ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

Samenvatting

ACT-PRESTO (actieve duidelijkheid techniek drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in organen) maakt een snelle, efficiënte, maar goedkope weefsel clearing en snelle antilichaam penetratie in de weefsels ontruimd door passieve diffusie of druk bijgestaan ​​levering. Met behulp van deze methode, kan een breed scala van weefsels worden gewist, immunolabeled door meerdere antilichamen en volume-afgebeeld.

Samenvatting

De identificatie en onderzoek van de gedetailleerde organisatie van organen of van het gehele lichaam op cellulair niveau belangrijke uitdagingen in de biologie. Overgangsmethoden vereisen een aanzienlijke hoeveelheid tijd en moeite om een ​​3D-beeld te verkrijgen en met het intacte weefsel snijden, immunokleuring en imaging serieel doorgesneden weefsel, dat een verlies van informatie levert bij elke stap van het proces. In recent ontwikkelde methoden voor hoge-resolutie beeldvorming binnen intact weefsel, is moleculaire karakterisering beperkt tot de etikettering van eiwitten. Echter momenteel beschikbare protocollen voor orgel clearing vereisen een aanzienlijk lange procestijd, waardoor het moeilijk uitvoerbaar weefsel clearing technieken in het laboratorium. We hebben onlangs een snelle en zeer reproduceerbare protocol genoemd ACT-PRESTO (a ctive c matigheid t echnique- p ressure r uitgelaten e fficient en s tafel t ransfervan macromoleculen in o rgans), die zorgt voor goedkeuring weefsel binnen enkele uren. Bovendien ACT-PRESTO maakt een snelle immunokleuring met conventionele methoden en versnelt antilichaam penetratie in de diepe laag van dicht gevormde, dikke exemplaren door het toepassen van druk of convectie flow. We beschrijven hoe weefsels, hoe om te wissen door lipide verwijderen met behulp van elektroforese voor te bereiden, en hoe immuno-vlekken door een druk bijgestaan ​​levering. De snelheid en de consistentie van het protocol zullen de prestaties van 3D-histologisch onderzoek en op basis van volume diagnoses te bespoedigen.

Inleiding

Een van de uitdagingen in neurologie is de visualisatie van neuronale bedrading en individuele cellen in intacte hersenweefsel. Tot voor kort, het aantonen van de verbindingen tussen neuronen in deze manier vereist 1) seriële snijden van de weefsels; 2) de moleculaire kenmerken van specifieke doelen, zoals axonen of eiwitten; en 3) visualisatie van 3D-reconstructie van de hele hersenen via computationele registreren of aanpassing van de 2D-serie beelden ^1. Deze stappen zijn omslachtig, vergen veel tijd, en zijn onderhevig aan informatie te verliezen tijdens het snijden en de etikettering, het maken van neurale netwerk in kaart brengen buitengewoon moeilijk. Maar veel methoden die het mogelijk maken de visualisatie van intact weefsel, zonder snijden ontwikkeld. Biologische weefsels kunnen optisch transparant worden gemaakt door het weefsel-clearing technieken ^2-10. Een van de belangrijkste methoden is het brekingsindex verschil tussen de intacte weefsel en de onderdompeling oplossing om verminderenlichtverstrooiing te verminderen in het intacte weefsel, waardoor het weefsel rendering transparante en waardoor de waarneming van diepe structuren. Sommige soorten onderdompeling oplossingen hydrofobe eigenschappen, die resulteren in snelle quenching fluorescerende tijdens de dehydratatie procedure. Daarom deze methoden zijn niet compatibel met fluorescerende beeldvorming over een lange tijdsperiode ^11,12. In plaats van hydrofobe reagentia andere manieren hydrofiele reagentia voor weefsel clearing, zoals SeeDB ⁴ en Sca l e ^6, waarbij de structurele informatie en de fluorescentie van het biologisch weefsel ^4,6,8 handhaven. Echter, macromoleculen, met inbegrip van antilichamen, kan niet de kern van het intacte weefsel alleen te bereiken door diffusie. Daarom is de pre-etikettering van doelmoleculen in diepe gebieden van opeengepakt weefsels is technisch uitdagend.

In een recent ontwikkelde weefsel-clearing methode, CLARITY ^3, een hydrogel ingebed biologisch weefsel is gevormd met acrylamide en lipiden worden verwijderd door elektroforese onder natriumdodecylsulfaat (SDS) bevattende oplossing. Het monster wordt dan ondergedompeld in een oplossing met een bijpassende brekingsindex lichtverstrooiing ³ verminderen. Het lipide verwijdering systeem werd later gewijzigd in geavanceerde DUIDELIJKHEID ¹³ en PACT (passieve duidelijkheid techniek) ^10. Na polymerisatie acrylamide kettingen verknopen van eiwitten, vormen hydrogel-weefsel. Lipidecomponenten kan verknopen met acrylamide; derhalve kunnen lipiden worden geëlimineerd door elektroforese onder SDS-bevattende buffer. Door de actieve verwijdering van lipiden, hersenweefsel sterk vergroot transparantie ^9. Echter, deze werkwijzen niet de onmogelijkheid van diepe etiketteren door vrije diffusie. Om deze beperking te overwinnen, zijn technieken voor actief transport van reagentia in de diepste delen van dikke weefsels vereist.

Hoewel DUIDELIJKHEID maakt weefsel clearing en deep-tissuevisualisatie, het is geen makkelijke of snelle procedure. Het kan enkele weken duren om een hele hersenen van muizen ^7,14 wissen. Rapid clearing van weefsels is essentieel voor de toepassing van dergelijke methoden om basis- of klinisch laboratorium instellingen voor biowetenschappelijk onderzoek of volume diagnose. Het huidige protocol voorziet in een vereenvoudigde procedure voor biologisch weefsel klaring en de daaropvolgende eiwit detectie door druk bijgestaan ​​levering immuno-kleuring. Het is geschikt voor high-resolution volume beeldvorming van grote ingediend en 3D-systemen voor de verwerking door de combinatie met beeldvormende methoden.

Protocol

Dierproeven moeten voldoen aan alle relevante gouvernementele en institutionele regelgeving.

1. Bereiding van reagentia

1. Voor de hydrogel monomeeroplossing (A4P0) Voeg 20 g acrylamide tot 450 ml 0,1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en het volume op 500 ml met 0,1x PBS passen.
   LET OP: Acrylamide monomeren zijn giftig. Voer alle procedures in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratorium jas, handschoenen en dichte schoenen.
   1. Onmiddellijk voor gebruik, voeg 100 mg 2,2'-azobis [2- (2-imidazoline-2-yl) propaan] dihydrochloride 40 ml hydrogel monomeeroplossing (A4P0) in een 50 ml conische buis onder een afzuigkap .
2. Voor de elektroforetische weefsel clearing (ETC) buffer: Voeg 40 g natriumdodecylsulfaat (SDS) en 12,37 g boorzuur tot 800 ml gedeïoniseerd _H2O (dH ₂ O). Breng de pH op 8,5 met NaOH en het volume aan te passen1 L met extra dH ₂ O.
   LET OP: SDS is een schadelijke chemische stof; Daarom, omgaan met zorg.
3. Voor de kubische-mount oplossing: Voeg 250 g sucrose, 125 g ureum en 125 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine en 150 ml dH ₂ O en breng het volume tot 500 ml met dH ₂ O.

2. Monstervoorbereiding & Fixation

1. Euthanasie van de muis.
   1. Bereid de alfaxalon (1 mg / kg) en xylazine (0,5 mg / kg) in dezelfde spuit.
   2. Intraperitoneaal injecteren van het mengsel van alfaxalon en xylazine en laat 3 min voor de muis om bewusteloos raken.
   3. Wacht tot de verdoofde muis niet meer reageert op pijnprikkels, zoals een staart knijpen, alvorens verder te gaan.
      LET OP: Volg de juiste institutionele richtlijnen voor de behandeling van dieren.
2. Transcardially perfuseren de muis met 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) -oplossingmet heparine (100 U / ml) exsanguinate, gevolgd door 100 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS (pH 7,4) ^14.
   LET OP: PFA oplossing is giftig. De voorbereiding van de PFA-oplossing en alle daaropvolgende behandeling moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen.
3. Snijd de muis hoofd, het openstellen van de huid, en breek de schedel tussen de ogen met behulp van een klein schaartje.
4. Verwijder stukken van de schedel met behulp van kleine, gebogen tang.
5. Haal de hersenen of het gewenste organen.
6. Incubeer de hersenen en organen in post-fix 4% PFA oplossing bij 4 ° C overnacht.
   LET OP: Voor specifieke-regio weefsel clearing, ontleden de specifieke regio of trimmen het weefsel na fixatie van het weefsel.
   LET OP: PFA oplossing is giftig. De transcardial perfusie en alle daaropvolgende behandeling muis moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen.

3. Hydrogel Monomeer Infusion en Polymerization

1. Incubeer de vaste organen A4P0 hydrogel monomeeroplossing bij 4 ° C gedurende 12-24 uur onder zacht schudden.
2. Hydrogel-monomeer gegoten polymerisatie weefsel.
   1. Breng het monster een 10 ml ronde bodem buis met 5 ml hydrogel monomeeroplossing. Wikkel de top van de ronde-bodem buis met Parafilm.
   2. Verwijder de zuurstof uit de rondbodem buis die het hydrogel geïnfundeerd geheel muizenhersenen monster door stikstof door de vloeistof gedurende 1 min. Snel en strak sluit de-monster met buis.
3. Breng de buis een waterbad (37 ° C) gedurende 2 uur.
4. Was het gepolymeriseerde monster kort met 0,1x PBS om overtollig hydrogel te verwijderen.
   LET OP: Hydrogel monomeren zijn giftig. Om huidcontact met hydrogel monomeer te voorkomen, voeren alle procedures in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratoriumjas en handschoenen.
   LET OP: gepolymeriseerde weefselskunnen worden opgeslagen in 0,1X PBS met natriumazide langer dan 2 weken bij 4 ° C.
   LET OP: Natriumazide is sterk en acuut giftig. Voer alle procedures in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratoriumjas en handschoenen.

4. Elektroforetische Tissue Clearing (ETC)

1. Breng het gepolymeriseerde monster aan een weefsel container en plaats het weefsel container in de ETC kamer.
2. Vul het ETC kamer met ETC buffer met behulp van peristatic pomp.
3. Stel de ETC voorwaarden en voer de ETC. Gebruik de volgende instellingen.
   1. Voor de ETC-instellingen voor hele organen, gebruik de volgende instellingen: (1,5 amp), temperatuur (37 ° C), looptijd (6,0 uur), toerental van de pomp (30 rpm).
   2. Voor de ETC-instellingen voor 1 tot 2 mm dik muizenhersenen plakken, gebruik de volgende instellingen: de huidige (1,5 amp), temperatuur (37 ° C), looptijd (2,0 uur), toerental van de pomp (30 rpm).
4. Transfer tHij schraapte monster een 50-ml conische buis met 45 ml 0,1x PBS. Was de ontruimde meerdere malen monster met 0,1x PBS totdat er geen luchtbellen worden gezien wanneer de buis kort wordt geschud (om de volledige verwijdering van SDS te bevestigen).

5. immunokleuring van ACT-bewerkte Tissues

1. Voor muizen volledige hersenen: Incubeer het monster in een 3-ml volume antilichaamoplossing bestaande uit 1x PBS, 6% runderserumalbumine (BSA), 0,1% Triton X-100 en 0,01% natriumazide (antilichaamverdunning oplossing) met een verdunning factor 1/500 voor tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam gedurende 4 dagen bij 37 ° C onder mild schudden. Vervang de antilichaamoplossing aan het eind van dag 2.
   1. Was het monster in een 50-ml conische buis met 45 ml 0,1x PBS gedurende 3-5 uur en veranderen de buffer per uur.
   2. Incubeer het monster in een 3-ml volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 van ezel anti-konijn secundair antilichaam 488 gedurende 4 dagen bij 37 ° C onder mild schudden. Replace de verdunde antilichaam-oplossingen op dag 2.
2. 1- tot 2 mm dik gesneden hersenweefsel: overnight of maximaal 1 dag in een 0,5- tot 1-mL volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 collageen type IV antilichaam bij 37 Incubeer het monster ° C onder mild schudden.
   1. Was het monster in een 15-ml conische buis met een 12 ml volume van 0,1 x PBS gedurende 1-2 uur. Verander de buffer elk uur.
   2. Incubeer het monster in een 0,5- tot 1-mL volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam nachts of maximaal 1 dag bij 37 ° C onder mild schudden.
3. Was het monster in 0.1x PBS gedurende 3-5 uur; veranderen de buffer elk uur.
4. Voorafgaand aan beeldvorming, incubeer het monster in een geschikte hoeveelheid kubieke mount oplossing 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Vervang met verse CUBIC-mount-oplossing en incubeer gedurende een extra 1 uur.
   NOTITIE: 76 soort van antilichamen werkte goed in de muis-ACT verwerkt weefsel, met inbegrip van 31 monoklonale antilichamen ^14. Gelabelde weefsel kan worden gecombineerd met de immunokleuring van twee fluorochromen in ACT-bewerkte weefsel.

6. immunokleuring van Dense Tissues (PRESTO)

1. c-PRESTO
   OPMERKING: c-PRESTO is geschikt voor kleine monsters, zoals hele testis, nier geheel of kleine gedeelten van grotere organen.
   1. Breng het monster in een 1,5 ml buis, voeg 500 ul van antilichaamverdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 collageen type IV antilichaam en centrifugeer de buis bij 600 x g gedurende 2 uur.
   2. Was de gekleurde monster met 0,1x PBS door centrifugatie bij 600 xg gedurende 30 min.
   3. Voeg 500 ul van antilichaamverdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam en centrifugeer bij 600 xg gedurende 2 uur.
   4. Was de gekleurde monster met 0.1x PBS door centrifugatie bij 600 xg gedurende 30 min.
2. s-PRESTO
   OPMERKING: s-PRESTO is geschikt voor grotere weefsels.
   1. Bereid een injectiespuit (30 ml volume) en sluit deze aan op een 3-weg klep (figuur 1A). Lijm de klep met een lijmpistool voor hoge-drukomstandigheden (Figuur 1B).
   2. Breng het monster in de 3-weg-klep verbonden spuit in de gesloten klepstand.
   3. Voeg 5-7 ml antilichaam verdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor collageen type IV antilichaam. Laat de antilichaamoplossing in het monster door het openen van de klep.
   4. Stel de spuit zuiger naar de 17-mL positie om voldoende ruimte voor infusie / terugtrekking laat bewegen. Dit kan in de open klepstand. Sluit de 3-wegklep naar de spuit instelling is voltooid.
   5. Zet de spuit met het monster op een injectiepomp. Stel de spuit pomp voorwaarden aan een infuus / terugtrekking volume van 10 ml / min en een 4-min pauzetijd op continue cyclus mode (figuur 1C).
      OPMERKING: De pomp blaast totdat het doelvolume (10 ml), en vervolgens de stromingsrichting verandert na een korte pauze (4 min) bereikt.
   6. Run de injectiepomp voor 3-24 uur bij kamertemperatuur (Figuur 1F).
   7. Open de 3-wegklep en vervang de oplossing met 0.1x PBS.
   8. Was het monster gekleurd tweemaal met 0,1x PBS gedurende 1 uur elke keer met behulp van de injectiepomp.
   9. Verander met antilichaam verdunning oplossing met Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (verdunningsfactor van 1/500) en laat de spuit pomp voor 3-24 uur.
   10. Open de 3-wegklep en vervang de oplossing met 0.1x PBS.
3. Voorafgaand aan beeldvorming Incubeer de gekleurde monster in een geschikte hoeveelheid kubieke mount oplossing 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Vervang met verse CUBIC-mount-oplossing en incubeer gedurende een extra 1 uur.

7. Imaging

1. Plaats de gelabelde weefsel in een confocale schotel en voeg CUBIC-mount oplossing totdat het weefsel is bedekt. Plaats een dekglaasje op het weefsel. Gebruik een confocale microscoop om de afbeelding van het weefsel ¹⁴ onder de 10x doelstelling.

Resultaten

ACT-weefsel Clearing

Een belangrijke factor die van invloed weefsel clearing is weefsel fixatie. PFA fixatie en acrylamide infuus zijn afzonderlijke stappen in dit protocol. Nadat het weefsel-hydrogel polymerisatiestap wordt het vrije A4P0 oplossing gepolymeriseerd, hoewel weefsel geïnfundeerd hydrogelen verknoopt met endogene macromoleculen. Derhalve geen gel buiten het weefsel (Figuur 2A) te vormen. De ACT procedure resulteert in minder verknoping tussen eiwitten en acrylamide vergelijking met de CLARITY protocol. Dienovereenkomstig, de weefsel-hydrogel monster poreuzer. Deze functie maakt het mogelijk een snelle winning van lipiden en de verspreiding van macromoleculen. Delen van muizenhersenen 1 tot 2 mm dikke voldoende was afgewikkeld binnen 1-2 uur (figuur 2B), en 5-6 uur ETC volstond om clearance hele muizenhersenen (figuur 2C). Hydrogel-gemedieerde weefsel clearing veroorzaakte de uitbreiding van het weefsel na de ETC stap, maar het weefsel terug naar zijn oorspronkelijke grootte in reflecterende-index aangepaste oplossing. Het weefsel-monster hydrogel gevormd in het ACT procedure is zeer poreus en dus kunnen kleine verbindingen en macromoleculen efficiënt penetreren en gemakkelijker diffunderen (figuur 3). Na een 2-uur incubatie van 1 mm hersencoupes met tyrosine hydroxylase (TH) en collageen type IV antilichaam, een volgende 2 uur incubatie met een secundair antilichaam was voldoende om dopaminerge neuronen in een 500-um diepte label (figuur 3) .

PRESTO-weefsel immunokleuring

Dichte organen algemeen hoge concentraties van ECM vezels, die de penetratie van antilichamen in de weefsels beïnvloedt. Antilichamen Penetgeschikt tot een diepte van slechts 20-30 urn in dichte weefsels zoals nierweefsel, na 12 uur incubatie. Om deze beperking te overwinnen, ontwierpen we actieve macromolecuul penetratie werkwijzen die toelaten reagentia in diepe weefsels, namelijk PRESTO (drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in de organen) (figuur 4) mogelijk. In vergelijking met de statische incubatie van ACT verwerkte nierweefsel met antilichaamoplossingen de toepassing van centrifugale krachten (600 xg) met een tafelmodel centrifuge (centrifugale PRESTO, c-PRESTO) sterk verbeterde uitvoering antilichaam in diepe weefsels (Figuur 5). Wanneer we de c-PRESTO procedure dichte weefsels toegepast, 3 uur incubatie was voldoende om een ​​label 250 tot 300 urn dieptestructuur. Het weefsel vervorming zonder significante weefselschade verbeteren, ontwierpen we ook een machine die convectie stroming met een spuitpomp (syringe PRESTO, s-PRESTO) verschaft. Dit proces evenzo verbeterd antilichaam penetration vergelijking met passieve diffusie (Figuur 5).

Figuur 1. Bereiding van de s-PRESTO inrichting. A. Een injectiespuit (30 ml) en driewegkraan. B. De driewegkraan verbonden en gelijmd op de spuit. C. De spuit met het monster en antilichaamoplossing en de spuit geplaatst op de injectiepomp. D. De spuit pomp en werkende staat setup. E. De pomp giet een oplossing die de labeling reagentia in het monster. Wanneer het aangewezen volume wordt bereikt, de pompen richtingsveranderingen en trekt de oplossing na een bepaalde periode van tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. ACT weefsel clearing van de hersenen van muizen. A. Na de polymerisatie, worden gratis A4P0 oplossingen niet gepolymeriseerd; -Weefsel infuus hydrogels worden gegeleerd door cross-linking met endogene macromoleculen. B. 1 tot 2 mm dikke hersenen plakken werden vrijgemaakt voor 1-2 uur, en de mate van expansie en de grootte herstel van de brekingsindex (RI) -Matching oplossing werden geregistreerd. C. De dikte van de gehele muizenhersenen ongeveer 0,8 cm en 5-6 uur ETC werd voldoende volledig duidelijk de hersenen. Na 3 h ETC, was er een significante hoeveelheid niet-gewist weefsel. Door 6 uur van ETC, echter, clearing van de hele hersenen had plaatsgevonden. De kleur van de weefsels na ACT in de ETC buffer is wit of ondoorzichtig. Door RI aanpassing, weefsels transparant worden. Klik op haare voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. immunokleuring met ACT ontruimd muis hersenweefsel. Beelden van ACT-bewerkte 1 mm muizenhersenen plakjes toont muizenhersenen cortex gekleurd met een antilichaam tegen collageen type IV en een deel van de middenhersenen gekleurd met een antilichaam tegen hydroxylase (TH) tyrosine. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. PRESTO immunokleuring methoden. Antilichamen kunnen niet doordringen in dichte weefsels door diffusie. PRESTO immunokleuring methoden werden ontworpen om actief te trekken macromoleculen en reagentia te leveren indichte weefsels. De toepassing van centrifugale krachten met behulp van een standaard tafelblad centrifuge (centrifugale PRESTO, c-PRESTO) aanzienlijk vergemakkelijkt de levering van antilichamen. Appling convectie stroom met een injectiepomp (spuit PRESTO, s-PRESTO) verbeterde antilichaam penetratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. PRESTO immunokleuring van ACT ontruimde dichte weefsel. Voor c-PRESTO werden weefsels gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 3 h en een standaard tafelblad centrifuge teneinde de penetratie van primaire en secundaire antilichamen versnellen. Voor s-PRESTO, werd een injectiepomp gebruikt om de antilichamen te leveren. Muis organen, zoals de nieren en de lever werden gelabeld met collageen type IV. In vergelijking met conventionele werkwijzen, 3 hc- of s-PRESTO aanzienlijk verhoogt de etikettering diepte. In de nier en lever, de diepte van de Z-as bereikt 300-350 urn of dieper in PRESTO monsters (rechts), terwijl controlemonsters worden gelabeld op een diepte van slechts 40 - 50 urn (links). Een beeld 3D gereconstrueerde werd verkregen met een confocale microscoop. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Slechte fixatie of hydrogel onderdompeling in weefsels kunnen het verlies van eiwitten en de vervorming van weefsel tijdens het weefsel clearing proces veroorzaken. De totale volwassen muizenhersenen moet worden overnacht geïncubeerd in 4% paraformaldehyde, gevolgd door onderdompeling in een minimaal volume van 20 ml hydrogel monomeeroplossing voor 12-18 uur onder voorzichtig schudden. Voor grote weefsel zoals humaan weefsel zoals de hersenen en het ruggenmerg plakjes uitgebreid inweektijd in de hydrogel monomeeroplossing vereist. De ACT-protocol is gemakkelijk van toepassing op de clearing van de vaste weefsels, omdat het weefsel fixatie en polymeer infuus stappen worden gescheiden. Na weefsel clearing, werden menselijke weefsels goed gekleurd met verschillende antilichamen. Merk op dat de ACT zuiveringstechniek is niet compatibel met fixatieven alcohol, zoals ethanol en methanol.

Het weefsel-hydrogel polymerisatie stap is ook van cruciaal belang voor een goede kwaliteit weefsel te produceren na de clearing proces. Omdatzuurstof remt de polymerisatie van acrylamide, moet worden verwijderd door ontgassing het weefsel bevattende oplossing onder een stikstofgas infusiesysteem. Als alternatief kan de-zuurstof worden uitgevoerd met behulp van een vacuümkamer met een warmte-blok voor 23 uur.

De clearing tarief is afhankelijk van tal van factoren, waaronder het orgel grootte, de inhoud van lipiden of ECM vezelachtige eiwitten, de toestand van de fixatie, enz. De meeste volwassen muis weefsels kunnen 's nachts worden gewist door ETC. Er bestaat echter een gevaar van onnodige over- clearing en weefsel zwelling; dus de verschillen in clearing tijd zijn belangrijke overweging. Tissue-clearing voorwaarden moeten empirisch worden bepaald. Belangrijker is echter dat de inhoud van de ECM het uiterlijk van het weefsel vrijgemaakt beïnvloeden. De kleur van de weefsels blijft wit of ondoorzichtig, zelfs na de ACT in ETC buffer, omdat ACT niet dichte eiwitvezels te wissen. Wanneer deze organen werden ondergedompeld in RI passende oplossing, dey werd transparant.

De snelheid van delen zwelling wordt afhankelijk van de inhoud van de ECM weefsel en zachte organen, zoals de hersenen zijn vertonen een grotere zwelverhouding dan dichte organen. Omdat verhoogde weefsel zwelling zal helpen de tissue-clearing procedure, ACT routinematig maakt gebruik van gedestilleerd water gebaseerde buffer in de meeste gevallen. In sommige gevallen, wanneer delen zwelling of voorbijgaande vervorming is niet wenselijk, zoals in embryo's, buffer die 0,1 x PBS kunnen worden toegepast voor hoge-resolutie beeldvorming. Ook moet worden opgemerkt dat hogere zoutconcentraties in de buffer de krimp van weefsel kunnen veroorzaken.

De ACT werkwijze kan hele organen en zelfs het hele lichaam van een muis ¹⁴ verduidelijken. Echter, deep-tissue beeldvorming van transparante weefsel vereist speciale microscopen en doelstellingen. Aldus hersenweefsel 1 tot 2 mm dik is het meest effectief voor beeldvorming met een conventionele confocale microscoop. In onze handen, het verwijderen van het labeled antilichamen van ACT-verwerkte weefsels antilichaamafhankelijke en rondes van verschillende antilichaam labeling wordt afgeraden. Verschillende antilichamen, zoals TH en GFAP, werkte vooral goed voor de hersenen als geheel immunokleuring ^14. Anderzijds, wat antilichamen, zoals Tuj1 of Map2, vaak aangeduid alleen het oppervlak van het weefsel. Dit kan worden verbeterd door andere werkwijzen, zoals SWITCH ^15. Een andere potentiële beperking is dat het moeilijk kan zijn om fijne eiwitstructuren in-ACT verwerkte weefsel behouden vanwege de weefselzwelling en krimp tijdens het weefsel clearing stap.

De PRESTO techniek is toepasbaar op een grote verscheidenheid aan weefsel-labeltechnieken. Bijvoorbeeld, in weefsel-transparante methoden waarbij gelabelde weefsel, zoals SeeDB ⁴ en iDISCO ^7, immunokleuring van dicht weefsel vereist incubatieperioden langer dan enkele dagen tot weken. Echter PRESTO kan de incubatietijd te verkorten tot enkele uren, enabling de voltooiing van het gehele proces binnen een dag 1 mm dik dicht weefsel. PRESTO kan de effectiviteit van deep-labeling dikke, dichte weefsel, of zelfs niet-ontruimde dikke weefsels te verbeteren. Omdat PRESTO gebruikt een tafelblad centrifuge of spuitpomp en geen speciale apparatuur nodig is het relatief gemakkelijk om deze techniek routine laboratorium procedures.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% Paraformaldehyde	Lugen SCI	LGB-1175-4B	sample fixation
Acrylamide	Affymetrix	75820	Hydrogel monomer solution
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride	Wako Pure Chemical Industries	VA-044	Hydrogel monomer solution
Boric acid	Affymetrix	76324	ETC buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix	18220	ETC buffer
Sodium hydroxide pellets	Junsei chemical	1310-73-2	ETC buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323A	Immunolabeling
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Immunolabeling
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Immunolabeling
Tyrosine hydroxylase (TH)	Millipore	AB152	Antibody/immunolabeling
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Secondary antibody/ immunolabeling
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Life Technologies - Molecular Probes	A21206	Secondary antibody/ immunolabeling
Confocal dish	SPL lifesciences	101350	Imaging
Confocal microscope	Leica	SP8	Imaging
Sucrose	Junsei chemical	31365-0301	CUBIC-mount solution
Urea	Affymetrix	23036	CUBIC-mount solution
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma-Aldrich	122262	CUBIC-mount solution
ECT chamber	Logos Biosystems, Inc.	C10101	ETC system
ECT chamber controller	Logos Biosystems, Inc.	C10201	ETC system
Temperature probe	Logos Biosystems, Inc.	C12101	ETC system
Peristatic pump	Baoding longer precision pump Co., Ltd	YZ1515X	ETC system
Buffer reservoir	Logos Biosystems, Inc.	C10401	ETC system
Tissue container	Logos Biosystems, Inc.	C12001	ETC system
Container holder for 1 tissue container	Logos Biosystems, Inc.	C12002	ETC system
Mouse brain slice holder	Logos Biosystems, Inc.	C12004	ETC system
Whole rat brain holder	Logos Biosystems, Inc.	C12007	ETC system
Peristaltic pump tubing	Logos Biosystems, Inc.	C12104	ETC system
Tabletop-centrifuge	Hanil science industrial Co., Ltd	MICRO 12	c-PRESTO
Syringe pump	Baoding longer precision pump Co., Ltd	LSP02-1B	s-PRESTO
Syringe (30 mL)	Korea vaccine Co., Ltd.	KV-S30	s-PRESTO
3-way stopcock	Hyupsung medical Co.,Ltd.	HS-T-01N	s-PRESTO