Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren Drosophila Larvale Crawling Behavior

Samenvatting

De Drosophila larven is een krachtig modelsysteem om neuronale controle van gedrag te bestuderen. Deze publicatie beschrijft het gebruik van lineaire agarose kanalen om aanhoudende aanvallen van lineaire kruipen en methoden te lokken om de dynamiek van larvale structuren te kwantificeren tijdens repetitieve kruipen gedrag.

Samenvatting

Drosophila larven kruipen is in opkomst als een krachtig model voor neurale controle van sensomotorische gedrag te bestuderen. Echter, larven kruipen gedrag op een vlakke ondergrond geopend is complex, met inbegrip van: pauzeren, draaien en kronkelen. Deze complexiteit in het repertoire van beweging belemmert gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens een enkele kruipen stap cyclus. Om dit obstakel te overwinnen, werden lineaire agarose kanalen gemaakt dat larvale gedrag recht, duurzame, ritmische kruipen beperken. In principe, omdat agarose kanalen en de Drosophila larven lichaam zowel optisch helder, de beweging van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes kan worden gevolgd in intacte, vrij bewegende larven. In het verleden werden larven in lineaire kanalen geplaatst en kruipen op het niveau van hele organisme, segment, en spier werden geanalyseerd ^1. In de toekomst kan larven kruipen kanalen worden gebruikt calcium imaging neuro bewakennal activiteit. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden gebruikt met larven van elke genotype en eventuele-onderzoeker ontworpen kanaal. Waardoor het protocol hieronder is breed toepasbaar voor studies op de Drosophila larven als model motorbesturing begrijpen.

Inleiding

Het algemene doel van deze methode is om Drosophila larven kruipen in detail te bestuderen. Experimenten op motoriek hebben een belangrijke rol in het ontwikkelen en testen van theorieën over motorische controle ² gespeeld. Traditioneel motoriek is onderzocht bij waterdieren (bv, bloedzuiger, lamprei, kikkervisje) ^3. Het repetitieve karakter van de motoriek bij deze dieren is toegelaten voor de studie van rhythmogenesis, voor de analyse van de biofysische evenementen rijden motoriek, en voor het bewaken van de neurale afvuren patronen die de motoriek te begeleiden.

Het gebruik van Drosophila larven voor studies van beweging een unieke combinatie van voordelen boven andere modelsystemen: facile genetica, goed gekarakteriseerde ontwikkeling, een orgaan dat optisch helder in eerste en tweede stadia, en een voortdurende transmissie elektronen microscopische reconstructie van de gehele zenuwstelsel ^4-6. Echter, Drosophila larvale locomotion op een vlakke ondergrond geopend is enigszins complex met inbegrip van pauzes, draaien, en meanderende kruipt ^7. Deze publicatie geeft een methode om lineaire agarose kanalen gebruiken om Drosophila larvale locomotorisch gedrag te begeleiden, zodat de larven voeren volgehouden, recht, ritmische kruipen gedrag.

Bestuderen Drosophila larven gedrag agarose kanalen, in plaats van gedrag vlakke oppervlakken geopend, heeft verschillende voordelen. Ten eerste kunnen onderzoekers eerst selecteren crawlgedrag uit de vele bewegingen die deel uitmaken van de larvale gedragsrepertoire. Ten tweede, door het aanpassen van de breedte van het kanaal ten opzichte van de larvale lichaamsgrootte, stapvoets kan worden aangepast. Derde kanalen zorgen voor de larve wordt vanuit dorsale, ventrale of laterale afhankelijk van de larve is geplaatst en georiënteerd binnen het kanaal. Deze veelzijdigheid in larvale oriëntatie zorgt voor een structuur van belang om voortdurend zichtbaar tijdens het kruipen zijn. Vierde,kanalen zijn vatbaar voor gebruik met een groot aantal microscopen en doelstellingen. Zo kan bijvoorbeeld de lineaire kanalen worden gebruikt voor lage-resolutie beeldvorming over bright-field stereoscopen en / of voor hoge-resolutie beeldvorming over spinning-disk confocale microscopen ^1. Ten vijfde kan deze werkwijze worden gebruikt in combinatie met optogenetic / thermogenetische neuronale handelingen met genetische achtergrond. Tenslotte, omdat zowel de larvale lichaam (in eerste en tweede stadia) en agarose kanalen optisch helder, kanalen kunnen worden gebruikt bij het bestuderen van de dynamische bewegingen, of veranderingen in fluorescentie-intensiteit van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes.

De beschreven methode is geschikt voor gedetailleerde kinematische studie van de eerste en tweede instar Drosophila larvale gedrag. Deze publicatie analyseert de dynamische veranderingen in fluorescentie-intensiteit van het centrale zenuwstelsel tijdens de voorwaartse larven kruipen op het gebruik van kanalen te tonen en als een voorloper van NeuRonal calcium imaging.

Protocol

1. Bereiding van Larven

1. Een week voor het opnemen van het gedrag, het opzetten van een kruis (minimaal 25 maagden en 5 mannen). Onderhouden van alle kruisen en nageslacht bij 25 ° C.
   LET OP: De temperatuur van kweekomstandigheden kan worden gewijzigd, maar de tijdslijn hieronder beschreven nodig zou hebben voor veranderingen in de ontwikkelingspsychologie snelheid aan te passen om rekening te houden.
2. 5 dagen voor de opname, het eerste wat in de ochtend, zet het kruis in een verzameling kooi met een agar / sap pet en een schar (0,5-1 ml) van gist deeg in het midden van de agar / sap cap.
   1. Om een ​​verzameling kooi te maken, porren gaten in een 6 oz. vierkant polyethyleen Drosophila fles.
   2. Om agar / sap caps te maken, meng 18 g agar met 600 ml water in een conische kolf. In een afzonderlijke kolf mix 20 g sucrose met 200 ml appelsap. Magnetron totdat vaste stoffen worden opgelost. Combineer en roer, zodat het mengsel afkoelen tot 60 ° C. Voeg 20 ml 10% methyl-p-hydroxybenzoaat in 95% ethanol en roer. Voeg ~ 7ml om de onderste helft van een 35 x 10 mm rond petrischaal. Toestaan ​​agar / sap stollen gedurende 1 uur bij KT. Bewaren bij 4 ° C.
   3. Gist pasta te maken, voeg gelijke delen door volume droge gist en water. Bewaren bij 4 ° C.
3. Controleer de gezondheid van larvale collecties.
   1. In de ochtend, 4 en 3 dagen voor het opnemen, verwijder de dop en plaats een nieuwe dop op de kooi. Verander de doppen op hetzelfde tijdstip elke dag om 24 uur verzamelen van eieren en pas uitgekomen larve te krijgen.
   2. Na elke kap is verwijderd, te onderzoeken om te zien hoeveel eieren het kruis leggen. Verwacht tussen 500-2,000 eieren. Pas het aantal volwassenen, indien nodig.
      OPMERKING: Een paar eieren zou zijn uitgekomen in larven, en de pas uitgekomen larven uit de buurt van de gist pasta te vinden.
   3. Ouder worden elke cap voor 24 uur. Opnieuw te onderzoeken de dop om te bepalen of larven zijn gezond.
      LET OP: De meeste eieren moeten zijn uitgekomen in larven, en de larven moeten kroop in de yeast plakken. Tekenen van slechte gezondheid onder meer een groot aantal unhatched eieren, larven dode lichamen uit de buurt van de gist plakken en larven met aanzienlijke donkere vlekken in de buik, met vermelding van een immuunreactie. Als larven zijn ongezond, veranderen de kooi, maak verse caps / gist plakken, en controleer het genotype.
   4. Gooi de oude caps.
4. Verzamel larven voor gedragsverandering opnames.
   1. Op beide 2 en 1 dag vóór de opname, verwijder de dop en te vervangen door een nieuwe kap.
   2. Label elke verwijderd eraf en bewaar bij 25 ° C. Dit zal een gefaseerde reeks van larven voor gedragsverandering opnamen te produceren. Larven van Nieuw-gearceerd (0-4 uur posthatch) tot tweede instar-stadium (24-48 uur posthatch) kan worden gebruikt in de kanalen. Bewaar caps voor opnames op opeenvolgende dagen.
   3. Gooi alle caps na 48 uur.
   4. Indien nodig, herhaalt u de stappen 1.4.1-1.4.3 voor maximaal 5 extra d. Daarna minder bevruchte eieren.

2. Voorbereiding van de kanalen

1. Bereid de lineaire kanaal PDMS (polydimethylsiloxaan, een silicone-elastomeer) gietmal (Figuur 1A). PDMS gietvormen zijn verkrijgbaar bij de Heckscher lab op aanvraag.
   1. Maak de gietmal met isopropylalcohol. Drogen aan de lucht, dep droog met laboratorium doekjes, of gebruik ingeblikte lucht.
   2. Plaats de gietmal in een 10 cm petrischaal deksel of andere houder.
2. Bereid en giet agarose oplossing.
   1. Voeg een 3% agarose-oplossing in water (3 g in 100 ml) van de magnetron totdat het volledig opgelost.
   2. Koel af tot 55 ° C, waardoor luchtbellen stijgen naar het oppervlak.
   3. Giet de agarose mengsel in de petrischaal met de gietvorm, zodat de mal gewoon bedekt is. Laat agarose set tot gestold.
3. Verwijder de agarose kanalen van de gietmal. Maak de randen van de agar plaat met een scheermesje.
   1. Zet het kanaals in een 10 cm petrischaal ondergedompeld in water. Ze kunnen bij 4 ° C gedurende 7 dagen houdbaar.

3. Het laden van een larve in een kanaal naar Record Behavior

LET OP: Als het opslaan van kanalen bij 4 ° C, laat kanalen RT te komen voordat u voor gedragsverandering opname.

1. Gebruik een schoon scheermesje een enkel kanaal van die bereid in Stap 2 (Figuur 2A) gesneden.
2. Gebruik een pincet om het kanaal gegroefde-side-up op een glazen dekglaasje (Figuur 2B) te plaatsen. De grootte en dikte van het dekglaasje afhankelijk van de specifieke ruimte voor beeldvorming.
3. Gebruik fijne tang om een larve van de agar / sap cap bereid in stap 1 te selecteren en te plaatsen in de snede kanaal (figuur 2C).
   1. Laat de larve niet knijpen. Pak het op voorzichtig met de punt van de tang tand. Het is ook mogelijk om larven te manipuleren met een penseel met een fijne punt.
      LET OP: Dit is belangrijk omdat larven zijn zeer senSitive aan te raken. Indien zij niet met de nodige zorg kan nociceptieve respons hun gedrag domineren tijdens de eerste seconden van het experiment.
   2. Was de larven door ze kort onder te dompelen in water.
   3. Na het plaatsen van de larve op de cut-kanaal, met de punt van de tang tand om voorzichtig te plagen de larve in het kanaal bosje.
      NB: Voor de meeste toepassingen de breedte van de larve en de breedte van het kanaal moet overeenkomen. De gemiddelde breedte van de larven in verschillende stadia van ontwikkeling volgt: 0 uur posthatch - 140 urn, 24 uur posthatch - 180 urn, 48 uur posthatch - 320 urn, 72 hr posthatch - 500 urn, 96 hr posthatch - 750 urn ^8. Kanalen komen in de volgende breedtes: 100, 150, 200, 250, en 300 pm, en alle kanalen zijn 150 um diep.
   4. Gebruik de punt van een tand forceps of kwast om de positie van de larven in het kanaal. Het kan worden georiënteerd in een richting: ventraleup, ventrale omlaag, ventraal ene kant, afhankelijk van wat structuur af te beelden.
4. Met behulp van een tang voorzichtig flip het kanaal over zulke dat de larve is nu op de cover glas. Plaats een of twee druppels water op de uiteinden van de goot, zodat het vult met water (figuur 2D).
   1. Til de zijkanten van het kanaal om eventuele luchtbellen te verwijderen.
   2. Stel de oriëntatie van de larven. Om dit te doen, zacht duwtje het kanaal, maar niet de dekking van glas om de larve te rollen. Als dit de richting niet verandert, verwijder het deksel glas en pas larvale positie. De larve is klaar om te worden afgebeeld.
   3. Afbeelding van het kanaal / dekglaasje op een omgekeerde microscoop. Als beeldvorming op een rechtopstaande microscoop, gewoon omkeren van het kanaal / dekglaasje.

4. Meet Kenmerk van Belang in Behavioral Recording

1. Voor een structuur van belang (bijvoorbeeld, staart, CNS), het meten van een kenmerk van belang (bijvoorbeeld, Fluorescentie-intensiteit, locatie) na verloop van tijd.
   LET OP: Structuren zoals de kop en de staart kan handmatig worden geannoteerd. Zo kan het hoofd worden geïdentificeerd als die donkere H-vormige mond haken, en de staart kan worden geïdentificeerd als die posterior tracheale spiricles. Dit artikel richt zich op de zenuw snoer. Gebruik de neuronale GAL4 lijn Elav-GAL4 een UAS-myr-GFP transgene (Elav> GFP) ^9,10 rijden naar fluorescent label het centrale zenuwstelsel (CNS). De CNS bevat twee voorste hersenen lobben aan de zenuwkoord, die zich uitstrekt naar de achterste (figuur 3).
2. Meet de pixel intensiteit van de zenuwkoord (f _(NC)) op elk tijdstip (t). Hieronder wordt een handmatige annotatie benadering, maar deze stap kan worden geautomatiseerd.
   1. In Fiji (of vergelijkbare software) in het menu 'Analyseren' gebruiken 'Set Metingen ... "dialoogvenster om de gemiddelde grijswaarde en slic rapporterene positie.
   2. Handmatig trekken een doos in het midden van de zenuw snoer in het eerste frame van de film (figuur 3). Deze stap kan ook worden geautomatiseerd met beeld segmentatie en registratie algoritmes.
   3. Gebruik de opdracht "Measure" in het menu 'Analyseren' om de gemiddelde pixel intensiteit rapporteren in de boxed regio van belang. Dit levert een venster "Resultaten".
   4. In het volgende frame, met de hand de doos verplaatsen zonder verkleinen met behulp van de pijltjestoetsen. Gebruik de opdracht "Measure" weer. De bijgewerkte resultaten worden weergegeven in het venster "Resultaten". Herhaal deze stap voor elk frame van belang.
   5. Sla de "resultaten" met behulp van de 'opslaan als ...' in het menu Bestand. De resultaten zullen worden geëxporteerd als een .xls-bestand.

5. Analyseer de Metingen

1. Normaliseren elke f _(NC) op een waarde tussen 0 en 1 (z _(t) </ Em>).
   1. In spreadsheet (of een ander programma), opent u het Results.xls bestand. Dit bestand zal twee kolommen vertegenwoordigen framenummer en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit hebben.
   2. Voeg een nieuwe kolom en worden de formules z _(t) = f _{(NC [t])} -min _{(f [NC])} / max _{(f [NC])} -min _{(f [NC])} een genormaliseerde fluorescentie op te wekken overeenkomend met elk tijdstip.
2. Bepaal de stride periode voor elke stap in de opname.
   LET OP: Een stap cyclus is de eenheid van repetitieve hele lichaam ontwerpresolutie vooruit (en omgekeerd) kruipen. Volgens afspraak een voorwaartse stap begint (en eindigt) met de voorwaartse beweging van de staart, het hoofd, en andere inwendige organen, zoals de darm of CNS ^1.
   1. Handmatig controleren de gedrags-opname en noteer de initiatie tijden (i) van elke stap (i _{(Stride Cycle [n])).}
      LET OP: In het onderstaande voorbeeld, voorwaartse bewegingvan het CZS zoals de opening van een stap cyclus werd gebruikt (figuur 3).
   2. Voor elke stap het berekenen van de periode: Δ t _{(Stride cyclus) =} i _{(Stride Cycle [n + 1])} -I _{(Stride Cycle [n]).}
3. Bereken percentage stap cyclus verstreken voor elk tijdstip van de opname.
   1. Maak een extra kolom in de spreadsheet bestand wat neerkomt op tijd die verstreken is sinds de start van een stap cyclus (c). Stel keer sinds stride initiatie tot nul bij het begin van elke stap (c _{(Stride Cycle [n])} = 0). Pas keer na aanvang daarvan.
   2. Maak een extra kolom in de spreadsheet bestand wat neerkomt procent stride cyclus verstreken (% stride cyclus) Verdeel aangepaste tijden door stride periode en vermenigvuldig met 100 om te zetten naar percentage van stride cyclus verstreken.% Stride cyclus = (c _{(Stride Cycle [n] ))} / (Δ t ₍Stride cyclus) * 100).

6. Genereer Poolcoördinaten staanpaaltsen Dynamica van Structuren van belang vertegenwoordigen meer dan de Crawl Cycle

1. In MATLAB, gebruik de dialoog van de 'Import Data' in het tabblad Start om de bijgewerkte Results.xls importeren.
2. Maak een nieuwe array "Theta" bevatten procent stride cyclus waarden (% stride cyclus). ( "Theta = Var1" waarbij Var1 vertegenwoordigt% stride cyclus).
3. Maak een nieuwe array "Rho" bevatten genormaliseerde fluorescentie-waarden (z _(t)). ( "Rho = Var2" waarbij Var2 vertegenwoordigt z _(t)).
4. Gebruik de opdracht 'polarplot om poolcoördinatensysteem plots te maken met het percentage stride cyclus als de hoek, en de fluorescentie als de straal ( "polarplot (Theta, Rho)").

Resultaten

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het geleiden Drosophila larven gedrag middels agarose kanalen en voor het meten van de dynamiek van larvale structuren over een cyclus kruipen. Larven in lineaire kanalen voeren aanhoudende aanvallen van ritmische kruipen (figuur 3). Omdat zowel larven en kanalen zijn optisch helder, kunnen kanalen worden gebruikt met larven uitdrukken fluorescerende probes uitgedrukt in een structuur van belang. We namen larven die GFP ...

Discussie

Een microfluïdische apparaat werd gebouwd om lineaire agarose kanalen die geschikt zijn Drosophila larven (figuur 1) te maken. Bij Drosophila larven in deze lineaire agarose kanalen geplaatst zijn gedragsrepertoire beperkt tot kruipen, waardoor gedetailleerde observatie van de dynamiek van larvale structuren via kruipen cyclus.

Een opname op wanneer een larve voeren een reeks ritmische stappen (Figuur 3). Als dit niet gebeurt, controleer hi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6 oz vierkante Drosophila fles	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sucrose	sigma	S9378
appelsap			niet uit concentraat
Tegosept	Fisher	T2300	methyl-p-hydroxybenzoaat
35 x 10 mm ronde petrischaal	Fisher	351008
bakker's gist
PDMS-gietvorm	FlowJem		kan worden aangevraagd bij auteurs
Isopropyl alcohol	Fisher	A417-1
laboratoriumdoekjes	Fisher	06-666-11
blikken lucht	Fisher	18-431
10 cm petrischaal	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
scheermesjes	Fisher	12-640
tang	FST	11241-40
22 x 40 dekglas, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (versie 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com