Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Samenvatting

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Samenvatting

Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA's geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 ^G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 ^G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.

Inleiding

EMSA's worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit ¹ te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door ³² P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA's geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labeling met vergelijkbare gevoeligheid wordt ingezet als gevolg van de gezondheids- en veiligheidsrisico's in verband met de behandeling van radioactiviteit. Deze alternatieve werkwijzen omvatten conjugatie van biotine DNA met ² of digoxigenine (DIG) ³ (beide worden vervolgens gedetecteerd door chemiluminescentie systemen), SYBR groen kleuring van de gels PAGE ^4,of directe detectie van DNA-fluorescente kleurstof conjugaten door het scannen van de gel ^5,6.

De opgeloste gels EMSA's gebruikt radioactief gemerkte DNA-probes vereisen postrun verwerking, autoradiografie films of fosforimager systeem radioactieve signalen ^1,7 detecteren. Gels EMSA gebruik biotine- ² of DIG-geconjugeerd ³ DNA probes moeten worden verwerkt en overgebracht op een geschikt membraan en gedetecteerd door chemiluminescentie ^6. SYBR groene kleuring van de gel vereist postrun gel kleuring en fluorescentie scanner ^4. Aangezien postrun gel bewerkingsstappen zijn vereist voor EMSA's met behulp van deze DNA-labeling-technieken, kunnen de omgezette gel slechts eenmaal getest. Daarentegen kunnen DNA-probes gelabeld met fluoroforen direct worden gedetecteerd in de gel in de glasplaten met een scanner. Daarom kan de DNA-eiwit interacties worden gevolgd en meerdere malen op verschillende tijdstippen getest tijdens de vlucht, dievermindert de tijd en kosten. De DNA-fluorescerende kleurstof conjugaten die zijn gebruikt voor EMSA's omvatten Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, fluoresceïne ⁹ en infrarood fluorescerende kleurstoffen ^4-6.

Gentranscriptieregulatie vereist eiwit-DNA interacties van transcriptiefactoren en hun target genen. De coördinatie van deze interacties genereert diverse celtypen vanuit een gemeenschappelijke voorouder tijdens de ontwikkeling van dieren. Een onpartijdige forward genetische screen identificeerde een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG DNA-bindende domein van de Caenorhabditis elegans transcriptiefactor SOX-2. De mutatie resulteert in een cel identiteit transformatie van AWB olfactorische neuronen in AWC olfactorische neuronen op moleculair, morfologische en functionele niveaus ^5,10. SOX-2 regelt differentieel de terminal differentiatie van AWB en AWC neuronen door interactie met context-afhankelijke partner transcriptiefactoren en de respectieveDNA doelplaatsen ^5,10. SOX-2 partners met LIM-4 (LHX) in terminal AWB neuronale differentiatie, terwijl de SOX-2 partners met CEH-36 (OTX / OTD) in terminal AWC neuronale differentiatie. Luciferase reporter assays tonen aan dat SOX-2 en mutant SOX-2 ^G73E eiwitten coöperatieve interacties met cofactoren transcriptionele LIM-4 en CEH-36 een promoter uitgedrukt in AWB en AWC neuronen activeren. Echter, SOX-2 en mutant SOX-2 ^G73E weergegeven differentiële activering eigenschappen van de promotor. Om de moleculaire basis van differentiële DNA bindingsactiviteiten van SOX-2 en SOX-2 ^G73E te onderzoeken werden uitgevoerd fEMSAs met deze eiwitten en de potentiële doelplaatsen.

Eerst werd een bioinformatica aanpak om de biologisch relevante DNA bindende sequenties in het promotorgebied 1 kb gebruikt in de luciferase assay identificeren. Sinds meerdere potentiële SOX-2 bindende locaties in de promotor aanwezig waren, hebben we ons gerichton voorspelde SOX-2 bindingsplaatsen naast vermeende CEH-36 of LIM-4-bindende plaatsen en evolutionair geconserveerd tussen verschillende soorten aaltjes. Deze sequenties werden gedeleteerd of gemuteerd, en vervolgens in vivo getest op hun activiteit GFP reporter transgenen in AWB of AWC neuronen tot expressie. Door deze benadering identificeerden we potentiële LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen die specifiek zijn voor de expressie van GFP in AWB en AWC neuronen respectievelijk ⁵ vereist. We onderzochten de mogelijke verschillen in de DNA-binding van SOX-2 en SOX-2 ^G73E behulp van Femsa met de geïdentificeerde LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelwit sites. Onze analyse toonde aan dat EMSA SOX-2 ^G73E de DNA-probe die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen (vereist voor genexpressie in AWB) niet zo efficiënt WT SOX-2 deed niet binden. Echter, SOX-2 en SOX-2 ^G73E had geen verschil in het binden van de DNA-probe die het CEH-36 / SOX-2 adjacent target site (die nodig zijn voor genexpressie in AWC) ^5,10. Onze analyses geven FEMSA mechanistisch inzicht in de aard van de SOX-2 ^G73E-mutatie in zowel het gebruik van DNA-bindingsactiviteit van de AWB naar AWC celidentiteit transformatiefenotype. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol van FEMSA met gezuiverd 6xHis-SOX-2 of 6xHis-SOX-2 ^G73E samen met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes met de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen als een case study aan te pakken een belangrijke biologische vraag.

Protocol

OPMERKING: EMSA's via fluorescent gelabelde DNA probes of andere vormen van gelabelde DNA delen dezelfde protocollen voor eiwit of celextract bereiding, eiwit-DNA bindingsreactie en PAGE gel voorbereiding en actief (Figuur 1A). De belangrijkste verschillen zijn DNA labeling procedures, post-run gel processtappen, en detectiemethoden.

1. Gel Voorbereiding

1. Bereid 5% natieve polyacrylamidegel die 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA) en 2,5% glycerol, met een mini-eiwit gelsysteem (8,3 cm breed x 7,3 cm lengte x 0,75 mm dikte).
   1. Tot 30 ml geloplossing bereiden 4 gels, meng 5 ml 30% acrylamide / Bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-boraat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pl van 10% ammoniumpersulfaat, 15 ui TEMED en 20,2 ml DDH ₂ O grondig.
      OPMERKING: Acrylamide is schadelijk en giftig, handvat met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
2. Cast de gel oplossing onmiddellijk. Na de polymerisatie, wikkel de gels in doorzichtige plastic wrap pre-bevochtigd met 0.5x TBE en bewaar ze bij 4 ° C.

2. Voorbereiding van de infrarood fluorescerende kleurstof-gelabelde probes

LET OP: Houd de infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden buurt van licht zoveel mogelijk tijdens de bereiding, opslag en experimenten.

1. Ontwerpen en bestellen oligonucleotiden.
   1. Ontwerpen lang oligonucleotide voor ~ 51-meren.
      LET OP: De lange oligonucleotide sequentie van de LIM-4 / SOX-2 probe is TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange oligonucleotiden niet PAGE of HPLC zuivering nodig.
   2. Ontwerp van complementaire korte oligonucleotiden voor ~ 14-meren met infrarood fluorescerende kleurstof modificatie aan het 5'-uiteinde (5'Dye) en een smelttemperatuur boven 37 ° C.
      OPMERKING: De korte oligonucleotidesequentie van de LIM-4 / SOX-2 sonde 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. De minimale synthese schaal van 5'Dye-gelabelde korte oligonucleotiden is 100 nM. Daarom is de oligonucleotiden vereisen HPLC zuivering.
2. Resuspendeer oligonucleotiden 1x Tris-EDTA buffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 100 uM.
3. Gloeien Short (5'Dye) en Long oligonucleotiden.
   1. Meng 0,6 pl 5'Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ui oligo Long (100 uM) en 28,2 pi natriumchloride-Tris-EDTA buffer (STE 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in een 1,5 ml buis.
   2. Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten. Zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo's te koelen O / N in het donker.
4. Vul het 5 'overhangende versmolten 5'Dye-korte / lange oligos met Klenow DNA polymerase om dubbelstrengs DNA probes maken.
   1. Bereid de reactie door het mengen30 pi versmolten korte / lange oligos met 5'Dye tag, 8,5 ui 10X Klenow-buffer, 1,7 ui 10 mM dNTP's, 1,7 pl Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 U / pl) en 43,1 ul van DDH ₂ O in een 0,2 ml PCR-buis.
   2. Incubeer 60 min bij 37 ° C in een PCR-machine.
   3. Voeg 3,4 ul 0,5 M EDTA om de reactie en warmte inactiveren bij 75 ° C gedurende 20 minuten in een PCR-machine te stoppen.
5. Verdun ingevulde probes (0,7 uM) in STE voor uiteindelijke concentratie van 0,1 uM.
6. Store oligo's bij -20 ° C in het donker totdat klaar voor gebruik. Oligo mag maximaal maximaal een jaar bij deze aandoening.
   OPMERKING: Om DNA-probes met mutant bindingsplaatsen genereren mutant versies van lange oligonucleotiden worden gegloeid met 5'Dye-gelabelde korte oligonucleotiden, gevolgd door fill-in van 5 'overhangen met Klenow. Aangetoond is dat de sonde met één streng gelabeld met een infrarood fluorescerendekleurstof slechts 30% intensiteit van de probe met beide strengen gemerkt met de kleurstof. Als intensiteit van het signaal moet worden versterkt, zijn lang oligo's van beide strengen gelabeld met infrarood fluorescerende kleurstoffen op 5 'uiteinden en gehybridiseerd aan infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes te maken.

3. Voorbereiding van Unlabeled / Cold Probes (concurrenten)

Opmerking: Lange oligonucleotiden met complementaire sequenties (Long en LongR) werden gekoppeld aan ongelabelde probes te maken voor concurrentie-analyse met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes.

1. Meng 20 pl 100 pM Long, 20 pl 100 pM LongR oligonucleotiden en 60 ul STE in een 1,5 ml buis.
2. Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten, zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo's 's nachts af te koelen.

4. Binding Reaction en elektroforese

1. Bereid 1 ml 5x bindingsbuffer door 50 gl60, van 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 pl van 5 M NaCl; 200 pi van 1 M KCl, 5 pl 1 M _MgCl2, 10 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 pl 1 M DTT; 25 ui 10 mg / ml BSA, en 695 pl DDH ₂ O.
   OPMERKING: De 5x Binding Buffer kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C. Een ander punt van overweging is dat de verschillende transcriptiefactoren verschillende modificaties om de binding buffer zal hebben.
2. Vlak voor het opzetten bindingsreacties, voorlooptijd de 5% natieve polyacrylamidegel in 0,5x TBE + 2,5% glycerol om alle sporen ammoniumpersulfaat verwijderen bij 80 V gedurende 30-60 minuten, of totdat de huidige niet meer tijd varieert.
3. Stel de bindingsreactie in eindvolume van 20 pi.
   1. Meng 4 pl 5x bindingsbuffer 80-200 ng gezuiverd proteïne A (in 50% glycerol, dwz SOX-2), 1 pl 0,1 uM kleurstof geconjugeerd probe (eindconcentration: 5 nm) en DDH ₂ O.
   2. Facultatief: Als koud probe concurrenten nodig, voeg verschillende concentraties (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) koud probes.
   3. Optioneel: Wanneer de interactie tussen eiwitten A en B (dat wil zeggen, SOX-2 en LIM-4) getest, voeg 80-200 ng gezuiverde eiwit B (in 50% glycerol, dwz LIM-4).
   4. Facultatief: Als nucleair extract preparaat gebruikt waarbij specifieke binding van proteïne A worden bevestigd, voeg antilichaam specifiek voor proteïne A (dat wil zeggen anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incuberen bij R / T donker gedurende 15 min.
4. Laad alle van de binding reactie op de gel en laat de gel bij 10 V / cm tot gewenste afstand.

5. Imaging

OPMERKING: De gel werd direct gescand in de glasplaten een geavanceerd infrarood beeldvormingssysteem. Daarom kan de gel verder opgelost en herhaaldelijk gescand (figuren 1C en 2). Een nabij infrarood fluorescerend beeldvormingssysteem hoofdzakelijk voor Western blots werd ook getest om de gel te scannen, maar alleen de geavanceerde infrarood beeldvormingssysteem kon de gel met goede resolutie scannen. De beschreven methode is specifiek voor een bepaalde infrarood imaging software, hoewel andere softwarepakketten kunnen gebruikt worden.

1. Reinig het bed van de scanner met DDH ₂ O en goed laten drogen voordat u gaat scannen. Droogwrijven glasplaten van de gel en plaats de platen die de gel op de scanner bed.
2. Open de infrarood imaging software en ga naar het tabblad 'Acquire'. Wanneer de dunnere plaat (1 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 169 urn, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 1,5 mm. Wanneer de dikkere plaat (3 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 84 pm, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 3,5 mm. Focus gecompenseerd afhankelijk van dedikte van de glasplaat.
3. Selecteer het gebied dat de gel inneemt op de scanner. Klik op 'Start' om de scan te starten.
4. Herhaal elektroforese en bovendien nodig scannen.

Resultaten

Oranje G ladingskleurstof (6x: 0,12 g oranje G in 100 ml 30% glycerol) kan de bindingsreactie toegevoegd vóór het laden om de voortgang van de elektroforese zichtbaar. Overige laad- kleurstoffen zoals broomfenolblauw zal worden gedetecteerd tijdens het scannen en dus interfereren met beeldanalyse (Figuur 1B).

In sommige gevallen van EMSA's, vooral als nucleair extract preparaat gebruikt, poly-deoxyinosinic...

Discussie

fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA's met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd te...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is schadelijk en giftig.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) moleculaire biologie kwaliteit	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-gelabelde DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Aangepaste DNA oligo	Deze worden in het manuscript vermeld als '5'Dye-gelabelde of infrarood fluoresceine dye-gelabelde DNA oligos'. Het bedrijf zal 5' IRDye gelabelde-DNA oligonucleotiden op maat synthetiseren. Vereist minimaal 100 μM schaal synthese en HPLC zuivering.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'mini eiwit gel systeem'. Elk elektroforetisch systeem kan worden gebruikt zolang het glazen platen zijn van minder dan 25 cm x 25 cm in grootte.
Odyssey CLx Infrarood Imaging Systeem	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrarood Imaging Systeem	Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'geavanceerd infrarood imaging systeem'.
Odyssey Fc Imaging Systeem	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging Systeem	Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'nabij infrarood fluorescent imaging systeem voornamelijk voor Western blots'.
Image Studio software (versie 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'specifieke imaging software'.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange ladingsdye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA