We beschrijven een kader dat eenvoudige biochemische en computationele analyses combineert om de karakterisering en kristallisatie van grote coiled-coil-domeinen te begeleiden. Dit kader kan worden aangepast voor globulaire eiwitten of worden uitgebreid om een verscheidenheid aan hoogdoorvoertechnieken te integreren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het verkrijgen van kristallen voor structuurbepaling kan een moeilijke en tijdrovende onderneming zijn voor elk eiwit. Gespiraliseerde eiwitten en domeinen worden in de natuur overal aangetroffen, maar vanwege hun fysische eigenschappen en neiging tot aggregatie, worden ze traditioneel beschouwd als bijzonder moeilijk te kristalliseren. Hier gebruiken we een verscheidenheid aan snelle en eenvoudige technieken die zijn ontworpen om een reeks mogelijke domeingrenzen voor een bepaald gespiraliseerd eiwit te identificeren, en karakteriseren vervolgens snel het gedrag van deze eiwitten in oplossing. Met de toevoeging van een sterk fluorescerend label (mRuby2) is eiwitkarakterisering eenvoudig en rechtlijnig. Het doeleiwit kan gemakkelijk worden gevisualiseerd onder normale verlichting en kan worden gekwantificeerd met behulp van een geschikte imager. Het doel is om snel kandidaten te identificeren die uit de kristallisatiepijplijn kunnen worden verwijderd omdat ze waarschijnlijk niet zullen slagen, waardoor meer tijd wordt geboden voor de beste kandidaten en minder fondsen worden besteed aan eiwitten die geen kristallen produceren. Dit proces kan worden herhaald om informatie uit initiële screeningsinspanningen te integreren, kan worden aangepast voor high-throughput expressie- en zuiveringsprocedures en wordt aangevuld met robotische screening voor kristallisatie.
Inleiding
Structuurbepaling via röntgenkristallografie heeft fundamentele bijdragen aan elk gebied van de moderne biologie gemaakt; verschaffen van een atomaire aanzicht van de macromoleculen die het leven en hoe zij met elkaar in diverse situaties; zodat we de mechanismen die leiden tot de ziekte en het bieden van mogelijkheden om rationeel ontwerpen van geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte te begrijpen. Kristallografie is al lange tijd de dominante experimentele techniek voor het bepalen van macromoleculaire structuur, en op dit moment goed voor 89,3% van de structurele database (www.rcsb.org). Deze techniek heeft vele voordelen, waaronder de mogelijkheden voor h....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Een schema van het conceptuele raamwerk of workflow wordt beschreven in figuur 1 voor referentie. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier fasen: computational of sequentie gebaseerde voorspellingen, eiwitexpressie en zuivering, biochemische karakterisering en kristallisatie. De getoonde voorbeelden analyseren Shroom SD2 domeinen en / of Shroom Rock-complexen, maar kan worden gebruikt met elk eiwit.
1. Gebruik Gevestigde web-gebaseerde tools om Computational Voorspellingen van Coiled-coil Domain Grenzen Genereer
- Verzamel een Evolutionarily Diverse Set van Sequence Homologen.
- Ga naar www....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een diagram dat de werkstroom gebruikt in dit systeem wordt getoond in figuur 1 en omvat drie hoofdfasen. Geautomatiseerde analyse van de sequentie wordt gebruikt om hypotheses over het domein grenzen van het coiled-coil eiwit van belang te ontwikkelen. Een voorbeeld van een analyse van de geannoteerde Shrm2 SD2 domein is getoond in figuur 2. In dit diagram, was het doel om mogelijke domeingrenzen identificeren een geconserveerd domein aan de C-terminus .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven protocol is ontworpen om de gebruiker domein grenzen te identificeren in grote opgerold-coil eiwitten om hun kristallisatie te vergemakkelijken. Het protocol is gebaseerd op een holistische opname van verschillende gegevens van computersimulaties en andere bronnen om een reeks van potentiële domeingrenzen genereren. Deze worden gevolgd door een aantal biochemische experimenten die snel en goedkoop zijn, en worden gebruikt om deze eerste hypothese te verfijnen. Met deze aanpak kan de gebruiker snel t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidie NIH R01 GM097204 (APV en JDH). Financiering voor JHM werd geleverd door een HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
Referenties
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expressio....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
