Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Leaves

Samenvatting

Het kwantificeren van celdeling en expansie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei van hele planten. Hier presenteren we een protocol om cellulaire parameters te berekenen die de groeisnelheid van maïsbladeren bepalen en benadrukken we het gebruik van deze gegevens voor het onderzoeken van moleculaire groei-regulerende mechanismen door het richten van ontwikkelingsstadium-specifieke bemonsteringsstrategieën.

Samenvatting

Groeianalyses worden vaak gebruikt in de plantkunde om contrasterende genotypen en de effecten van omgevingscondities te onderzoeken. Het cellulaire aspect van deze analyses is van cruciaal belang, omdat groei wordt aangedreven door celdeling en celallenging. Kinematische analyse vertegenwoordigt een methodologie om deze twee processen te kwantificeren. Bovendien is deze techniek eenvoudig te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kinematische analyse in monocotyledonaire maïsbladeren (Zea mays). Twee aspecten worden gepresenteerd: (1) de kwantificering van celdelings- en expansieparameters, en (2) de bepaling van de locatie van de ontwikkelingszones. Dit zou kunnen dienen als basis voor ontwerp van bemonstering en/of zou nuttig kunnen zijn voor gegevensinterpretatie van biochemische en moleculaire metingen met hoge ruimtelijke resolutie in de bladgroeigebied. De groeizone van maïsbladeren wordt geoogst tijdens stationaire groei. Individuele bladeren worden gebruikt voor meristemlengtebepaling met behulp van een DAPI-kleurstof en cellengteverloop met behulp van DIC-microscopie. Het protocol is geschikt voor uitgekomen monocotyledonaire bladeren die tijdens stationaire groei worden geoogst, met groeizones die minstens enkele centimeters beslaan. Om het begrip van plantengroei-regulatie te verbeteren, moeten gegevens over groei en moleculaire studies worden gecombineerd. Daarom is een belangrijk voordeel van kinematische analyse de mogelijkheid om veranderingen op moleculair niveau te correleren met goed gedefinieerde stadia van cellulaire ontwikkeling. Verder maakt het een meer gerichte bemonstering van gespecificeerde ontwikkelingsstadia mogelijk, wat nuttig is in geval van beperkt budget of tijd.

Inleiding

Groei analyse is afhankelijk van een set van tools die vaak worden gebruikt door planten wetenschappers om genotype bepaald groei verschillen en / of fenotypische reacties op milieu-factoren te beschrijven. Ze beschikken over de grootte en het gewicht metingen van de hele plant of een orgaan en berekeningen van groeicijfers om de onderliggende mechanismen van de groei te verkennen. Orgaangroei wordt bepaald door celdeling en expansie op cellulair niveau. Daarmee ook de kwantificering van deze twee processen in groeianalyses is essentieel voor het begrijpen van verschillen in groei ¹ whole-orgaan. Bijgevolg is het cruciaal om een ​​geschikte methodologie ce....

Protocol

LET OP: De volgende protocol voor kinematische analyse is alleen geldig voor bladeren tijdens de groei van steady-state. Dit impliceert een stabiele blad reksnelheid en ruimtelijke patronen van cellengte en expansie in een blad gedurende enkele dagen ^6.

1. Plant Groei en Metingen van Leaf Rek Rate (LER)

1. Kies een blad in de groei steady-state en een ontwikkelingsstadium van belang.
   NB: Er is een verschil tussen de groei van steady-state en repetitieve groei, die soortgelijke ruimtelijke patronen houdt op achtereenvolgende bladeren op dezelfde as. Tijdens de vroege stadia van zaailingsgroei opeenvolgend....

Resultaten

Hier tonen we een vergelijking tussen goed bewaterd planten (controle, 54% bodem water inhoud, (SWC)) en planten blootgesteld aan droogtestress omstandigheden (droogte, 34% SWC) in termen van hun bladgroei. Alle planten werden gekweekt in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden (16 uur dag / 8 uur nacht, 25 ° C / 18 ° C dag / nacht, 300-400 μEm ^{-2 -1} sec fotosynthetisch actieve straling (PAR). De droogte werden opgericht door inhouding water totdat de jui.......

Discussie

Een volledige analyse van kinematische maïsblaadjes maakt de bepaling van de cellulaire basis van bladgroei en maakt het ontwerp van efficiënte bemonsteringsstrategieën. Hoewel het protocol is relatief eenvoudig is enige voorzichtigheid bij de volgende belangrijke stappen: (1) Het is belangrijk dat de jongere, afgesloten bladeren (stap 2,3) los te maken zonder beschadiging van de meristeem, aangezien meristeem lengte bepalen (stap 3) vereist een totale meristeem aanwezig te zijn. Wat oefening op voorhand nodig zou zijn........

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pots	Any	Any	We gebruiken potten met de volgende afmetingen, maar deze kunnen verschillen afhankelijk van de behandeling/studie: bodemdiameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, hoogte: 12 cm. We laten één maïsplant per pot groeien.
Plantsubstraat	Any	Any	We gebruiken potmedium (Jiffy, Nederland), maar andere substraten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandeling/studie.
Liniaal	Any	Any	Een uitbreidbare liniaal die minimaal 1,5 meter dekt, is nodig om de uiteindelijke bladlengte van de planten te meten.
Zaden	Any	NA	Zaden kunnen worden besteld bij een veredelaar.
Schelp	Any	Any	De schelp wordt gebruikt tijdens het oogsten van bladeren om het gewenste blad los te maken van de omringende bladeren en meteen na het oogsten om een goed monster te snijden voor metingen van cellengte en meristemlengte.
15 mL falconbuisjes	Any	Any	De 15 mL falconbuisjes worden gebruikt voor het opslaan van monsters die worden gebruikt voor cellengtemeten tijdens het verduidelijken van monsters met absoluut ethanol en melkzuur.
Eppendorfbuisjes	Any	Any	De eppendorfbuisjes worden gebruikt voor het opslaan van monsters die worden gebruikt voor meristemlengtemeten in ethanol:azijnzuur 3:1 (v:v) oplossing.
Handschoenen	Any	Any	Latex handschoenen, die beschermen tegen corrosief reagens.
Azijnzuur	Any	Any	VOORZICHTIG: Corrosief voor metalen, categorie 1 Huidcorrosie, categorieën 1A,1B,1C Ernstige oogbeschadiging, categorie 1; Ontvlambare vloeistoffen, categorieën 1,2,3
Absoluut ethanol	Any	Any	VOORZICHTIG: Gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), met de ogen (irriterend), door inademing. Licht gevaarlijk in geval van contact met de huid (permeator), van inslikken
Melkzuur>98%	Any	Any	VOORZICHTIG: Corrosief voor metalen, categorie 1 Huidcorrosie, categorieën 1A,1B,1C Ernstige oogbeschadiging, categorie 1
Natriumchloride (NaCl)	Any	Any
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Any	Any	VOORZICHTIG: Acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing), categorie 4 Huidirritatie, categorie 2 Oogirritatie, categorie 2 Huidsensibilisatie, categorie 1 Specifieke doelorgaantoxiciteit – Enkelvoudige blootstelling, categorie 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	Dit materiaal kan irriterend zijn, contact met ogen en huid moet worden vermeden. Inademing van stof kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken.
4′,6-Diamidine-2′-fenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Celpermeabele fluorescente minor groove-binding sonde voor DNA. Veroorzaakt huidirritatie. Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Kan luchtwegirritatie veroorzaken.
IJs	Any	NA	De DAPI-oplossing moet op ijs worden bewaard.
Fluorescentiemicroscoop	AxioScope A1, Axiocam ICm1 van Zeiss of andere		Elke fluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om de lengte van het meristem te bepalen.
Microscoopglaasje	Any	Any
Dekglaasje	Any	Any
Pincet	Any	Any	Pincet is nodig om het opgerolde maïsblad direct na het oogsten uit te vouwen om een goed monster te snijden voor metingen van cellengte en meristemlengte.
Beeldanalysesoftware	Axiovision (Release 4.8) van Zeiss	NA	De software kan worden gedownload op: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Andere software zoals ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kan ook worden gebruikt.
Microscoop uitgerust met DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 van Zeiss of andere		Elke microscoop, uitgerust met differentieel interferentie contrast (DIC), kan worden gebruikt om cellengtes te meten.
R statistische analysesoftware	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Kan worden gedownload op https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We gebruiken de kernel smoothing functie locpoly van de Kern Smooth-pakket (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). Het script is beschikbaar voor Mac en Windows op verzoek bij de corresponderende auteur.