de top van een kleine magnetische roerder en plaats een kleine roerstaafje in elke kamer.
    2. Toepassing van 40% (w / v) acrylamide en 2% (w / v) bisacrylamide voorraadoplossingen, bereid 5% en 10% (w / v) acrylamidegel oplossingen in een natieve oplossing buffer. Zorgen dat de verhouding van totale acrylamide tot bisacrylamide is 37,5: 1. Chill op ijs voor het gieten.
      Opmerking: Het denaturerende PAGE systeem hier gebruikt is in wezen identiek aan de Laemmli SDS-PAGE systeem met SDS 22 weggelaten.
    3. Voeg Ammoniumpersulfaat (van een 10% (w / v) stockoplossing bereid in water) aan de acrylamide oplossingen voor polymerisatie te initiëren. Eindconcentratie ammoniumpersulfaat is 0,1% (w / v).
    4. Giet de acrylamide-oplossingen in de twee kamers van het verloop maker. Met de uitlaat buis gestoken between de platen van de gelcassette, activeert de magnetische roerder en het verloop maker kleppen openen. Giet de 5-10% denaturerende gradiënt gel.
    5. Eenmaal gegoten, bedekken de gel met een dunne laag Isopropanol en laat de gel polymeriseren 30 min. Gedurende deze tijd, voor te bereiden verse 5% acrylamide gel-oplossing in het oplossen van inheemse buffer. Na de gel sets, afgieten Isopropanol en spoel de bovenkant van de gel met gedeïoniseerd water uit een spuitfles.
    6. De 5% geloplossing hierboven bereide, voeg ammoniumpersulfaat (precies zoals beschreven in 4.1.3) en giet bovenop de gepolymeriseerde gel tot glasplaten vol. Plaats gel kam. Laat de overlay gel polymeriseren gedurende nog 30 min.
    7. Zodra gel is gepolymeriseerd, assembleren gel cassette in elektroforese apparaat. U kunt ook opslaan van de gel bij 4 ºC, verpakt in vochtige papieren handdoeken en plastic folie tot aan gebruik.
  2. Zodra denaturerende PAGE gel is gemonteerd in electrophoresis apparaten, vul de tank met 1X inheemse lopende buffer vers bereid uit een 10X inheemse lopende buffer voorraad.
  3. Load 10 ug gezuiverde eiwit, verkregen aan het einde van hoofdstuk 3, in elk putje met behulp van een glazen injectiespuit.
  4. Load 2 pi van gewicht natief eiwitstandaard hoog molecuulgewicht (verdund in 1X natieve loopbuffer) in één van de putjes.
  5. Run gel bij 55 V en 4 ºC totdat de kleurstof voorkant loopt uit de gel (ongeveer 4-4,5 uur).
  6. Naast de denaturerende gel analyse aliquots van de gezuiverde eiwit door middel van standaard SDS-PAGE 22.
    1. Meng monsters (10 ug) van het gezuiverde eiwit monsters, verkregen op het einde van hoofdstuk 3, met 5x SDS-monster buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1X.
    2. Incubeer bij 100 ° C gedurende 5 minuten en plaats op standaard 12% en / of 15% SDS-PAGE-gels 22.
    3. Draaien op 80V gedurende 20 minuten en daarna tot de kleurstof voorkant van de gel (rent weg is dit bij 120 V ongeveer een addnele 75 min voor een 12% gel en 120 min voor een 15% gel).

5. Visualiseren activiteit en eiwit kleuring.

  1. Na elektroforese zorgvuldig gescheiden glasplaten en breng de denaturerende gel een gel lade met 50 ml gedeïoniseerd water. Spoel gel met zachte schommelen gedurende 5 minuten. Gooi water en herhaal deze wasstap drie keer.
  2. Voeren substraat overlay assay als volgt.
    1. Voeg 1 ml buffer die de ontwikkeling fluorogeen peptidesubstraat Suc-LLVY-AMC en gelijkmatig verdeeld over de gel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
      Opmerking: Een glazen staaf of gel releaser (klein stukje plastic gebruikt om afzonderlijke glasplaten) kan worden gebruikt om de vloeistof verdeeld over de gel.
    2. Breng voorzichtig de gel op de UV transilluminator van de gel beeldvormingssysteem en acht fluorescentie vanwege de gesplitste peptidesubstraat. image Record. Breng voorzichtig de gel back om de gel lade.
    3. Spoel de gel tweemaal met 50 ml gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten onder voorzichtig schommelen.
    4. Vlekken op de gel met 10 ml van een colloïdale Coomassie kleuring reagens gedurende 60 minuten onder voorzichtig schommelen. Destain gel met 50 ml water, totdat de achtergrond duidelijk. Deze kleuring stap geldt voor de standaard SDS-PAGE gels ook.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Proteasoom samenstel (figuur 1) begint als a-subeenheden vormen samen ringen 9. Dit kan worden geïllustreerd als a-subeenheden van de archaeon Methanococcus maripaludis S2 zijn uitgedrukt in E. coli als C-terminaal hexahistidine tag (his-gemerkte) derivaten (Tabel 1). Wanneer het recombinant α-eiwit zijn gezuiverd door ICAR en geanalyseerd door denaturerende PAGE, werden twee banden waargenomen (Figuur 2A, laan 1). We hebben eerder aangetoon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We tonen het voordeel van een gecombineerde aanpak van het analyseren van proteasoom montage door denaturerende PAGE met behulp van recombinant Archaea proteasomen. De gebruikelijke methode 9,11 van bacteriële co-expressie van proteasoom subunits zorgt voor een snelle analyse, maar kan niet onthullen sleutel assemblage tussenproducten. We raden het combineren van co-expressie met lysaat mengen tot een breder beeld van de montage evenementen te ontwikkelen.

Het voordeel van deze ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund in het kader van een onderzoek fondsen ter ondersteuning van Grant (RSFG) van de Universiteit van Indiana-Purdue University, Indianapolis, en deels door een onderscheiding van de American Heart Association 14GRNT20390154, om ARK

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylamide (40%) solutionBiorad1610104Ongepolymeriseerd acrylamide is een neurotoxine. Draag de juiste beschermingsmiddelen
Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filtersEMDMilliporeUFC501024
Ammonium PersulfateSigmaA3678
ATPSigmaA7699
BCA assay kitPierce23225
Bisacrylamide (2%) solutionBiorad1610142
BromofenolblauwSigmaB8026
DNaseISigmaDN25
Dithiothreitol (DTT)Thermo FisherBP172
E. coli BL21 competent cellsEMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592Colloidaal coomassie-kleuringsreagens voor gels
Gel doc EZ systemBiorad1708270Geldocumentatiesysteem
Gel releasersBiorad1653320Wedge-vormige kunststof gebruikt om gelplaten te scheiden; handig voor het verspreiden van vloeistof.
Glass rodThermo Fisher11-380B
GlycerolSigma49767
GlycineThermo FisherBP3865
Hamilton syringeThermo Fisher14-813-38Glazen spuit voor het laden van gels
HEPESUS BiologicalsH2010
HMW Native calibration kitGE Healthcare170445-01Hoge molecuulgewicht eiwitstandaarden
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277Gradiëntmaker
ImidazoleUS Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500Voor inductie van eiwitexpressie
IsopropanolThermo FisherBP26181
Kanamycin sulfateUS BiologicalsK0010
LysozymeSigmaL6876
MgCl2Fluka analytical630680
Mini Protean Tetra CellBiorad1658002EDUGelelektroforese-apparaat
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRoche11429876001Proteaseremmer
pET42EMD Millipore70562Expressieplasmide
Precision plus all blue standardBiorad1610373Moleculair eiwitstandaard voor SDS-PAGE
Quickchange mutagenesekitAgilent technologies200521
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Thermo FisherBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005Fluorogene substraat
Talon Metal Affinity ResinClontech635502Geïmmobiliseerde kobaltaffiniteitharsen
TEMEDSigmaT7024
TrisUS BiologicalsT8600
Triton-X100Sigma93426
TryptoneBacto BD211699
UV sample trayBiorad1708271Voor UV-beeldvorming van gels
Yeast extractBacto BD212720

Referenties

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130(2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Co expressiebenaderingLysaatmengingDetectie van Half ProteasoomArchaeaal 20S ProteasoomAlfa Beta SubunitsBacteri le ExpressieProte necomplexanalyse
Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.