Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Summary

We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.

Abstract

Optogenetische systemen maken gebruik van genetisch gecodeerde eiwitten die conformatie veranderen als reactie op specifieke golflengten van licht om cellulaire processen veranderen. Er is behoefte aan het kweken en meetsystemen die gebruik geprogrammeerd verlichting en stimulering van optogenetic systemen. We presenteren een protocol voor het bouwen en gebruiken van een continue kweekapparaat microbiële cellen met geprogrammeerde doses van licht verlichten en automatisch verkrijgen en afbeeldingen van cellen in het effluent geanalyseerd. De werking van deze inrichting een chemostat kan de groeisnelheid en de cellulaire omgeving goed te regelen. Het effluent van de continue celkweek wordt regelmatig bemonsterd en de cellen worden afgebeeld door multi-channel microscopie. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties in de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van de cellen in de steekproef uit de kweek effluent worden gemeten over meerdere dagenzonder gebruikersinvoer. We tonen de bruikbaarheid van deze kweken inrichting door het dynamisch induceren eiwitproductie in een stam van Saccharomyces cerevisiae vervaardigd met een optogenetic systeem dat transcriptie activeert.

Introduction

Optogenetische systemen gebruiken licht om een groeiende lijst van cellulaire processen, waaronder genexpressie, ^{1, 2, 3, 4, 5} eiwit lokalisatie, ⁶ eiwitactiviteit, ^{6, 7, 8} eiwitbinding, ^{8, 9, 10} en eiwitafbraak controleren. ¹¹ Werkwijze voor het kweken van cellen in een gecontroleerde omgeving met geprogrammeerde optische stimulatie en het meten van hun reactie op biologisch relevante tijdschalen moet het potentieel van deze instrumenten benutten voor onderzoek in de celbiologie en biotechnologie. Onze methode maakt gebruik van chemostatische een constante celgroei handhaven in een goed gemengde, aegewaardeerd en temperatuurregeling glazen kweekvat ^{12, 13} dat is blootgesteld aan verlichting geprogrammeerd. We afbeelding individuele cellen in de kweek effluent met een omgekeerde microscoop om de respons van de cultuur geprogrammeerde belichting te meten. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van het effluent celkweek kan worden gemeten over meerdere dagen zonder input van de gebruiker.

Dit protocol kan in de meeste laboratoria vertrouwd groeiende celkweek en microscopie uitgevoerd, en de gebruikte apparatuur is goedkoop en van gemakkelijk beschikbare componenten. Een transparante kweekvat wordt boven een matrix van licht-emitterende diodes (LEDs) kan uitzenden 1 uW / cm ² -10 mW / ^cm2 licht geplaatst. Microben worden gekweekt in het kweekvat continu; een peristaltische pomp wordt gebruikt om media aan deverdunning, andere wordt gebruikt om de cultuur intrekken een lager aan de microscoop, en het verschil ontsnapt via een overloop. Een verwarmingselement handhaaft de temperatuur. Lucht wordt continu gepompt in het kweekvat om een ​​positieve druk te handhaven en te mengen en beluchten cultuur. Met uitzondering van de luchtpomp, wordt het vermogen deze worden geregeld door een microcontroller die ook ontvangt input van een thermometer en een aangesloten computer. Het effluent celkweek wordt gepompt naar een microfluïdische apparaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Non-tl en tl-beelden worden automatisch overgenomen. De cellen in de afbeeldingen worden gekenmerkt door een algoritme dat elke cel lokaliseert een interessegebied (ROI) en meet de eigenschappen van elke ROI.

Als u een toepassing van dit protocol aan te tonen, we meten de respons op wisselende lichtintensiteiten van Saccharomyces cerevisiae cellen ontworpen met een blauw licht verantwoorve optogenetic systeem dat de transcriptie van fluorescerend eiwit regelt. S. cerevisiae, algemeen bekend als bakkersgist, werd geselecteerd omdat meerdere optogenetic systemen voor het reguleren van genexpressie in dit systeem bestaan ^{14, 15, 16.} Bovendien is deze modelorganisme gebruikt voor studies in systeembiologie ¹⁷ en een chassis voor biotechnologische toepassingen ^{18, 19, 20.} De representatieve resultaten tonen aan dat dit protocol kan worden gebruikt om transcriptie van een kweek over meerdere dagen regelen door het variëren ingang lichtintensiteiten en het meten van de productie van een fluorescerende reporter.

Protocol

Figuur 1: De continue kweken apparaat. Deze vereenvoudigde diagram toont hoe de inrichting moet worden gemonteerd bij gebruik cultuur, verlichten, en meet de optische eigenschappen van de microben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van het protocol. De stappen in het gearceerde gebied moet worden herhaald telkens wanneer het protocol wordt gebruikt. Closed loop control is mogelijk ^34, maar is niet in dit protocol uitgevoerd.

1. Monteer de Thermometer aan de Raad van de Kring

Figuur 3: Verbindingen met thermometer waarden te lezen. Deze grafiek toont hoe de digitale thermometer moet worden aangesloten op de printplaat zodat de microcontroller feedback aan de temperatuur van de kweek controle te krijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Soldeer de Ground, Data, en positieve spanning lijnen van de digitale thermometer aan hun respectieve doorgaande gaten gemarkeerd "GD + V."
2. Knip een pin van een vrouwelijke 3-pin header en trim de resterende 2 pinnen met draad clippers, zodanig dat het past in de twee doorlopende gaten met het label "R2" en de microcontroller niet belemmeren. Soldeer deze op zijn plaats. Sluit de twee gesoldeerde pinnen door het invoegen van een 4,7 kOhm weerstand in de pin header.

2. Sluit de Power-Control Componenten naar het Circuit Board

Figuur 4: Aansluitingen aan de macht te controleren om de verwarming pad. Deze figuur toont hoe de printplaat en toebehoren worden gemonteerd om vermogensbesturing het verwarmingselement. De onderdelen ter controle van de peristaltische pompen worden op soortgelijke wijze verbonden. Merk op dat de componenten van de thermometer zijn verwijderd voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Snijd 1 cm uit de pennen van vijf vrouwelijke 3-pin headers. Soldeer deze naar de posities op de printplaat (PCB) gemarkeerd als "# 1", "# 2," "# 3", "# 4" en "CB E."
2. Snijd 1 cm uit de pennen van een vrouwelijke 6-pin en 8-pin header. Soldeer deze naast elkaar tede kolom van doorgaande gaten gelabeld K1 tot K14.
3. Sluit de verwarming pad op de printplaat.
   1. Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K1 en K2 op de printplaat. Plaats een metaal-oxide-halfgeleider veldeffecttransistor (MOSFET) in de positie aangeduid # 1 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten zodat de bron pin dichtst bij de "# "label en de afvoer pin verst van de" # "label.
   2. Snijd de grond lijn van de 5 V gelijkstroom (DC) voedingskabel en sluit deze aan J2. Sluit de grond lijn van de verwarming pad te J1. Sluit K3 naar pin 3 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J1 tot J2 wanneer pen 3 is ingesteld op + 5V.z
      LET OP: De weerstand / MOSFET set fungeert als een schakelaar die stroom maakt van pin J1 te stromen naar J2 als pin 3 van de microcontroller is ingesteld op 5 V.
4. Aansluitende trage peristaltische pomp.
   1. Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K4 en K5 op de printplaat. Plaats een MOSFET in de positie aangeduid # 2 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten zodat de bron pin dichtst bij de "#" label en de afvoer pin verst van de "#" etiket.
   2. Snijd de grond lijn van de 12 V DC voeding kabel van de trage peristaltische pomp. Sluit de peristaltische pomp tegenover eind aan J3 en de muur wrat geconfronteerd einde aan J4. Sluit K6 naar pin 4 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J3 naar J4 wanneer pen 4 is ingesteld op 5 V.
5. Sluit de snelle peristaltische pomp
   1. Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K7 en K9 op de printplaat. Plaats een MOSFET in de positie aangeduid # 3 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten s o de bron pin dichtst bij de "#" label en de afvoer pin verst van de "#" label.
   2. Snijd de grond lijn van de 12 V DC voeding kabel van de snelle peristaltische pomp. Sluit de peristaltische pomp tegenover eind aan J5 en de muur wrat geconfronteerd einde aan J6. Sluit K9 aan pin 5 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J5 tot J6 als pin 5 is ingesteld op 5 V.

3. Sluit de LED Matrix aan de Raad van de Kring

Figuur 5: Verbindingen met de LED-matrix te regelen. Deze figuur toont hoe de LED matrix moet worden aangesloten op de printplaat. Het toont ook aan dat de printplaat kan worden gestapeld op de microcontroller. Merk op dat de componenten van de thermometer en de controle gelijkspanning naar andere inrichtingen voor de duidelijkheid verwijderd.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Soldeer de 6-pins 10-pin en de twee 8-polige headers in de doorgaande gaten aan de zijkant van de printplaat, zodat het kan worden gestapeld bovenop de microcontroller.
2. Soldeer de 100 nF en de 10 uF condensatoren om hun gemarkeerde plaatsen op de printplaat, en merkt op dat de negatieve pool van de 10 uF condensator (kortere) moet worden aangesloten op het doorgaande gat gemarkeerd met een negatief teken.
3. Soldeer de LED bestuurder de 2 door 12 set van doorgaande gaten, met de inkeping op de bestuurder ver van de doorgaande gaten gereserveerd voor de LED-matrix.
4. Soldeer 2 kolommen van de mannelijke pin headers aan de doorgaande gaten gemarkeerd voor de LED-matrix, en trim de uiteinden van deze onder de broodplank zodanig dat zij de microcontroller niet zal belemmeren. Sluit deze aan op twee 8-draads strips van vrouwelijke / jumper draden vrouw. Sluit een tweede set van mannelijkespeldkopballen naar de andere kant van de draadbruggen.
5. Plaats de LED-matrix over de mediaan van de broodplank, en plaats de tweede set pin headers om de kolommen aan beide zijden van de matrix. Zorgen dat de elektrische aansluitingen zijn hetzelfde alsof de LED matrix die rechtstreeks zijn verbonden met de printplaat met het label van de matrix die overeenkomt met de gedeclareerde kolom van doorgaande gaten.
6. Knip een pin van een vrouwelijke 3-pin header en trim de resterende 2 pinnen met draad clippers, zodanig dat het past in de twee doorlopende gaten met het label "R1" en de microcontroller niet belemmeren. Solderen dit. Sluit de twee gesoldeerde pinnen door het invoegen van een 1 kOhm weerstand in de pin header.
   Opmerking: De kweekvat wordt gestapeld op de LED-matrix. Als de draad linten belemmeren het schip, compenseren ze uit de matrix. Gebruik vervolgens massieve kerndraad om de kloof tussen de pennen en de matrix aderige pennen, zodanig dat de elektrische aansluitingen niet ch overbruggenange.

4. Installeer Software en Verbinden met Hardware

1. Stapel de printplaat de microcontroller.
2. Volg de links in de lijst met materialen om de Integrated Development Environment (IDE) en aangepaste code te downloaden voor de microcontroller.
3. Sluit de microcontroller aan de microscoop computer via een AB-Universal Serial Bus (USB) kabel. Compileren en uploaden van de aangepaste code naar de microcontroller.
4. Download Micro-Manager ^{21, 22} en ²³ FIJI. Configureren Micro-Manager als FIJI plugin door het kopiëren van alle 'dll' bestanden, de map "mmplugins" en de "mmautofocus" directory van de map waarin Micro-Manager in de directory "Fiji.app" werd gedownload. Ook, kopieert u de "plugins / Micro-Manager" directory in de directory "Fiji.app/plugins".
5. Download de "BioreactorController.jar" bestand into de directory "Fiji.app/mmplugins".
6. Open Micro-Manager van Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Gebruik de Hardware Configuration Wizard om de software aan de microscoop te configureren. Neem de "FreeSerialPort" device in de wizard met het label van de poort waarop de AB USB-kabel is aangesloten.

5. Zorg en karakteriseren van de Light-proof behuizing voor de kweekvat

1. Stack drie 8-pins IC sockets als bouwstenen op breadboard op elke hoek van de LED-matrix zodat het kweekvat daarop kunnen rusten boven de matrix.
2. Bevestig een gedeelte van diffusie papier onder de toplaag van de bussen, zodat het licht dat het kweekvat van de LED-matrix diffuus.
3. Knip drie 8 "door 6" gedeelten van zwarte foam. Snijd een gedeelte dat dezelfde grootte als de elektronische breadboard (2,3 "x 3,5") vanaf de binnenzijde van de eerste two en een gedeelte dat de grootte van de rechthoek die de IC sockets (0,9 "x 1,8") vanaf de binnenzijde van de derde. Stapel lagen die via LED matrix zodanig dat de uiteindelijke laag met de 0,9 "x 1,8" opening ligt zelfs met de bovenkant van de IC sockets en omgeeft de LED-matrix.
4. Snij een extra blad van zwarte foam in de helft van een 6 "met 24" rechthoek te maken. Rol dit in een holle kolom van zwarte schuim dat de kweekvat kan passen in met ruimte voor buizen en draden, zodanig dat het thermisch en optisch zal isoleren de kweekvat.
5. Centreer de holle kolom van zwart schuim over de LED-matrix en markeer de grens van de kolom op de laag zwarte foam eronder. Deze grens zal in het teken waar het zou moeten worden gecentreerd in de toekomst.
6. Knip een 3 "x 3" deel van de zwarte schuim. Gebruik later als deksel dat kan worden geplakt is aan de top van de kolom extern licht te blokkeren.
7. Bevestig de fotodiode stroom sensor aan Th e kweken cap schip met tape, hechten de dop en plaats de kweekvat in de behuizing.
8. In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de matrix te verlichten op een subset van het bereik van mogelijke intensiteiten bij 30 s intervallen.
9. Noteer de lichtintensiteiten zoals weergegeven op de power meter console aangesloten op het elektriciteitsnet sensor. Deze metingen mogelijk maken dat de werkelijke lichtintensiteit aan te duiden wanneer het aantal LEDs die verlicht en de pulsbreedte gemoduleerde (PWM) stroom naar de LEDs wordt ingesteld.

6. Bereid de kweekvat

Figuur 6: Schip verbindingen. Deze grafiek toont hoe het vaartuig leidingen van de inrichting moet worden verbonden alvorens te worden geautoclaveerd.blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Markeer de hoogte die overeenkomt met elk 2 ml toename van vloeistof in het gebied van 10 ml tot 30 ml in het kweekvat. Plaats 10 ml steriel gedemineraliseerd water, markeert het waterpeil, voeg 2 ml, markeert het waterpeil, en herhaal tot het 30 ml niveau wordt gemarkeerd. Bedek de markeringen met doorzichtige tape, zodat ze zijn niet gemakkelijk te verwijderen en afvoeren van de vloeistof.
2. Plaats het lange einde van de aluminium-poort door de siliconen pakking, in het kweekvat. Schroef de dop.
3. Betrekking hebben op een korte aluminium poort uitlaat met 1/16 "ID siliconenslang. Sluit het distale uiteinde door het inbrengen van een vrouwelijke luer lock en vervolgens verbinden van een mannelijke luer lock aansluiting. Deze aanvullende uitlaat, en wordt niet gebruikt (buis 6 in figuur 6 ).
4. Sluit twee korte segmenten van 1/16 "ID silicone met mannelijke en vrouwelijke Luer sloten. Sluit het ene uiteinde van een korte aluminium poort stopcontact en steek de distal end met een mannelijke luer en vrouwelijke Luer lock plug. Het schip wordt geïnoculeerd door deze buis (tube 7 / 7,1 in figuur 6).
5. Verbinden twee 1/16 "ID buizen naar de uiteinden van de 1/16" ID peristaltische slangen en aansluitingen. Sluit het ene uiteinde van een korte aluminium poort en sluit het andere (buis 4 in figuur 6). Later wordt deze aangesloten op de media kolf.

7. Bereid de Media Fles

1. Sluit een 1/16 "binnendiameter (ID) siliconenslang de langste aluminium poort. De buis moet lang genoeg zijn om de media kolf bereiken. Sluit een 1/8" ID male luer lock een kort segment van 1/16 " ID slangen, sluit deze aan op de voorgaande buis ,, en steek deze korte segment in de rubberen stop op de media kolf (buis 3 in figuur 6).
2. Klem de buis. Deze verbinding maakt het mogelijk lucht uit de media fles te stromen naar het kweekvat. Wanneer de media fles later wordt gepompt met lucht eend deze buis ontspannen is, zal de cultuur worden gemengd, cellenbeton, en bewaard bij een positieve druk door de inkomende bubbels.
3. Plaats een 1/16 "ID buis lang genoeg om de bodem van de kolf in de stop, waardoor media wordt overgedragen bereikt. Verbind een 1/16" ID tube deze, en een 3/16 "ID buis dat. plug deze met een 3/16 "ID vrouwelijke luer lock en een mannelijke luer lock connector (tube 1 / 1,1 in figuur 6).
4. De derde gat in de stop worden gevuld met een kort segment van 1/16 "ID slang, verbonden met twee andere segmenten drager diameter buis en aangesloten aan het distale einde (buis 2 / 2,1 in Figuur 6). Dit zal worden aangesloten een vacuümpomp en later een aquariumpomp.
   OPMERKING: Indien de slang niet gemakkelijk door de gaten in de rubberen stop past, snijd de uiteinden van de buis schuin. Vervolgens kan het schuine uiteinde dat wordt geduwd door het gat worden gebruikt om de rest te trekken door.

8. Bereid de Effluent Fles

1. Plaats een mannelijke luer lock in een segment van 1/16 "ID siliconenslangen en dan stevig plaats 0,022" ID polytetrafluorethyleen (PTFE) buis. Afzonderlijk, voeg een vrouwelijke luer lock een 1/16 "ID tube. Vervolgens draad ene uiteinde langs de PTFE-buis aan de sluizen en de andere een korte aluminium poort (buis 5 in figuur 6) verbindt.
2. Sluit de blootgestelde 1/50 "ID silicone buis naar de 1/50" ID peristaltische buis en aansluitingen. Om dit aan te sluiten drie segmenten van 1/50 "ID slangen en twee segmenten van 0,022" ID polytetrafluorethyleenslangen, ze afwisselend. Verbind deze aan de kolf via effluent 1/16 "ID buis (buis 5 in figuur 6).
3. Ene uiteinde van een 1/16 "ID siliconenslang de tweede langste buis van het aluminium poort en het andere uiteinde op de effluent kolf. Deze aluminiumbuis wordt het cultuurvolume en overmaat cultuur overloopt in het effluent houder (buis 8 in Figuur 6).
4. Autoclaaf het kweken samenstel bij 121 ° C en 15 psi (algemeen sterilisatie) gedurende 30 min.
   Opmerking: De buizen waardoorheen de media kolf wordt gevuld, waardoor de media kolf gezogen, en waardoor het kweekvat wordt geïnoculeerd meerdere segmenten buis zodat als het distale segment is verontreinigd, kan worden afgevoerd naar een steriele onthullen segment.

9. Bereid de microfluïdische kanaal

1. Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) en hardingsmiddel in een 9: 1 verhouding. Degas en giet op het silicium meester mal.
2. Hard de PDMS gedurende 2 uur bij 65 ° C en vervolgens snijden van het masker met een scheermesje. Snijd rond de PDMS totdat deze loskomt uit de mal. Vermijd naar beneden te duwen en het breken van de breekbare wafel.
3. Gebruik een 1,2 mm ID biopsie perforator om gaten te slaan aan beide uiteinden van het kanaal.
4. Plasma bond de PDMS aan de dekking van glas ^24.
5. Tape de lange uiteinden van het dekglas op het dragend aluminium frame zodat de PDMS kanaal wordt gecentreerd op het aluminium frame en bak de PDMS nogmaals 2 uur bij 65 ° C.

10. Vul de Media Fles

Figuur 7: Het toevoegen van media. Dit diagram laat zien hoe de media afgezogen in de media fles zou moeten zijn. Het zorgt ervoor dat de media steriel blijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Maak de juiste media. Wordt daarbij kweeksysteem zal als een chemostaat gebruikt media beperkt voor een bepaalde voedingsstof.
   OPMERKING: Voorbeelden van standaard media samenstelling voor studies met S. cerevisiae al eerder zijn gepubliceerd op ^25,= "xref"> ^{26, 27, 28, 29.}
2. Bevestig het vacuüm filter om een ​​fles van 100 ml, verwijder de tepel deksel, verwijder de witte stekker uit de tepel van het vacuüm filter met steriel pincet.
3. Sluit de 3/16 "ID siliconenslang aan de nippel, de media kolf andere vrije buis met een vacuümpomp (buizen 1 en 2 in figuur 7, respectievelijk), en zorgen dat de buis die de media kolf met het kweekvat wordt vastgeklemd gesloten (buis 3 in figuur 7).
4. Vul het filter met media, zet de vacuümpomp, en vervolgens filteren de rest van de media. Klem de 1/16 "ID silicone slangen aangesloten op het vacuüm (buis 2 in figuur 7) en schakel de vacuümpomp.
5. Verwijder de leurs uit het middensegment van 1/16 "ID slangen aangesloten op de vacuümpomp zodat een onbesmette einde van de buis toegankelijk is. Invoegen the blauw einde van een steriele spuit luchtfilter in deze buis.
6. Klem de 3/16 "ID silicone (tube 1 in figuur 7) en haal de mannelijke Luer van het. Haal de stekker uit de vrouwelijke Luer media inlaatbuis het kweken schip. Sluit deze mannelijke en vrouwelijke luers de media in staat te zijn gepompt in het kweekvat.
7. Verwijder het vacuüm filter en de dop op de 100 ml fles media die was verbonden aan het vacuüm filter.
8. Een dag voor het kweekvat wordt geïnoculeerd Inoculeer een enkele kolonie van de optogenetic microbe in een reageerbuisje met 4 ml verzameld in de vorige stap media, en laat het overnacht groeien bij 30 ° C of cultuur optimale temperatuur groeitemperatuur onder roeren.

11. Bouw de opstelling Around the Microscope

1. Stel de continue kweken samenstel nabij de microscoop met de media boven het kweekvat en de kolf effluent kolf onder het kweekvat, zodat de buis samengesteld uit segmenten van 0,022 "ID PTFE-buis (buis 5 in figuur 6) de microscoop podium kan bereiken. Bind veilig beneden de rubber stoppen van de media kolf en afvalwater container.
2. Koppel de uiteinden van de 0.022 "ID PTFE slang van de 1/50" ID siliconenslang ze te verbinden (buis 5 in figuur 6), en sluit deze doelen in de inlaat en de uitlaat van de microfluïdische apparaat.
3. Sluit de witte einde van de spuit luchtfilter naar het aquarium pomp. De luchtdruk zal media duwen in het kweekvat.
4. Als de media het niveau van het effluent haven bereikt, wikkel de 1/16 "ID media inlaat slangen en aansluitingen rond de langzame peristaltische pomp (buis 4 in figuur 6) en de 1/50" ID monster outlet slangen en aansluitingen rond de snelle peristaltische pomp (buis 5 in figuur 6).
5. Beluchten de media door unclamping de lucht tutussen de media kolf en kweekvat.
6. Tape het verwarmingselement en de thermometer kweekvat zodat de temperatuur kan worden geregeld. Spoel de media slang rond het kweekvat, zodat het invoeren van media zal op dezelfde temperatuur als het vat.
   OPMERKING: De PWM stroom naar het verwarmingselement wordt geregeld door de microcontroller welke ingangen gebruik van de thermometer de kweekvat bij de gewenste temperatuur te houden.
7. Steek de kweekvat in de zwarte schuim behuizing over de LED-matrix, en ervoor zorgen dat de buizen niet worden geknepen.
8. In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de "Media pomp verhouding op" het veld tot 0,1 en de "Sample pump verhouding op" veld op 0. De stroomsnelheid zal zeer laag zijn, maar meer dan de snelheid van de verdamping.
9. Klem de binnenkomende lucht slang tussen de media kolf en het kweken van schip. Haal de stekker uit de enting buis (tube 7 in figuur 6) en beënt de kweekvat met 1 ml startercultuur via een serologische pipet. Klem en sluit het distale einde van deze buis om te voorkomen dat verontreinigingen komen niet in de kweekvat, dan ontspanschakelaars de binnenkomende lucht buis.
10. Bedek de behuizing, zodat er geen licht binnenkomt, en laat de cultuur groeien 's nachts.

12. Calibrate de Pumping Tarieven

1. In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de "Media pomp verhouding op" veld naar 0,5 en de "Sample pump verhouding op" veld 0.
2. Koppel de overloopbuis van het effluent kolf (buis 8 in figuur 6) en de monsterbuis uit de uitstroom kolf (buis 8 in figuur 6) en laat effluent in afzonderlijke vaten. Verzamel effluent gedurende 1 uur, beginnend na de pompen gedurende 15 min zijn.
3. Bereken de stroomsnelheid van media in de kweekvat van de gegevens die in het vat als volume:
   
4. Pas de waarde van de "Media pomp verhouding op" veld door deze lineaire schatting:
   
   waar
   
5. Doorloopt deze kalibratieprocedure totdat het verschil tussen de gewenste debiet en de gemeten stroomsnelheid is <0,2 ml / h, waarbij de stroomsnelheid wordt gemiddeld over een periode van 1 uur.
6. Verhoging van de waarde van de "bemonsteringsverhouding op" veld en kalibreren op soortgelijke wijze tot ongeveer 4/5 ^e van het volume verlaat het kweekvat wordt gepompt door de monsternamepomp en ongeveer ^1/5 van het volume verlaat door middel de overloop poort.
7. Laat de cultuur dichtheid in de continue kweken apparaat in evenwicht onder deze omstandigheden 's nachts.
   LET OP: Als het doel debieten niet kan worden bereikt, veranderende peristaltische pomp slang. Vloeistof wordt gepompt tegen een hogere snelheid wanneer grotere diameter buis wordt gebruikt. Volg stap 14 en dan terug naar stap 8.4.

13. Collect Microscope Beelden van Gekweekte Microben

1. Vul het Stage Positie List in Micro-Manager met een reeks niet-overlappende posities waarop beelden van de cellen gepompt in de microfluïdische kanaal zal in de focal plane.
2. Open de "Bioreactor Controller" plugin. Selecteer de gewenste LED-matrix tijdsverloop, imaging-kanalen, en andere experimentele instellingen van de aanwijzingen. Verzamelen en analyseren van beelden.
3. Terwijl het experiment loopt, ervoor te zorgen dat de media in de media kolf helder blijft. Als het bewolkt is, dan is besmet.

14. Post-experiment

1. Gooi media, overtollige celcultuur en afvalwater.
2. Vul de media kolf met 200 ml 20% EtOH gemengd met gedeïoniseerd water. Voer het chemostat zoals het eerder hadis uitgevoerd tijdens het experiment uit te spoelen cel puin en media.
3. Wanneer de alcohol oplossing afgetapt uit de media fles, demonteer de chemostaat volledig.
4. Was glaswerk en buizen met warm water en zachte zeep en goed naspoelen met gedemineraliseerd water. Laten drogen.
5. Open de "microcontrollerRecords.csv" bestand om de temperatuur en de LED-matrix-status in de loop van het experiment te beoordelen, het bestand "Summary.csv" om de samenvatting van de gegevens van elke set van foto's en de review "Resultaten .csv" bestanden om gegevens samenvatten elke ROI van elke periode, waarbij n ^de n dataset te beoordelen.

Results

Deze inrichting werd gebruikt om een kweek van S. cerevisiae tot expressie geel fluorescerend eiwit (YFP) als reactie op blauw licht stimuleren via een induceerbare optogenetic transcriptiesysteem basis van de Cry2 / CIB1 eiwit pair ^30. De cellen werden gekweekt in chemostatically-fosfaat beperkte media met een gemiddelde verwatering van 0,2 ± 0,008. Fosfaat beperking wordt vaak gebruikt in S. cerevisiae chemostat experimenten om de groei te rege...

Discussion

We hebben dit apparaat met flexibiliteit in het achterhoofd. Al het gebruikte code is gratis en open-source. Het beeld standaard analyseproces naar segment cellen is eenvoudig en loopt snel op. Custom analyse kan worden uitgevoerd door het opnemen van input van de gebruiker, terwijl het analyseren van een representatief beeld van de Fiji-grafische user interface, het omzetten van de input voor een BeanShell script, en dan het instellen van de plugin om het script te bellen. Wanneer het wordt genoemd, zal dit script een ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extensive lab manual	GitHub	NA	An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	The free, open-sourced software to view and edit the.fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit	SparkFun Electronics	10007	Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V	Adafruit	180	For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand	Adafruit	150	For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g	Adafruit	145	For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 µF capacitor	SparkFun Electronics	COM-08375	Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 µF capacitor	SparkFun Electronics	COM-00523	Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219	Maxim	MAX7219CNG	LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket	Mouser Electronics	575-144308	16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket	Mouser Electronics	535-24-3518-10	Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter	Adafruit	2034	For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1")	SparkFun Electronics	PRT-12693	Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required.
Flush diagonal wire cutters	Adafruit	152	For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm)	Adafruit	793	Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard	Adafruit	64	The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix	Adafruit	956	Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin	SparkFun Electronics	13875	8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total)	SparkFun Electronics	10969	For electronics. 1 required.
IRL520N MOSFET	International Rectifier	IRL520N	Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	SparkFun Electronics	PRT 11367	Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed	Adafruit	276	Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed	Adafruit	798	For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm	Adafruit	1481	For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump	Fisher Scientific	13-876-1	For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump	Fisher Scientific	13-876-2	For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed	Adafruit	63	For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras	Adafruit	642	Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager	Micromanager	NA	The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI	ImageJ	NA	The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment	Arduino	NA	The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code	GitHub	NA	The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot	SparkFun Electronics	CAB-00512	Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper)	B&H	B&H # LOFSFTL MFR # T1-72	For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW	Thorlabs	S120VC	For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape	Fisher Scientific	159015N	For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D	For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle	Bellco Glass, Inc.	(7910-40150)	Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly	Bellco Glass,