Methodenartikel

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

DOI:

10.3791/54900

⸱

8 januari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cognitive Neurosciences, Radboudumc, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University, 3Department of Human Genetics, Radboudumc, 4Department of Molecular Developmental Biology, Radboud University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen afgeleid van humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) een veelbelovend nieuw instrument voor de studie van neurologische aandoeningen. In het afgelopen decennium, hebben veel protocollen voor hiPSCs differentiëren tot neuronen ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn vaak traag met een hoge variabiliteit, lage reproduceerbaarheid, en de lage efficiëntie. Bovendien, de resultaten verkregen met deze protocollen neuronen vaak onvolwassen en ontbreekt het aan functionele activiteit, zowel bij de enkele-cel en netwerkniveau tenzij de neuronen worden gedurende enkele maanden. Mede door deze beperkingen, de functionele eigenschappen van iPSC-afgeleide neurale netwerken zijn nog niet goed gekarakteriseerd. Hier passen we een onlangs gepubliceerd protocol dat de productie van menselijke neuronen van hiPSCs beschreven door geforceerde expressie van de transcriptiefactor Neurogenine 2-12. Dit protocol is een snelle (waardoor volwassen neuronen binnen 3 weken) en efficiënt, met bijna 100% omzettingsrendement van omvormersed cellen (> 95% DAPI-positieve cellen MAP2 positief). Bovendien bepaalt het protocol levert een homogene populatie van exciterende neuronen die het onderzoek celtype specifiek bijdragen aan neurologische aandoeningen mogelijk maken. We pasten de oorspronkelijke protocol genereren van stabiel getransduceerde cellen iPSC, gaf ons expliciete controle over het totale aantal neuronen. Deze cellen worden vervolgens gebruikt om iPSC-afgeleide neurale netwerken op micro-electrode arrays genereren. Op deze wijze kan de spontane elektrofysiologische activiteit van iPSC-afgeleide neurale netwerken worden gemeten en gekarakteriseerd, met behoud interexperimental consistentie tussen celdichtheid. Het gepresenteerde protocol is breed toepasbaar, vooral voor mechanistische en farmacologische studies over menselijke neuronale netwerken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) differentiatie protocollen voor de menselijke neuronen in vitro een krachtige nieuwe tool voor het bestuderen van neurologische aandoeningen heeft verstrekt te genereren. Tot voor kort werd de studie van dergelijke aandoeningen ernstig belemmerd door het gebrek aan modelsystemen met menselijke neuronen. Hoewel knaagdieren kunnen worden gebruikt om neurologische aandoeningen te bestuderen, de resultaten van deze studies niet gemakkelijk vertaald mens 1. Gezien deze beperkingen iPSC-afgeleide neuronen zijn een veelbelovend alternatief model dat kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te ontrafelen onderliggende neurologische aandoeningen en in vitro screenen van geneesmiddelen.

In de afgelopen tien jaar een aantal protocollen om te zetten hiPSCs tot neuronen zijn ontwikkeld 2-8. Echter, deze protocollen nog beperkt op vele manieren. Ten eerste, de protocollen vaak tijdrovend: het genereren van neuronen met voldoende rijping (dwz synapse vorming) en functionele activiteit vereist maanden van het kweken van procedures, die op grote schaal studies moeilijk 9 maakt. Bovendien iPSC naar neuron omzettingsrendement laag. Protocollen leiden steeds een heterogene populatie van neuronen, en dus niet onderzoeken specifieke subsets van neuronale cellen mogelijk. Bovendien zijn de protocollen niet reproduceerbaar, waarbij verschillende resultaten voor verschillende iPSC lijnen 10,11. Tenslotte de rijpingsfase en functionele eigenschappen van de resulterende neuronen zijn ook variabel 10.

Om deze problemen, Zhang et al pakken. (2013) 12 een protocol ontwikkeld die snel en reproduceerbaar genereert menselijke neuronen van hiPSCs door overexpressie de transcriptiefactor Neurogenine-2. Zoals gerapporteerd door de auteurs, differentiatie treedt relatief snel (slechts 2-3 weken na inductie van expressie Neurogenine-2), het protocol reproduceerbaar (neuronale eigenschappen onafhankelijk zijn van de starting iPSC lijn) en de iPSC naar neuron conversie is zeer efficiënt (bijna 100%). De populatie van neuronen gegenereerd met hun protocol homogene (die lijkt bovenlaag corticale neuronen), waardoor het onderzoek celtype specifiek bijdragen aan neuronale aandoeningen. Bovendien hebben zij iPSC afgeleide neuronen vertoonden oudere eigenschappen (bijvoorbeeld de mogelijkheid om synapsen en robuuste functionele activiteit vormen) na 20 d.

Karakteriseren van de elektrofysiologische eigenschappen van iPSC-afgeleide neuronen op netwerkniveau is een belangrijke voorwaarde voor iPSC technologie kan worden benut voor de studie van ziekten bij de mens. Om deze reden hebben veel onderzoeksgroepen onlangs begonnen met stamcellen afgeleide neuronen op netwerkniveau met behulp van micro-elektrode-array (MEA) apparaten (Multichannel Systems, Reutlingen, Duitsland) 13-16 te onderzoeken. De elektroden van een MEA worden ingebed in een substraat waarop neuronale cellen kunnen worden gekweekt.MEA kan worden gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van neuronale netwerken en de in vitro ontwikkeling van hun activiteit te ontdekken. Op dit moment, MEA worden alleen gebruikt in combinatie met differentiatie protocollen die enkele maanden duren tot volwassen netwerken leveren. Daarom combineren MEA met een snelle differentiatie protocol moet het gebruik van deze technologie in grootschalige studies neurologische aandoeningen vergemakkelijken.

Hier presenteren we een modificatie van de Zhang et al. (2013) 12 protocol en aan te passen voor gebruik op MMO's. In het bijzonder, in plaats van te vertrouwen op een acute lentivirale transductie, we in plaats daarvan gemaakt iPSC lijnen stabiel tot expressie rtTA / Ngn2 voor het induceren van differentiatie. We hebben deze hoofdzakelijk reproduceerbare controle over de neuronale celdichtheid, aangezien de neuronale celdichtheid is essentieel voor neuronale netwerkvorming en goed contact tussen de neuronen en de elektroden van de MEA 17,18. although de Zhang et al. protocol is zeer efficiënt met betrekking tot omzetting van getransduceerde hiPSCs is inherent variabel ten opzichte van de uiteindelijke opbrengst van neuronen uit het aantal hiPSCs geplateerde aanvankelijk (zie figuur 2E in Zhang et al.) 12. Met een stabiele lijn, elimineren we vele problemen die variabiliteit, zoals lentivirale toxiciteit en infectie-efficiëntie. Vervolgens hebben we geoptimaliseerd de parameters die betrouwbaar produceren iPSC-afgeleide neuronale netwerken op MMO's, het verkrijgen van het netwerk rijping (bijvoorbeeld synchrone gebeurtenissen waarbij een meerderheid van de kanalen) door de derde week. Deze snelle en betrouwbare protocol moet directe vergelijkingen tussen neuronen afkomstig van verschillende (dwz patiënt-specifieke) iPSC lijnen evenals bieden robuuste consistentie voor farmacologisch onderzoek mogelijk te maken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde dierlijke zorg en het gebruik richtlijnen van de Animal Care Committee, Radboud Universitair Medisch Centrum, Nederland, (: 77.073 RU-december-2011-021, protocol nummer) uitgevoerd.

1. Glia Cell Isolatie en Cultuur

LET OP: Het protocol hier gepresenteerde is gebaseerd op het werk van McCarthy en de Vellis 19, en een zeer vergelijkbare gedetailleerd protocol voor de muis astrocyten is beschikbaar 20. Om primaire kweken van corticale astrocyten uit embryonale (E18) rattenhersenen genereren, een zwangere rat moet worden opgeofferd, moeten de embryo's uit de baarmoeder te worden geoogst, en de hersenen moeten worden geïsoleerd van de embryo's. Om een ​​T75 fles te vullen, de cortex van 2 embryonale hersenen moeten worden gecombineerd. Als alternatief kan commercieel verkrijgbare gezuiverde bevroren astrocyten worden gekocht.

  1. Bereid de T75 kolf
    1. Verdun Poly-D-Lysine (PDL) insteriel, ultrapuur water tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Voeg 5 ml van de verdunde PDL naar de T75 cultuur kolf. Swish rond zachtjes aan de gehele groei oppervlak nat. Plaats de kolf in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende 3 uur.
    2. Zuig het PDL uit de kolf. Spoel de kolf 3x met 5 ml steriel water om ongebonden PDL verwijderen. Zuig het water volledig. Laat de kolf te drogen in een laminaire stroming kap of onmiddellijk gebruikt worden.
  2. Dissectie van de cortex
    1. Bereid 50 ml dissectie medium: Lebovitz's L-15 medium met 2% (v / v) B-27 supplement. Houd op het ijs.
    2. Verdoven van de rat diep met isofluraan in een inductie kamer (kleine plexiglas doos) tot de ademhaling ophoudt (~ 5-8 min). Verwijder rat uit de inductie kamer en onmiddellijk gedood door cervicale dislocatie.
    3. Spray de buik van de rat met 70% EtOH en veeg het overtollige. Expose en verwijder de baarmoeder van de dam via keizersnede sectiop het gebruik van een schaar 21.
    4. Snijd individuele embryo's uit hun vruchtwater zakken met een schaar, over te dragen aan een steriele petrischaal gevuld met koud dissectie medium, en blijf op ijs.
    5. Transfer embryo weer een nieuwe, steriele 6 cm petrischaal gevuld met koud dissectie medium. Uittreksel hersenen van de embryo's onder een stereomicroscoop. Naar de hersenen bloot te leggen, voorzichtig afpellen van de huid en de schedel behulp van een tang. Voorzichtig schep het hele brein en over te dragen aan een 35 mm petrischaal met vers, koud dissectie medium.
      OPMERKING: Gehele hersenen ontleed uit embryo's kunnen worden opgeslagen in dissectie medium op ijs gedurende vele uren zonder verlies van cellulaire levensvatbaarheid.
    6. Scheid de twee hersenhelften van elk hersenen door het snijden door de middellijn met fijne tip veer schaar of een scalpel. strippen voorzichtig de hersenvliezen met rechte-fijne getipt tang.
      Opmerking: Het is zeer belangrijk om de hersenvliezen te verwijderen. this fibroblast voorkomt vervuiling van de astrocyt cultuur. Fibroblasten snel delende cellen en uiteindelijk verdringen de andere cellen.
    7. Verwijder de middenhersenen / striatum en het reukorgaan met veer schaar of een scalpel. Zorg er ook voor om de hippocampus (C-vormige structuur die perimedian en caudaal ten opzichte van de cortex) met veer schaar of een scalpel te verwijderen. Verzamel de corticale hemisferen in een 15 ml centrifugebuis gevuld met 5 ml dissectie medium. Houd op het ijs.
  3. Dissociatie van de cortex
    1. Bereid 2 ml Ca 2+ / Mg 2+ -vrij Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 0,25% trypsine (dissociatie gemiddeld). Bereid 50 ml hoog glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 15% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) penicilline / streptomycine (cultuurmedium) en filter steriliseren.
    2. Laat het weefsel naar de bodem van de centrifugebuis. zorgvuldigpiraat zoveel van de dissectie medium mogelijk boven het weefsel. Was het weefsel met 5 ml Ca2 + / Mg2 + -vrij HBSS (zonder trypsine) en laat het weefsel bezinken op de bodem van de buis.
    3. Zorgvuldig aspireren de HBSS. Voeg 2 ml dissociatie medium en flick de buis voorzichtig om het enzym rond het weefsel te mengen. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 5-10 min. Flick de buis een paar keer tijdens de incubatie om het weefsel te ageren.
    4. Onmiddellijk vermaal het weefsel met behulp van een 1000 pi pipet tip. Stel de pipet volume ongeveer 800 ul. Zuig het stukken en verwijder kracht op de zijkant van de buis, direct boven de fluïdumleiding. Echter, probeer te bellen of schuimvorming te minimaliseren. Herhalen totdat het weefsel voldoende gedissocieerd, ongeveer 15 - 20x. Voeg 8 mL kweekmedium de trypsine te inactiveren. Meng door het buisje meerdere malen.
    5. Voorbij de celsuspensie door een 70 um cel zeef bovenop een 50 mL centrifugebuis. Spoel de 15 ml buis met kweekmedium en filtreer het medium door de cel zeef om het medium in de 50 ml buis met de celsuspensie verzamelen. Spoel de cel zeef een paar keer met kweekmedium. Na het spoelen dient het uiteindelijke volume ongeveer 20 - 25 ml.
    6. Pellet de cellen bij 200 xg gedurende 10 min. Zorgvuldig aspireren zoveel medium mogelijk, zonder het aanraken van de cel pellet. Resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium met een 1000 ui pipet. Voeg 11 ml voorverwarmde kweekmedium en meng voorzichtig (om luchtbellen te voorkomen) met behulp van een 10 ml pipet.
    7. Spoel de PDL-gecoate T75 kolf eenmaal met 5 ml kweekmedium. Zuig het medium en breng de celsuspensie aan de kolf. Alle cellen in de suspensie uitgeplaat en we vinden het algemeen niet nodig te tellen, aangezien astrocyten niet te onderscheiden is van andere cellen in de suspensie. Plaats de kolf in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO 2 fof twee dagen.
  4. Uitbreiding en onderhoud van de astrocyten
    1. Vervang de gehele medium voor het eerst 2 d na de eerste plating. Vervang de gehele medium daarna elke 3 d. voorverwarmen altijd vers medium tot 37 ° C voor het toevoegen aan de cellen.
      LET OP: De astrocyten nodig 7-10 d tot ongeveer 90% confluentie (de astrocyten verschijnen als een dicht op elkaar gepakte tessellated monolaag, met microglia en oligodendrocyten liggend op de top en vermengd) te bereiken.
    2. Wanneer de astrocyten te bereiken ongeveer 90% samenvloeiing, schud de kolf met het vervuilende gliacellen te verwijderen:
      1. Neem de kolf uit de incubator en draai de dop (fenol) of hebben betrekking op de poort (gefilterd). Om microglia verwijderen, schud de kolf op een orbitale platform bij 180 rpm gedurende 1 uur. Zuig het medium. Spoel eenmaal met 5 ml voorverwarmd kweekmedium, aspireren en te vervangen door 12 ml kweekmedium.
      2. Verwijderenoligodendrocyten terug de kolf met het platform en orbitale schud bij 250 rpm, 37 ° C gedurende ten minste 7 uur, maar bij voorkeur O / N.
      3. Zuig het medium. Spoel eenmaal met 5 ml voorverwarmd kweekmedium, aspireren en te vervangen door 12 ml kweekmedium. Breng de kolf aan de incubator.
      4. Bij 100% confluent, split de astrocyten middels standaardprocedures in een verhouding van 1: 3 tot 1: 2 met 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Een T75 kolf bij 100% confluentie zal typisch op ongeveer 4,0 x 10 6 cellen in totaal. Onder dit programma, de culturen kan meestal worden een keer per week te splitsen.
        OPMERKING: Bij de astrocyten confluentie bereiken, kunnen ze worden verzameld en voor iPSC differentiatie zoals hieronder in protocol stap 3,4. De astrocyten kan ten minste eenmaal worden gesplitst zonder merkbaar verlies van de levensvatbaarheid. Ze kunnen worden gehandhaafd gedurende maximaal 2 maanden in kweek. Uit ervaring, primaire embryonale dag 18 rat astrocyten progressively geworden terminaal gedifferentieerd en / of verliest levensvatbaarheid na herhaalde splitsing. Hoewel het mogelijk is om de astrocyten voor toekomstig gebruik invriezen we bij voorkeur de astrocyten isoleren van verse embryonale hersenen indien nodig.

2. Genereren van rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs

LET OP: De hiPSCs gebruikt voor onze experimenten werden in eigen huis gegenereerd door lentivirale transductie van humane fibroblasten met de herprogrammering factoren cMYC, SOX2, OCT4 en KLF4.

Opmerking: Voor het genereren van rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs, lentivirale vectoren worden gebruikt om de transgenen stabiel te integreren in het genoom van de hiPSCs. Het protocol voor de productie van het lentivirus is eerder 22 gepubliceerd. De data van de lentivirale verpakkingsvectoren die worden gebruikt om de rtTA en Ngn2 lentivirus deeltjes te produceren worden verschaft in de Table of Materials / Equipment. De transfer vector gebruikt voor de rtTA lentivirus is pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dwz deze vector codeert voor een Tet-On Geavanceerde transactivator onder controle van een constitutieve promoter EF1α en resistentie tegen het antibioticum G418. De transfer vector gebruikt voor de Ngn2 lentivirus is pLVX- (TRE-thight) - (MOUSE) Ngn2-PGK-Puromycine (R); dwz deze vector codeert het gen voor murine Neurogenine-2 onder besturing van een Tet-gecontroleerde promotor en het puromycine resistentiegen onder de controle van een constitutieve PGK promoter. Dus door deze twee transfervectoren een iPSC lijn kan worden gecreëerd, waarvoor de expressie van murine Neurogenine-2 geïnduceerd kan worden door daaraan medium met doxycycline. Voor de transductie van de hiPSCs, wordt het supernatant met lentivirus deeltjes gebruikt (hierna "lentivirus suspensie in de rest van de tekst), namelijk without concentreren van de deeltjes via ultracentrifugatie.

  1. Plate de hiPSCs (dag 1)
    LET OP: De volumes die in dit protocol worden genoemd veronderstellen dat de hiPSCs zijn gekweekt in een plaat met 6 putjes en dat de cellen van een putje worden geoogst. Bovendien wordt aangenomen dat de cellen vervolgens worden uitgeplaat in 12 putjes van een 12 putjesplaat.
    1. Bereid 10 ml koud DMEM / F12 met 1% (v / v) Basement Membrane Matrix (BMM) voor het verwaterde BMM verkrijgen. Voeg 800 ul verdund BMM per putje van een 12 wells plaat. Incubeer gedurende ten minste 1 uur in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2. Vóór gebruik, incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    2. 15 ml warme Essentiele 8 (E8) medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine, 9 ml DMEM / F12 en 1 ml cel losraken oplossing (CDS) op kamertemperatuur. Een aanvulling op de E8 medium met Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmer.
    3. Zuig de gebruikte medium van de hiPSCs eend voeg 1 ml CDS aan de hiPSCs. Incubeer 3-5 min in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2. Kijk onder de microscoop of de cellen los van elkaar.
    4. Voeg 2 ml DMEM / F12 in de put voorzichtig schorten de cellen met 1000 pi pipet en breng de cellen om een ​​15 ml buis. Voeg 7 ml DMEM / F12 aan de celsuspensie. Spin de cellen bij 200 g gedurende 5 min.
    5. Zuig het supernatant en voeg 2 ml van de bereide E8 medium. Verkrijgen van een celsuspensie, waarin de hiPSCs gedissocieerd (vormen geen celklonten) door er het uiteinde van een 1000 pi pipet tegen de zijkant van de 15 mL buis en resuspenderen van de cellen zachtjes. Controleer onder de microscoop of de cellen kunnen worden gescheiden.
    6. Bepaal het aantal cellen (cellen / ml) met behulp van een hemocytometer kamer.
      LET OP: Een plaat met 6 putjes en bij 80 - 90% samenvloeiing zal levert doorgaans 3,0-4,0 x 10 6 cellen in totaal.
    7. aspirerende verdunde BMM uit de putjes van de 12 wells plaat. Verdun de cellen om een celsuspensie van 3,0 x 10 4 cellen / ml te verkrijgen. Plaat 1 ml van de celsuspensie per putje van de 12 wells plaat. Plaats de 12 wells plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  2. Transduceren de iPS-cellen met rtTA en Ngn2 lentivirus (dag 2)
    1. 12 ml warme E8 medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine tot kamertemperatuur. Vul het E8 medium met ROCK inhibitor en polybreen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml voor het medium E8.
    2. Ontdooi de monsters met lentivirus suspensie. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml aan de suspensie lentivirus. Zuig het verbruikte medium en voeg 1 ml van de bereide E8 medium aan elk putje.
    3. Voer de transductie met verschillende hoeveelheden van de rtTA - en Ngn2 -lentivirus suspensies. Bijvoorbeeld, transduce de hiPSCs door het toevoegen van 100 pi van zowel de rtTA -lentivirus en Ngn2 -lentivirus schorsing één putje van de 12 wells plaat. Voor de andere putten gebruikt 200 pL, 300 pL, 400 pL en 500 pL lentivirus suspensie in plaats van 100 pi. De hiPSCs van twee putjes van de 12 wells plaat mag niet worden getransduceerd; ze zullen dienen als controle bij de selectie.
      OPMERKING: De transductie worden bij voorkeur uitgevoerd in duplo, zodat de transductie efficiëntie nauwkeuriger na het begin van de selectie kan worden geschat (zie protocol stap 2.2.4). De hoeveelheid lentivirus suspensie die nodig is om de meerderheid van de hiPSCs efficiënt transduceren afhankelijk van de titer van het lentivirus toegevoegd en het iPSC lijn die wordt gebruikt. In deze studie gebruiken we meestal 100-500 pi van lentivirus schorsing aan de hiPSCs transduceren.
    4. Plaats de 12 wells plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 6 uur. Voor het einde van de 6 h incubatieperiode warme 12 ml E8 medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine en 12 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) tot kamertemperatuur. Een aanvulling op de E8 medium met ROCK-remmer.
    5. Zuig het doorgebracht E8 medium. Was elk putje met 1 ml DPBS. Voeg 1 ml van de bereide E8 medium aan elk putje. Plaats de 12 wells plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  3. Vernieuw de E8 medium (dag 3)
    1. 12 ml warme E8 medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine tot kamertemperatuur. Zuig het verbruikte medium uit de putjes van de 12 wells plaat en voeg 1 ml van de bereide E8 medium aan elk putje. Plaats de 12 wells plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  4. Voer selectie met puromycine en G418 (dag 4-8)
    OPMERKING: Afhankelijk van de celdeling tarief van de heup80% confluentie gedurende de selectieperiode, waarna de kweken moeten worden verdeeld - SC lijn en de efficiëntie van de lentivirale transductie kunnen de cellen 70 bereikt. Omdat de timing van de splitsing niet kan worden voorspeld, zal niet in het protocol genoemd. In plaats van het verversen van het E8 medium aangevuld met de vermelde concentraties van puromycine en G418, kan de cultuur iPSC splitsen als normaal iPSC cultuur (inclusief uitplaten van de cellen op vitronectine beklede platen). De enige uitzondering is dat de E8 medium worden aangevuld met de vermelde concentraties van de antibiotica om de selectie voortgezet.
    1. 12 ml warme E8 medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine tot kamertemperatuur. puromycine en G418 toe te voegen voor de selectie; verschillende hoeveelheden antibiotica worden toegevoegd tijdens de selectieperiode (tabel 1).
    2. Schat de efficiëntie van de transductie van het schatten van het percentage G418- en puromycineresistente cellen. Het percentage resistente cellen te schatten, schatten het percentage dode cellen (niet-resistente cellen) voor de verschillende omstandigheden (de kweken getransduceerd met de verschillende hoeveelheden lentivirus suspensie) en de nontransduced (de cellen die dienen als selectiesturingspunt). Bereken het percentage resistente cellen [100% - (percentage dode cellen)].
      OPMERKING: Als de transducties met de verschillende hoeveelheden lentivirus schorsing werden in duplo uitgevoerd, kan de transductie efficiëntie beter worden ingeschat. De voorwaarde van de niet-getransduceerde cellen dient als selectiesturingspunt; de percentages van dode cellen van de kweken getransduceerd met verschillende hoeveelheden lentivirus suspensie moet lager. Het geschatte percentage resistente cellen wordt gebruikt om de hiPSCs die waarschijnlijk positief voor beide transgenen kiezen. In het algemeen, we kiezen voor de hiPSCs uit de transductie staat waren> 90% van de cels overleven de 5 d selectie periode.
    3. Zuig het medium van de verbruikte hiPSCs en voeg 1 ml van de bereide E8 medium aan de putjes. Plaats de 12 wells plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
Eindconcentratie G418 Eindconcentratie van puromycine
dag 4 250 ug / ml 2 ug / mL
dag 5 250 ug / ml 2 ug / mL
dag 6 250 ug / ml 1 ug / ml
dag 7 250 ug / ml 1 ug / ml
dag 8 250 ug / ml 1 ug / ml

Tabel 1: De concentraties van antibiotica tijdens de selectie periode. Concentraties van de puromycine en G418 tijdens de 5 d van de selectie periode.

  1. Stop de selectie en start regelmatig kweken (dag 9 en later)
    1. Na 5 d selectieperiode, cultuur rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs normaal hiPSCs, behalve dat de E8 medium van de cellen met G418 aangevuld tot een eindconcentratie van 50 ug / ml puromycine en met een eindconcentratie van 0,5 ug / ml.
      OPMERKING: De cellen kunnen nu worden ingevroren (volgens standaard protocollen voor cryopreservatie van cellen) fungeren als backup. Dit is een belangrijke stap voor de reproduceerbaarheid van de differentiatie protocol, omdat hierdoor het gebruik van dezelfde partij rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs vele toekomstige differentiatie experimenten.

3. Differentiatie van rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs om Neuronen op 6-wellMEA en dekglaasjes

LET OP: In dit protocol worden de gegevens voor de differentiatie van rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs op twee verschillende substraten, dwz 6-well MEA (apparaten bestaat uit 6 onafhankelijke bronnen met 9 opname en 1 referentie ingesloten micro-elektroden per well) en dekglaasjes in de putjes van een 24-wells plaat. De protocollen kunnen echter makkelijk worden aangepast voor grotere substraten (bijvoorbeeld voor de putjes van 12- of 6-well platen), door opschalen van genoemde waarden volgens de oppervlakte.

  1. Bereid de MMO's of glazen dekglaasjes (dag 0 en dag 1)
    1. De dag voor aanvang van de differentiatie, steriliseren de MEA volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Verdun de adhesie eiwit Poly-L-Ornithine (PLO) in steriel ultrapuur water tot een eindconcentratie 50 ug / ml. Coat het actieve elektrodeoppervlak van 6 putjes MEA door een 100 ullaten vallen van de verdunde PLO in elk putje. Plaats de dekglaasjes in de putjes van de 24-well plaat met steriele pincet. Voeg 800 ul van de verdunde PLO in elk putje. Voorkom dat de dekglaasjes van drijvende door op ze neer met de 1000 pi pipet tip.
    3. Incubeer de 6-well MEA en 24-well plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2. De volgende dag, zuig het verdunde PLO. Het glazen oppervlakken van de 6-well MEA en de dekglaasjes tweemaal met ultrazuiver steriel water.
    4. Verdun laminine in koude DMEM / F12 tot een eindconcentratie van 20 ug / ml (voor 6-well MEA) en 10 ug / ml (de dekglaasjes). Onmiddellijk laag het actieve elektrodeoppervlak van de 6-well MEA door een 100 pi daling van elk putje. Evenzo, voeg 400 ul van de verdunde laminine in elk putje van de 24-well plaat te bekleden de dekglaasjes. Voorkom dat de dekglaasjes van drijvende door op ze neer met de 1000 pi pipet tip.
    5. Incubeer de 6-well MEA en 24 wells plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende ten minste 2 uur.
  2. Plate de hiPSCs (dag 1)
    OPMERKING: De volumes die in stappen 3.2.1 genoemd - 3.2.4 aannemen dat de rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs worden gekweekt in een 6-wells plaat en dat de cellen van een putje geoogst. De hoeveelheden die nodig zijn voor het uitplaten van de cellen op de 6-well MEA en / of de dekglaasjes afhankelijk van het aantal 6-well MEA en / of het aantal dekglaasjes die worden gebruikt in het experiment; de in stappen 3.2.6 nummers - 3.2.8 toestaan ​​schalen naar verschillende experiment maten.
    1. Warm DMEM / F12, CDS en E8 medium met 1% (v / v) penicilline / streptomycine aan R / T. doxycycline aan een uiteindelijke concentratie van 4 ug / ml en ROCK inhibitor de E8 medium.
    2. Zuig de gebruikte medium van de rtTA / Ngn2 -positieve hiPSCs en voeg 1 mL CDS aan de hiPSCs. Incubeer 3-5 min in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2. Kijk onder de microscoop of de cellen los van elkaar.
    3. Voeg 2 ml DMEM / F12 in de put voorzichtig schorten de cellen met 1000 pi pipet en breng de cellen om een ​​15 ml buis. Voeg 7 ml DMEM / F12 aan de celsuspensie. Spin de cellen bij 200 g gedurende 5 min.
    4. Zuig het supernatant en voeg 2 ml van de bereide E8 medium. Distantiëren de hiPSCs door er het uiteinde van een 1000 pi pipet tegen de zijkant van de 15 mL buis en resuspenderen van de cellen zachtjes. Controleer onder de microscoop of de cellen kunnen worden gescheiden.
    5. Bepaal het aantal cellen (cellen / ml) met behulp van een hemocytometer kamer.
      OPMERKING: Een 6-well plaat en bij 80-90% confluentie wordt levert doorgaans 3,0-4,0 x 10 6 cellen in totaal.
    6. Verstuif de verdunde laminine. Voor de 6-well MEA, verdunnen de cellen om een ​​ce verkrijgenll suspensie van 7,5 x 10 5 cellen / ml. Plaat de cellen door het toevoegen van een druppel van 100 ui van de celsuspensie op het actieve elektrodeoppervlak in elk putje van de 6-well MEA. Voor de dekglaasjes Verdun de cellen om een celsuspensie van 4,0 x 10 4 cellen / ml te verkrijgen. Plaat de cellen door toevoeging van 500 pi van de celsuspensie aan de putjes van de 24-well plaat.
      Opmerking: De uiteindelijke celdichtheid op de MEA hoger is dan op de dekglaasjes (Figuur 1 A en B). We vonden dat deze hoge celdichtheid was vereist voor een goede opname van de netwerkactiviteit. In het protocol, worden de nummers mits bleek optimaal voor de assays.
    7. Plaats de 6-well MEA en 24 wells plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 2 uur (MEA) of O / N (24 putjes).
    8. Na 2 h, 500 pl van de bereide E8 medium Voeg aan elk putje van de 6-well MEA. Plaats de 6-well MEA O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  3. Verander het medium (dag 2)
    1. De volgende dag bereiden DMEM / F12 met 1% (v / v) N-2 supplement, 1% (v / v) niet-essentiële aminozuren en 1% (v / v) penicilline / streptomycine. Voeg humaan recombinant neurotrofine-3 (NT-3) tot een eindconcentratie van 10 ng / ml menselijk recombinant BDNF (BDNF) tot een eindconcentratie van 10 ng / mL en doxycycline tot een uiteindelijke concentratie van 4 ug / mL. Warm het medium tot 37 ° C.
    2. laminine aan een eindconcentratie van 0,2 ug / ml aan het medium. Filtreer het resulterende medium. Zuig het verbruikte medium uit de putjes van de 6-well MEA en de 24-well plaat en vervangen door de voorbereide medium. Incubeer de 6-well MEA en 24-well plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  4. Voeg rat astrocyten (dag 3)
    OPMERKING: De volumes die in dit protocol worden genoemd veronderstellen dat de rat astrocyten worden gekweekt in T75 cultuur kolven. Het is essentieel dat de rat astrocyten die worden toegevoegd aan de kweken van goede kwaliteit. We maken gebruik van twee criteria om te controleren of de rat astrocyten zijn van goede kwaliteit. Ten eerste moet de rat astrocyt cultuur kunnen confluente kweken binnen tien dagen na isolatie uit de rat embryonale hersenen. Ten tweede, nadat de rat astrocyt cultuur moet de rat astrocytes kunnen een confluente monolaag tessellated (figuur 1C) vormen. Als de rat astrocyten cultuur niet aan deze twee criteria voldoet, adviseren wij deze cultuur niet te gebruiken voor differentiatie experimenten.
    1. Warme 0,05% trypsine-EDTA tot kamertemperatuur. Verwarm de DPBS en DMEM / F12 met 1% (v / v) penicilline / streptomycine bij 37 ° C.
    2. Zuig de gebruikte medium van de rat astrocyten cultuur. Was de cultuur door het toevoegen van 5 ml DPBS en swish het rond voorzichtig.
    3. Aspirat de DPBS en voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA. Swish de trypsine-EDTA rond zachtjes. Incuberen in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 5-10 min.
    4. Kijk onder de microscoop of de cellen worden losgemaakt. Maak de laatste cellen door het raken van de kolf een paar keer.
    5. Voeg 5 ml DMEM / F12 aan de kolf. Vermaal de cellen voorzichtig in de kolf met een 10 ml pipet. Verzamel de celsuspensie in een 15 ml buis. Draai de buis bij 200 g gedurende 8 min.
    6. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM / F12. Bepaal het aantal cellen (cellen / ml) met behulp van een hemocytometer kamer.
    7. Voeg 7,5 x 10 4 astrocyten per putje van de 6-well MEA. Voeg 2,0 x 10 4 astrocyten per putje van de 24-well plaat. Incubeer de MEA en de 24-well plaat O / N in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  5. Verander het medium (dag 4)
    1. Bereid Neurobasaal medium met 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamine en 1% (v / v) penicilline / streptomycine. Add NT-3 tot een eindconcentratie van 10 ng / mL, BDNF tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL en doxycycline tot een uiteindelijke concentratie van 4 ug / mL. Bovendien, voeg cytosine β-D-arabinofuranoside tot een concentratie van 2 uM.
      OPMERKING: Cytosine β-D-arabinofuranoside wordt toegevoegd aan het medium astrocyt proliferatie inhiberen en de resterende hiPSCs die niet differentiëren tot neuronen doodt.
    2. Filtreer het medium en warm tot 37 ° C. Zuig het verbruikte medium uit de putjes van de 6-well MEA en de 24-well plaat en vervangen door de voorbereide medium. Handhaaf de 6-well MEA en de 24-well plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
  6. Vernieuw de medium (dag 6-28)
    LET OP: Vanaf dag 6, vernieuwen halfvan het medium elke twee dagen. Vanaf dag 10 verder wordt het medium aangevuld met FBS de astrocyt levensvatbaarheid ondersteunen.
    1. Bereid Neurobasaal medium met 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamine en 1% (v / v) penicilline / streptomycine. Add NT-3 tot een eindconcentratie van 10 ng / mL, BDNF tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL en doxycycline tot een uiteindelijke concentratie van 4 ug / mL. Vanaf dag 10 verder, ook een aanvulling op de medium met 2,5% (v / v) FBS. Filter de resulterende medium en warm tot 37 ° C.
    2. Verwijder helft van het verbruikte medium uit de putjes van de 6-well MEA en de 24-well plaat met een 1000 ui pipet en vervangen door de voorbereide medium. Handhaaf de 6-well MEA en de 24-well plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO2.

4. Bepaal de Neurofysiologische Profiel van iPSC-afgeleide Neuronen

OPMERKING: Twee tot drie weken na de inductie van differentiatie, kan de iPSC-afgeleide neuronen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse analyses. In dit hoofdstuk worden voorbeelden van enkele downstream analyses aangezien worden uitgevoerd kan de neurofysiologische profiel van de iPSC-afgeleide neuronen vast te stellen.

  1. Kenmerkend zijn voor de neuronale netwerk activiteit met MMO's
    1. Record 20 min van de elektrofysiologische activiteit van iPSC-afgeleide neuronen gekweekt op MMO's. Tijdens de opname, handhaven de temperatuur op 37 ° C en verdamping en pH-veranderingen van het medium te voorkomen door het opblazen van een constante, langzame stroom bevochtigde gas (5% CO2, 20% O2, 75% N2) op de MEA .
    2. Na 1200X amplificatie (MEA 1060, MCS), proeven van het signaal op 10 kHz met behulp van de MCS data-acquisitie kaart. Analyseer de gegevens (spike en barstte detectie) met behulp van een aangepaste software pakket 23.
  2. Kenmerkend zijn voor de single-cell elektrofysiologische activiteit
    1. Breng de dekglaasjes met de iPSC-afgeleide neuronale culturen een ondergedompelde vaste-fase opname kamer in een rechtopstaande microscoop. Record 20 min van de spontane actie-potentieel opgeroepen postsynaptische stromingen (sEPSC) 24. Detecteren de synaptische evenement met behulp van neurowetenschappelijk programma.
  3. Kenmerken de neuronale morfologie en synapsin expressie
    1. Fix en vlekken op de iPSC-afgeleide neuronen voor MAP2, synapsin-1/2, en PSD-95, 22, 24, 25. Kwantificeren van het aantal synapsin-1/2 en PSD-95 puncta met behulp van beeldanalyse-software.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we met succes een gemodificeerd protocol waarbij hiPSCs direct in corticale neuronen worden onderscheiden door overexpressie van de transcriptiefactor Neurogenine-2 12 en we hebben het aangepast voor gebruik van MEA. Deze aanpak is snel en efficiënt waardoor wij functionele neuronen en netwerkactiviteit al tijdens de derde week te verkrijgen na de inductie van differentiatie.

Tijdens de differentiatie protocol, de cellen morfologisch begon neuronen lijken: kleine processen werden gevormd en neuronen begonnen met elkaar verbinden (figuur 1A). We hebben een neurofysiologische profiel van de neuronen afgeleid van een gezonde-control iPSC lijn, door het meten van hun neuronale morfologie en synaptische eigenschappen tijdens de ontwikkeling. iPSC-afgeleide neuronen gekleurd MAP2 en synapsine-1/2 op verschillende dagen na de startvan differentiatie (figuur 2A). De afgeleide neuronen tonen volwassen neuronale morfologie reeds 3 weken na de inductie van differentiatie. Het aantal synapsine-1/2 puncta (een maat voor het aantal synapsen) werd gekwantificeerd op basis synapsine-1/2 immunocytochemie kleuringen. Het aantal synapsine-1/2 puncta loop der tijd toenemen, wat suggereert dat het niveau van neuronale verbindingen ook toeneemt (figuur 2B). Het aantal synapsine-1/2 puncta 23 dagen na de inductie van differentiatie was vergelijkbaar in beide onafhankelijke IPS lijnen (Figuur 2C). Op 23 DIV meest synapsin1 / 2 puncta werden geplaatst naast PSD-95 puncta, wat indicatief is voor functionele synapsen (figuur 2D).

Consistent met de door Zhang et al resultaten. Genereerden wij een populatie van excitatoire corticale neuronen bovenlaag bevestigd door pan-neuronale en subtype-specifieke corticale m arkers zoals BRN2 en SATB2 (layer II / III). We hadden niet neuronen die positief voor diepe laag neuronen CTIP2 (laag V) of FoxP2 (layer VI) (figuur 2E en F) waren te observeren

Om de elektrofysiologische activiteit van het iPSC-afgeleide neuronen te karakteriseren, gebruikten we whole-cell stroom en spanning clamp opnames, dwz intrinsieke eigenschappen en prikkelende inbreng op deze neuronen werden gemeten tijdens de ontwikkeling. De neuronen konden actiepotentialen genereert een week reeds na de differentiatie en het percentage cellen spiking toenam in de tijd (Figuur 2G en H). Voorts ontvangen de neuronen prikkelende synaptische grondstoffen was een week na inductie van differentiatie: zowel frequentie als amplitude van de prikkelende synaptische ingang verhoogd tijdens de ontwikkeling (Figuur 2I - K).

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Om een beter begrip eencellige activiteit combineert functies op netwerkniveau vormen, is het noodzakelijk te bestuderen hoe neuronen werken samen In vitro neuronale netwerken gekweekt op MEA. vormen een waardevolle experimenteel model voor het bestuderen van neuronale dynamiek. We registreerden 20 min van elektrofysiologische netwerk activiteit van neuronen afgeleid van een gezonde-control iPSC lijn gekweekt op 6-well MEA (figuur 2 M). een paar weken na de inductie van differentiatie, de neuronen afkomstig van gezonde controle hiPSCs gevormde functioneel actief neuronale netwerken, met spontane gebeurtenissen (0,62 ± 0,05 spike / s Figuur 2N). In deze fase van ontwikkeling (dat wil zeggen 16 d na het begin van de differentiatie) geen synchrone gebeurtenissen waarbij alle kanalen . van de MEA worden gedetecteerd (figuur 2O) het niveau van de netwerkactiviteit verhoogd tijdens de ontwikkeling: tijdens de vierde week na t Hij inductie van differentiatie, neuronale netwerken vertoonden hoge spontane activiteit (2,5 ± 0,1 spike / s Figuur 2N) in alle putjes van de inrichting. De netwerken ook tentoongesteld synchroon netwerk uitbarstingen (4,1 ± 0,1 burst / min, figuur 2O) met een lange looptijd (2100 ± 500 ms).

figure-results-1
Figuur 1: iPSC Differentiatie in neuronen. A. Drie tijdstippen van hiPSCs differentiatie in neuronen op dekglaasjes. B. Plating van hiPSCs op MEA. C. Astrocytes bij 100% confluentie in T75 kolf (merk op dat de cellen vormen een mozaïek monolaag). Schaal bars: 150 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-results-2
Figuur 2. iPSC afgeleide neuronen Karakterisatie. A. iPSC afgeleide neuronen gekleurd voor MAP2 (groen) en synapsine-1/2 (rood) op verschillende dagen na het begin van differentiatie. Schaal bar: 10 pm. B. Kwantificering van synapsin puncta in twee onafhankelijke experimenten. Iedere experimenten werden ten minste 10 cellen geanalyseerd. C. Kwantificering van synapsin puncta op DIV23 in neuronen afkomstig van twee onafhankelijke IPS lijnen. D. iPSC afgeleide neuronen gekleurd voor PSD-95 (groen) en synapsine-1/2 (rood) 23 dagen na het begin van differentiatie. Synapsin puncta worden afgewisseld met PSD-95 puncta. E. iPSC afgeleide neuronen werden gekleurd voor MAP2 (groen) en BRN2 (rood) of SATB2 (rood) 23 d na het begin van differentiatie. F. Percentage MAP2 positieve cellen diewaren positief voor aangegeven markers. G. Representatieve huidige clamp blijkt dat actiepotentialen kan al 7 dagen na het begin van differentiatie worden gegenereerd. H. Percentage van cellen op verschillende dagen na de inductie van differentiatie die een of meer actiepotentialen tonen. I. Vertegenwoordiger sporen van prikkelende postsynaptische stromingen (EPSCs) door iPSC-afgeleide neuronen op verschillende dagen ontvangen na differentiatie. J. Frequentie van prikkelende postsynaptische stroom tijdens de ontwikkeling. K. amplitude van prikkelende postsynaptische stroom tijdens de ontwikkeling. L. Vertegenwoordiger sporen van EPSC opnames zonder (controle) en met CNQX (CNQX). M. Neuronen afgeleid van één iPSC lijn werden gekweekt op 6-putjes MEA en netwerkactiviteit wordt getoond iPSC-afgeleide neurale netwerken 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. De activiteit opgenomen vanelk putje (sampling rate van 10 kHz) wordt aangegeven met een andere kleur (5 min van de 20 min van de opname worden weergegeven). N. Firing snelheid 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. O. barsten tarief 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gezien de resultaten, kan de kwaliteit van de resulterende iPSC afgeleide neuronen worden beoordeeld door een neurofysiologische profiel van de cellen. Dat wil zeggen drie tot vier weken na het begin van de differentiatie, de morfologie, synapsin-1/2 expressie en elektrofysiologie van de neuronen kan worden beoordeeld. Op dat tijdstip, worden de iPSC-afgeleide neuronen wordt naar een neuronale morfologie vertonen, te MAP2, synapsine / PSD-95 positief bij het uitvoeren immunocytochemie zijn, en tentoonstellingent spontane elektrofysiologische activiteit (zowel in de single-cell en netwerkniveau).

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een efficiënte iPSC-differentiatie protocol gepubliceerd door Zhang et al geïmplementeerd. (2013) 12 voor het meten van de netwerkactiviteit van iPSC-afgeleide neuronale netwerken op MMO's. We pasten de originele protocol door het creëren van een rtTA / Ngn2 -positieve iPSC lijn voor het induceren van neuronale differentiatie. Deze extra stap kunnen we de neuronale celdichtheid op de MEA regelen. Controle over de neuronale dichtheid was een belangrijke voorwaarde voor de aanpassing van het protocol bij MMO's en voor het waarborgen van consistentie. Om de activiteit van neuronale netwerken met behulp MEA meten, moet de neuronen dichte netwerken vormen direct op het MEA elektroden 17,18. Deze vereisen geen strakke controle over de plating dichtheid van de neuronen. De rtTA / Ngn2 -positieve iPSC lijn zorgt voor de controle van neuron dichtheid, omdat deze tactiek niet afhankelijk is van acute lentivirale transductie van hiPSCs voorafgaand aan differentiatie;de rtTA / Ngn2 -positieve iPSC stippellijn hierdoor vrijwel elimineert variaties in de uiteindelijke opbrengst als gevolg van, bijvoorbeeld, lentivirale toxiciteit en variabele infectie-efficiëntie.

Een andere belangrijke stap van de experimentele procedure is het aantal ratten astrocyten die worden gekweekt samen met de differentiërende hiPSCs. Astrocyten actief bijdragen aan de verfijning ontwikkelen neurale circuits door het regelen synapsvorming, onderhoud en verwijdering, die allemaal belangrijke processen voor neuronale functioneren. Het protocol in dit document is zeer astrocyten-afhankelijke: volledig volwassen en vormen functionele synapsen, de neuronen vereisen steun van de astrocyten. We ondervonden dat het aantal astrocyten ongeveer gelijk aan het aantal iPSC-afgeleide neuronen moet zijn om de rijping van de neuronen en de vorming van neuronale netwerken vertonen spontane activiteit te ondersteunen. Sinds onze astrocyten protocol opbrengsten primaire cel culturen met een beperkte levensduur, de isolatie van rat astrocyten moet regelmatig worden uitgevoerd.

Onze aanpassing van een door Zhang et al protocol. (2013) 12 voor gebruik bij MEA technologie zal waarschijnlijk aanzienlijk beter in staat om de netwerkactiviteit van iPSC-afgeleide netwerken bestuderen. Voorheen gebruikte protocollen voor het bestuderen van iPSC-afgeleide neuronale netwerken met MEA ingeroepen tijdrovende procedures differentiatie 13-16. Het protocol van Zhang et al. (2013) verschaft een snel alternatief, en onze modificatie verwijdert een bron van variabiliteit, waardoor het nu mogelijk om iPSC-afgeleide neuronen in combinatie met MEA technologie, met name in high-throughput of farmacologische studies. Bovendien, omdat de methode gepubliceerd door Zhang et al. (2013) 12 levert een homogene populatie van upper-layer corticale neuronen, onze aangepaste protocol maakt het mogelijk om gericht onderzoek naar het netwerk eenctivity van deze specifieke neuronale deelverzameling.

Desondanks heeft deze benadering ook een aantal beperkingen. Ten eerste, de homogeniteit van de kweken kan worden nadelig beschouwd omdat de kweken minder waarschijnlijk lijken in vivo netwerken, waarbij verschillende soorten neuronen (bijv remmende en exciterende neuronen) vormen een heterogeen netwerk. Om nog meer gebruik van de iPSC-afgeleide neuronen met MEA technologie, is het belangrijk om snelle (-transgen based) differentiatie protocollen voor andere neuronale celpopulaties ontwikkelen. Als protocollen beschikbaar komen, zou het in vitro netwerken nauwer na te bootsen in vivo netwerken. Tweede momenteel rat astrocyten worden toegevoegd aan de iPSC-afgeleide neuronen groei ondersteunen, en dus de resulterende neuronale netwerk geen menselijke neurale netwerk sensu stricto. Betrouwbare protocollen voor differentiëren hiPSCs in kan astrocyten in de toekomst solve dit probleem 26. Derde tweedimensionale neuronale netwerken, zoals hier beschreven, een beperkt model voor de studie van complexe driedimensionale in vivo neuronale netwerken. Gelukkig protocollen beschrijven driedimensionale culturen van de rat primaire neuronen in combinatie met MEA technologie reeds beschikbaar 27,28. Prospectief, moet de combinatie van snelle differentiatie protocollen voor het verkrijgen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten met driedimensionale kweektechnieken en MEA technologie nieuw inzicht in de biologische mechanismen onderliggende neurologische stoornissen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Jessica Classen voor het uitvoeren van de whole-cell patch-clamp experimenten. De hiPSC's die in onze experimenten werden gebruikt, werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Huiqing Zhou en Willem van den Akker van de Radboud Universiteit Nijmegen. De transfervectoren die in dit protocol werden gebruikt, werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Oliver Brüstle, Philipp Koch en Julia Ladewig van het University of Bonn Medical Centre.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lebovitz's L-15 mediumGibco11415-064
B-27 supplementGibco0080085SA
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-AldrichP6407
Ca2+/Mg2+-vrij HBSS Gibco14175-095
0,05% Trypsin-EDTA Gibco25300-054
2,5% TrypsinGibco15090-046
DMEM met hoge glucoseGibco11965-092
FBS (Fetal Bovine Serum)Sigma-AldrichF2442-500ML
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333
70 µm celzeefBD Falcon352350
DPBSGibco14190-094
psPAX2 lentiviraal verpakkingsvectorAddgenePlasmid #12260
pMD2.G lentiviraal verpakkingsvectorAddgenePlasmid #12259
Basement membrane matrixGibcoA1413201
DMEM/F12Gibco11320-074
Cell detachment solutionSigma-AldrichA6964
E8 mediumGibcoA1517001
ROCK inhibitorGibcoA2644501 Alternatief kunnen ROCK-remmers zoals thiazovivin worden gebruikt.
PolybreneSigma-AldrichH9268-5G
G418Sigma-AldrichG8168-10ML
PuromycinSigma-AldrichP9620-10ML
VitronectinGibcoA14700
6-well MEAsMulti Channel Systems60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
Glazen dekglasjesVWR631-0899
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma-AldrichP3655-10MG
LaminineSigma-AldrichL2020-1MG
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-5G
N-2 supplementGibco17502-048
Niet-essentiële aminozurenSigma-AldrichM7145
NT-3, human recombinantPromokineC66425
BDNF, human recombinantPromokineC66212
Trypsin-EDTAGibco25300-054
L-alanyl-L-glutamineGibco35050-038
Neurobasal mediumGibco21103-049
Cytosine β-D-arabinofuranoside Sigma-AldrichC1768-100MG
Scherpe fijne pincettenFine Science Tools11251
Fijne spiraalvormige schaarFine Science Tools91500-09

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
  2. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  3. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  4. Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
  5. Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  6. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  7. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  8. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  9. Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
  10. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  11. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  13. Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
  14. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181(2016).
  15. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
  16. Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
  17. Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
  18. Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
  19. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  20. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).
  21. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965(2012).
  22. Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
  23. Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
  24. Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
  25. Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
  26. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  27. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489(2014).
  28. Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080(2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neurogenine 2 expressieelektrofysiologische activiteitmeting van netwerkactiviteithiPSC afgeleide neuronensnel differentiatieprotocolceldichtheidscontrolefunctionele synapsevorming

Gerelateerde artikelen