Dit protocol maakt gebruik van zowel subunit co-expressie en postlysis subunit mengen voor een grondig onderzoek van recombinant proteasoom montage.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proteasomen worden gevonden in alle domeinen van het leven. Zij bieden de belangrijkste route voor intracellulaire eiwitafbraak in eukaryoten, hoewel hun assemblage wordt niet volledig begrepen. Alle proteasomen bevatten een structureel geconserveerd kerndeeltje (CP) of 20S proteasoom, die twee heptamere β subeenheid ringen tussen twee heptamere ringen α subeenheid. Archaea 20S proteasomen zijn compositorisch eenvoudiger in vergelijking met hun eukaryote tegenhangers, maar ze beiden delen een gemeenschappelijke vergadering mechanisme. Bijgevolg Archaea 20S proteasomen blijven belangrijke modellen voor eukaryote proteasoom montage zijn. Specifiek heeft recombinante expressie Archaea 20S proteasomen gekoppeld denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) veel belangrijke inzichten proteasoom biogenese opgeleverd. Hier bespreken we een manier te verbeteren op de gebruikelijke strategie van co-expressie van archaea proteasoom α en ß-subeenheden voorafgaand aan nondenaturing PAGE. We laten zien dat hoewel snel en efficiënt, een co-expressie aanpak alleen kan missen belangrijke assemblage tussenproducten. Bij het proteasoom, kan co-expressie geen detectie van de half-proteasoom, een tussenproduct dat een volledige α-ring en een volledige β-ring mogelijk. Echter, dit tussenproduct wordt gemakkelijk gedetecteerd via lysaat mengen. Wij stellen voor dat de combinatie van co-expressie met lysaat mengen een aanpak die is grondiger in het analyseren van de montage oplevert, maar toch blijft arbeid nonintensive. Deze benadering kan nuttig zijn voor het bestuderen van andere recombinante multiproteïnecomplexen zijn.
Inleiding
Multiproteïnecomplexen uit te voeren tal van kritische cellulaire activiteiten 1. Voor veel van deze complexen, meer bekend over hun structuur en functie dan ongeveer 2,3 de montage. Het proteasoom is zo'n complex en wordt in alle domeinen van het leven. In eukaryoten, deze moleculaire machine is de kern van het ubiquitine / Proteasome System (UPS) en geeft de belangrijkste route van intracellulaire eiwitafbraak 4. De eukaryote proteasoom (aangeduid als 26S proteasoom) bestaat uit twee belangrijke subassemblages: a 20S proteasoom of kerndeeltje (CP) 5, die kunnen worden afgesloten aan één of beide einden door een 19S Re....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bacteriële expressie.
Noot: Expressieplasmiden die in deze studie worden in Tabel 1. Oplossingen, media en buffers die in deze studie worden in Tabel 2. Het klonen van Archaea proteasoom subunit genen en het genereren van expressieplasmiden worden elders beschreven 18,20. Kortom, voor recombinante plasmiden co-expressie van subeenheden gebruik van een bicistronisch operon strategie die helpt bij het verkrijgen van vergelijkbare expressieniveaus van individuele subeenheden 18,20. De uitdrukking onderstaande parameters werden empirisch bepaald optimaal voor de proteas....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Proteasoom samenstel (figuur 1) begint als a-subeenheden vormen samen ringen 9. Dit kan worden geïllustreerd als a-subeenheden van de archaeon Methanococcus maripaludis S2 zijn uitgedrukt in E. coli als C-terminaal hexahistidine tag (his-gemerkte) derivaten (Tabel 1). Wanneer het recombinant α-eiwit zijn gezuiverd door ICAR en geanalyseerd door denaturerende PAGE, werden twee banden waargenomen (Figuur 2A, laan 1). We hebben eerder aangetoon.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We tonen het voordeel van een gecombineerde aanpak van het analyseren van proteasoom montage door denaturerende PAGE met behulp van recombinant Archaea proteasomen. De gebruikelijke methode 9,11 van bacteriële co-expressie van proteasoom subunits zorgt voor een snelle analyse, maar kan niet onthullen sleutel assemblage tussenproducten. We raden het combineren van co-expressie met lysaat mengen tot een breder beeld van de montage evenementen te ontwikkelen.
Het voordeel van deze ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund in het kader van een onderzoek fondsen ter ondersteuning van Grant (RSFG) van de Universiteit van Indiana-Purdue University, Indianapolis, en deels door een onderscheiding van de American Heart Association 14GRNT20390154, om ARK
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Ongepolymeriseerd acrylamide is een neurotoxine. Draag de juiste beschermingsmiddelen |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromofenolblauw | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidaal coomassie-kleuringsreagens voor gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Geldocumentatiesysteem |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge-vormige kunststof gebruikt om gelplaten te scheiden; handig voor het verspreiden van vloeistof. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glazen spuit voor het laden van gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | Hoge molecuulgewicht eiwitstandaarden |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradiëntmaker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | Voor inductie van eiwitexpressie |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gelelektroforese-apparaat |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Proteaseremmer |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expressieplasmide |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Moleculair eiwitstandaard voor SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesekit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogene substraat |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Geïmmobiliseerde kobaltaffiniteitharsen |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | Voor UV-beeldvorming van gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Referenties
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
