Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Summary

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Abstract

Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA's geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 ^G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 ^G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.

Introduction

EMSA's worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit ¹ te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door ³² P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA's geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labelin....

Protocol

OPMERKING: EMSA's via fluorescent gelabelde DNA probes of andere vormen van gelabelde DNA delen dezelfde protocollen voor eiwit of celextract bereiding, eiwit-DNA bindingsreactie en PAGE gel voorbereiding en actief (Figuur 1A). De belangrijkste verschillen zijn DNA labeling procedures, post-run gel processtappen, en detectiemethoden.

1. Gel Voorbereiding

1. Bereid 5% natieve polyacrylamidegel die 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA) en 2,5% glycerol, met een mini-eiwit gelsysteem (8,3 cm breed x 7,3 cm lengte x 0,75 mm dikte).
   1. Tot 30 ml geloplossing bereiden 4 gels, meng 5 ml 30% acrylamide / Bis (37,5: 1), 3 ml 5x TB....

Results

Oranje G ladingskleurstof (6x: 0,12 g oranje G in 100 ml 30% glycerol) kan de bindingsreactie toegevoegd vóór het laden om de voortgang van de elektroforese zichtbaar. Overige laad- kleurstoffen zoals broomfenolblauw zal worden gedetecteerd tijdens het scannen en dus interfereren met beeldanalyse (Figuur 1B).

In sommige gevallen van EMSA's, vooral als nucleair extract preparaat gebruikt, poly-deoxyinosinic.......

Discussion

fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA's met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd te.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA