Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp Drosophila melanogaster

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het induceren van belonen en nonrewarding ervaringen in fruitvliegjes (Drosophila melanogaster) met behulp van vrijwillige ethanol consumptie als maat voor veranderingen in de beloning staten.

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het meten van ethanol zelftoediening in fruitvliegjes (Drosophila melanogaster) als een proxy voor de veranderingen in de beloning staten. We tonen een eenvoudige manier aan te boren in de vlieg beloningssysteem, ervaringen met betrekking tot de natuurlijke beloning aan te passen, en het gebruik van vrijwillige ethanol consumptie als maat voor veranderingen in de beloning staten. De aanpak dient als een nuttig instrument op de neuronen en genen die een rol-ervaring gemedieerde veranderingen in interne toestand Studie. Het protocol bestaat uit twee afzonderlijke delen: de vliegen bloot te belonen en nonrewarding ervaringen en testen vrijwillige ethanolgebruik als maat voor de motivatie om een ​​geneesmiddel beloning te verkrijgen. De twee delen kunnen afzonderlijk worden gebruikt om de modulatie van ervaring induceren als een eerste stap voor het verder stroomafwaarts assays of als zelfstandige twee libitum assay, respectievelijk. Het protocol is geen gecompliceerde installatie nodig en kan dus in geen laborator worden toegepasty met basic fly cultuur gereedschappen.

Inleiding

Wijziging van gedrag in reactie op ervaring kunnen dieren hun gedrag op veranderingen in hun omgeving passen ^1. Tijdens dit proces, dieren integreren hun interne fysiologische toestand met de veranderende omstandigheden van de externe omgeving en vervolgens kiezen voor een actie boven de andere om hun kansen op overleving en voortplanting te verhogen. Beloningssystemen ontwikkeld om gedragingen die voor de overleving van individuen en soorten zijn vereist door het versterken van gedrag dat onmiddellijke overleving verbeteren, zoals eten of drinken, of degenen die ervoor zorgen dat op lange termijn overleven, zoals seksueel gedrag of de zorg voor nageslacht ² te motiveren. Kunstmatige verbindingen zoals drugs ook van invloed op beloningssystemen door coöptatie zenuwbanen die natuurlijke beloningen ² bemiddelen.

Tijdens de laatste twee decennia, de fruitvlieg Drosophila melanogaster is opgericht als een veelbelovend model voor de studie van de Molecheid op en neuronale mechanismen die de vormgeving van de effecten van ethanol op het gedrag van ^3,4.

Eerder hebben we een subset van peptiden bevatten neuronen in vliegen (NPF / NPF receptor (R) neuronen) dat paar natuurlijke beloningen, zoals seksuele ervaring geïdentificeerd, de motivatie verkrijgen geneesmiddel ⁵ punten. NPF expressie gevoelig voor zowel seksuele ervaringen en drugs beloningen, zoals ethanol intoxicatie. Veranderingen in NPF expressie niveaus worden omgezet naar veranderingen in ethanol zelftoediening ^5, waar een hoge NPF vermindert en lage NPF verhoogt de voorkeur voor ethanol verbruikt. Activerende NPF neuronen loont voor vliegen, bevatten sterke voorkeur voor een geur gepaard met de activering, die ook tot uiting door een lagere ethanolgebruik geven. Belangrijker activatie van neuronen NPF interfereert met het vermogen van vliegen een positieve associatie tussen ethanol intoxicatie en een geur cue vormen. Het oorzakelijk verband tussen de NPF / Rsysteem, beloning geheugen, en ethanol consumptie suggereert dat men ethanol zelftoediening kan gebruiken als een maat voor veranderingen in de beloning staten ^5.

In deze publicatie tonen we een geïntegreerde aanpak voor het aanboren van de vlieg natuurlijke beloningssysteem en het testen veranderingen in de beloning staten. De aanpak bestaat uit twee afzonderlijke delen, een training protocol voor het manipuleren van natuurlijke beloning gerelateerde ervaringen, gevolgd door een twee-choice capillaire feeder assay (CAFE) naar ethanol zelftoediening te beoordelen als een schatting voor veranderingen in de beloning staten. De KOFFIE test is analoog aan de twee flessen keuze assays gebruikt knaagdieren studies voor drug zelftoediening en is aangetoond dat bepaalde eigenschappen van verslaving-achtig gedrag in vliegen ⁶ weerspiegelen.

Protocol

Opmerking: Algemeen overzicht van het experimentele ontwerp: Het experimentele ontwerp omvat een aangepast protocol voor verkering onderdrukking ^7-9 waarin mannelijke vliegen worden blootgesteld aan belonen en nonrewarding ervaringen in 3 opeenvolgende trainingen in de loop van 4 d. Aan het einde van de ervaring fase worden de vliegen getest in twee keuze vrijwillige ethanolgebruik assay voor 3-4 d. Het protocol omvat hier verscheidene voorbereidende stappen, waarvan sommige kunnen worden gedaan op voorhand worden gebruikt in meer dan één experiment, terwijl anderen moet plaatsvinden tijdig voor het begin van het experiment (tabel 1).

1. voorbereidende stappen

1. De voorbereiding van de capillaire feeder-systeem
   1. Verhit een 27 G naald en gebruiken om kleine gaten langs een flacon (figuur 1) te doorboren.
   2. Snijd de flacon plug in de helft (kruiselings) met behulp van een scheermesje. Mark vier punten op het oppervlak van de plug, waardoor een square vorm aan de capillaire houders positie in. Gebruik een 18 G naald om 4 gaten te maken door de stekker (Figuur 1b).
   3. Gebruik een scheermesje om micropipets snijden, zodat ze stevig kunnen vasthouden 5 pi glas haarvaten, die als adapters dienen.
   4. Plaats 4 capillaire adapters in de voorbereide stekkers.
   5. Markeer de positie van de 2 ethanol- en twee-nonethanol met haarvaten aan de stekker.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om de posities van de 2 soorten haarvaten consistent in alle flesjes te houden. Let op de grootte van de gaten, zoals grote gaten laten ontsnappen van vliegen uit de flesjes. Daarnaast is het raadzaam om de gladdere zijde van de plug te gebruiken (meestal tegenover de cut kant) als de kant die naar beneden kijkt, wanneer ingebracht in het flesje, zoals het snijden van de plug zorgt voor een aantal kleine, losse vezels die de vliegen kunnen verstrikt raken in .
   6. Bereid een groot aantal flesjes en adapters te worden gebruikt voor de capillaire feeder-systeem (CAFE)experimenten in stap 2.3.
2. Het voorbereiden van kleine glazen flesjes food
   1. Een dag voor het verzamelen van de vliegen (stap 1.4), regelen 200 glazen flesjes op microcentrifugebuis rekken. Melt vlieg voedsel (volgens de maïsmeel melasse recept, zie de tabel of Materials) met behulp van een magnetron. Giet 2 ml vlieg voedsel in de glazen flesjes (proberen het eten niet te smeren op de flacon muren). Laat het voedsel verharden, en hebben betrekking op de flesjes met plastic wrap.
      OPMERKING: De glazen flacon met voedsel bij 4 ° C gedurende enkele weken houdbaar.
   2. Op de dag van vliegen collectie, neem de flesjes uit de koelkast en laat ze RT te bereiken voordat u ze gebruikt om vliegen te huisvesten.
      LET OP: Als voedsel flacons zijn enkele weken oud, zorg ervoor dat het voedsel is nog steeds intact en niet los van de flacon, hemelsbreed kan worden gevangen in de spleten tussen het eten en het glas.
3. Het maken van voorraad voedsel oplossing voor het capillair feeder assay
   1. om prepare de voorraad voedingsoplossing (5% sucrose en 5% gistextract), los 5,88 g gistextract en 5,88 g sucrose in 100 ml gedestilleerd water.
      NB: De voorraad oplossing is zeer gevoelig voor besmetting. Daarom wordt aanbevolen de autoclaaf (121 ° C, 30 min, en zonder droogcyclus) en aliquot deze in 850 gl aliquots werken bij 4 ° C tot gebruik worden bewaard. De concentratie van de ingrediënten in de stamoplossing is 5,88% en de uiteindelijke concentratie van 5% bereikt na de toevoeging van 15% ethanol en water (150 ul in 850 ui premade voedingsoplossing) net voordat het bij stap 2.3.
4. Het verzamelen van experimentele vliegen
   1. Verzamel 200 naïeve man vliegen met behulp van een CO ₂ pad.
      Opmerking: Gebruik een laboratorium stam die relevant zijn voor de experimentele vraag. 250 vliegen kan gemakkelijk worden verzameld van vijf flessen vliegen naar hun Eclosion pick-fase. Bij het verzamelen van de vliegen, besteden veel aandacht aan colteer vliegen die onlangs zijn Bijlage In (vergine op zoek vliegen: heldere vliegen met een meconium vlek op hun buik). Experimentele vliegen moet afzonderlijk in kleine glazen flesjes bevattend voedsel en verouderd aan 3 blijven - 4 d oude voordat zij aan het experiment.
   2. Gebruik een zachte stekkers om de flesjes te sluiten.
      OPMERKING: Dezelfde zachte pluggen zal zeer nuttig zijn voor de training fase bij het gebruik van mond streven naar vrouwen in en uit de flesjes in te voegen tijdens de ervaring fase.
5. Verzamelen trainer vliegen
   Opmerking: Alle verzamelde vliegen moeten een 12 h / 12 h licht / donker gehouden incubator bij 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid (RH). De 12 h / 12 h licht / donker cyclus kan worden gewijzigd in een geschikte starttijd.
   1. Virgin vrouwelijke trainer vliegen
      1. Verzamel 500 maagdelijke vrouwelijke trainer vliegt van een WT bestand of virginator voorraad voor gebruik als virgin ontvankelijke vrouwtjes. Houd de vrouwelijke vliegen in groepen van 25 per regelmatige-size voedsel flacon, en alow ze leeftijd 3-4 d oude alvorens ze in het experiment.
   2. Gedekt vrouwelijke trainer vliegen
      1. Verzamel 300 maagdelijke vrouwtjes uit een WT bestand of virginator voorraad paring ondergaan voordat de trainingsfase (stap 1.6.1).
         LET OP: Vrouwelijke vliegen worden in groepen van 10 vrouwen per regelmatige-size food flesje gehouden en tot 3 jaar oud - 4 d oude alvorens te worden gebruikt in het experiment.
   3. Man vliegt gebruikt om Gekoppeld vrouwelijke trainer vliegen genereren
      1. Verzamel 150 mannelijke vliegen (niet per se maagd).
         LET OP: Vliegen worden in groepen van 15 mannen per regelmatige-size voedsel flacon en de leeftijd gehouden 3-4 d oude alvorens te worden gecombineerd met maagdelijke vrouwelijke vliegt naar de gekoppeld trainer vrouwtjes te creëren.
6. Het genereren van gedekt vrouwelijke trainer vliegen
   1. Om Gekoppeld vrouwelijke genereren vliegt om te worden gebruikt als trainers, paar groepen van 10 maagdelijke vrouwelijke vliegt met 15 mannelijke vliegt omkeren door one-man met flesje in een female-containing vial 16-18 uur voor de training fase (stap 2.1) ^10.
      NB: Dit moet normaal gesproken plaats de avond voor de training. De 1,5: 1 verhouding tussen mannelijke vliegt naar vrouwelijke vliegen verzekert dat alle vrouwen zullen worden gedekt.
   2. Op de dag van het experiment, scheiden de bevruchte vrouwtjes van de mannetjes door opzuigen van de mannetjes uit de flacon met behulp van een mond aspirator. Voer deze vlak voor het begin van elke trainingsdag.

2. Experimentele Steps

1. Het opzetten van de ervaring fase
   1. Start het experiment zo dicht mogelijk bij het begin van de lichtperiode in de incubator. Plaats de trainer vrouwen (zowel virgin en gekoppeld) in het gedrag kamer.
      LET OP: Het is aanbevolen om het experiment in een gedrag kamer, of een beschutte omgeving die is rustig en ingesteld op 25 ° C en 60 uit te voeren - 65% RV. Het houden van luchtvochtigheid meer dan 50% is erg belangrijk, omdat hofmakerij en paargedrags afhankelijk feromoon sensing, waarvan bekend is vochtgevoelig zijn.
2. Blootstellen van mannelijke vliegen naar belonen en nonrewarding ervaringen
   1. Schik de glazen flesjes met daarin de enkele mannelijke vliegen op microcentrifuge rekken, het positioneren van de flesjes langs de randen van het rack.
      LET OP: Deze regeling maakt het mogelijk de experimentator om de paren vliegen die copulatie ondergaan gemakkelijk observeren zonder dat de flesjes uit het rack.
   2. Bereid (zoals beschreven in stap 2.2.1) 2 groepen van 100 glazen flesjes met daarin enkele mannelijke vliegt op aparte rekken voor mannen ondergaan belonen en nonrewarding paring ervaringen (dwz afgewezen en gekoppeld).
   3. Zuig trainer vrouwtjes en voeg ze toe aan elke flacon met het mannelijke vliegen. Stel de timer gedurende 1 uur. Te beginnen met de verworpen groep, voeg een paarde vrouw naar elk flesje. Dan ga naar de mannetjes gedekt worden en voeg een maagd vrouw naar elk flesje.
   4. Let op de paring ontmoetingen nauwervoor zorgen dat de mannetjes interactie met maagdelijke vrouwtjes paren met succes binnen het eerste uur en dat de mannetjes interactie met de eerder bevruchte vrouwtjes niet paren. Om de afgekeurde cohort in de loop van 1 uur te controleren, stelt u een tweede timer voor 15 minuten en kijk naar de mannen om de 15 min.
   5. Kwijting de mannetjes van de afgekeurde cohort die erin slaagden om te paren en mannen uit de paarde cohort dat uiteindelijk niet de paring aan het einde van de eerste training.
   6. Eindig de eerste training door opzuigen uit de eerder gekoppeld vrouwelijke trainers in een gewone vlieg voedsel flacon, en bewaar ze voor de volgende conditionering sessie. Volg deze stap door voorzichtig opzuigen de vrouwtjes uit de gedekt mannelijke groep.
   7. Laat de vliegen rusten 1 uur.
   8. Herhaal stap 2.2.3 - 2.2.7 tweemaal.
   9. Herhaal de training in de stappen 2.2.3 - 2.2.8 elke dag voor 3 d.
3. Opnemen verbruik (CAFE)
   1. Aan het einde van de laatste conditioning sessie (vierde dag), zuigen de alleenstaande mannen en de groep hen in de capillaire feeder flesjes. Gebruik een zachte stekker aan de capillaire feeder flacon te dekken, terwijl het plaatsen van de vliegen, en snel vervangen door de kant en klare capillaire feeder plug nadat alle vliegjes zijn ingebracht. Groep 6-8 vliegt van elk van de experimentele groepen in een flesje, waardoor niet minder dan 8 flesjes per conditie.
   2. Bevochtig de pluggen door voorzichtig toevoegen van 5 ml water aan de bovenkant van de plug. Wees voorzichtig bij het toevoegen van het water te morsen in de flesjes te vermijden. Voeg dezelfde hoeveelheid water aan elk flesje.
      Opmerking: Deze stap wordt gedaan om verdamping van de capillairen. Daarom wordt elke dag herhaald voor de rest van het experiment. Afhankelijk van de relatieve vochtigheid, kan de volgende dagen minder water behoeft te worden toegevoegd aan de pluggen.
   3. Bereid twee afzonderlijke voeding oplossingen door toevoeging van ethanol of water om de voorraad voedsel monsters tot een eindconcentratie van 15% te maken.
   4. Om de capill vullenram met de twee food-oplossingen, maakt 5 ul vloeibaar voedsel druppels op een laboratorium film strip en laat de oplossing van het capillair te vullen tot aan de 5 pi markering bereikt. Zorg ervoor dat de duidelijke uiteinde van de capillair, dat dicht bij de 5 pi zwarte stip lijn te gebruiken.
      Opmerking: Om meerdere capillairen vullen tegelijk, is het mogelijk om verbinding 6 - 8 capillaire adapters elkaar en gebruiken als insert de capillairen te houden.
   5. Tik op de haarvaten zachtjes op de paraffine strip om het voedsel oplossing precies te positioneren op de zwarte stip. Verzegel de capillairen door dompelen eind van elk capillair in kleine druppels minerale olie. Deze stap minimaliseert potentiële verdamping van de voedingsoplossing.
   6. Plaats twee ethanolbevattende capillairen en twee nonethanol bevattende capillairen via 4 adapters / houders in de plug tot de buitenoppervlakken van de capillairen nauwelijks peek van de binnenzijde van de fiool (1 mm of minder van de plug oppervlak).
      NOTITIE:Het houden van de opening van de haarvaten in de buurt van de natte plug vermindert verdamping en biedt gemakkelijke toegang tot het eten, hemelsbreed normaal op de stekkers zitten en klim naar beneden op de blootgestelde capillair te voeden.
   7. Naast flesjes die experimentele vliegen bevatten, bereiden een mock flesje zonder vliegen. Deze regeling dient om de natuurlijke verdamping te beoordelen.
      LET OP: Probeer relatief gelijke plaatsing van de capillaire opening ten opzichte van de pluggen te handhaven, zoals verschillen kunnen leiden tot variabele verdamping en misleidende verbruiksgegevens. Handhaaf adequate vochtigheid tijdens het experiment en plaats de capillaire openingen zo dicht mogelijk bij de natte stekker, omdat lage luchtvochtigheid en grote afstand van de natte plug kan zowel resulteren in ongecontroleerde verdamping.
   8. Noteer de relatieve positie van de vloeistof in elk van de capillairen met betrekking tot de zwarte stip lijn in mm behulp van een liniaal en schrijf deze waarden beneden.
      LET OP: Als de oplossing exact is gepositioneerd op de zwarte line, de waarde moet gelijk nul is, en als het boven of onder, moet het positieve of negatieve waarden, respectievelijk. De beginsituatie van de vloeistof zet de referentiepunten voor de finale O / N verbruikswaarden.
   9. Stel de flesjes opnieuw in de incubator gedurende 24 uur. Vervang de capillairen op een constante tijd gedurende het gehele experiment.
   10. Verwijder de capillairen voorzichtig van de flesjes en meet de niveaus van vloeistof ten opzichte van de zwarte markeringslijn.
   11. zorgvuldig te controleren het vloeistofniveau in de mock flacon.
       LET OP: Als de niveaus gedaald meer dan 2 mm, betekent dit dat de verdamping is hoog en de consumptie niveaus zijn niet betrouwbaar.
   12. Bevochtig de stekkers voorzichtig met 2 ml water en plaats een nieuwe set van de haarvaten, zoals aangegeven in de stappen 2.3.3 - 2.3.10. Stel de flesjes opnieuw in de incubator gedurende 24 uur.
4. Het bepalen van de voorkeur
   1. Bereken het totale verbruik van elk capillair door het aftrekken van het eindniveau van de initial niveau bij het beginpunt.
   2. Combineer de waarden van beide capillairen met hetzelfde voedsel (dwz nonethanol capillairen afzonderlijk van-ethanol bevattende capillairen).
   3. Bereken ethanol voorkeur door het aftrekken van het opgenomen van de niet-ethanol capillairen van de brandstof van de ethanolbevattende capillairen hoeveelheid bedrag en de waarde delen door de totale verbruikswaarden van alle capillairen van hetzelfde flesje.
   4. Het gemiddelde van de voorkeur indexen van alle flesjes van dezelfde experimentele groep.
      
      LET OP: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Ethanol 1 (E1), Ethanol 2 (E2), Total nonethanol (Totaal NE) = NE1 + NE2, Total ethanol (Total E) = E1 + E2, Total sum verbruik (Total Sum) = Totaal NE + Total E, en Ethanol voorkeur Index (PI)

Resultaten

FPreviously, Devineni et al. toonde aan dat wanneer fruitvliegen kiezen op ethanol bevattend voedsel consumeren krijgen ze een sterke voorkeur voor ethanol bevattend voedsel via nonethanol bevattend voedsel ⁶ weergegeven. Hier worden enkele representatieve resultaten die we verkregen bij het testen van de aangeboren ethanol voorkeur van de naïeve mannelijke vliegen die niet de opleiding protocol hebben ondergaan.

Discussie

Hier illustreren we de details van een geïntegreerde aanpak om veranderingen in beloningsgericht gedrag te meten, gebaseerd op eerder werk beschreven door Devineni et al.⁶ en Shohat-Ophir et al⁵. Het eerste deel van het protocol gebruikt verschillende soorten seksuele interacties als de ervaringsinvoer, en het tweede deel gebruikt een tweekeuze voedingstest om het effect van ervaring op de voorkeur om ethanol te consumeren te beoordelen.

Zoals getoond do...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polystyrene 25 x 95 mm Vials	FlyStuff	32-109
narrow plastic vials flugs	FlyStuff	42-102
Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G	kan worden verkregen door elk bedrijf		1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2"), 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes	kimble chase	73500-1075
gekalibreerd pipetten 5 μL	VWR	53432-706	kleur gecodeerd wit om 5 μL te bevatten
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904
Sucrose, Molecular Biology Grade	CALBIOCHEM	573113
Gist extract Poeder voor microbiologie	kan worden verkregen door elk bedrijf
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221
standaard pipette Tips (micro-pijpetten)	ThermScientific	T114R-Q	volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Schaumbijspijlen)	Jaece	L800-A	past in opening 6 - 13 mm
IDENTI-PLUGS (Schaumbijspijlen)	Jaece	L800-D	past in opening 35 - 45 mm
virginator fly stock	bloomington drosophila stock center	#24638
Narrow Vials, Tray Pack (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Media Recepten en Methoden	Bloomington Drosophila Stock Center	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
propionzuur	Sigma-Aldrich	P5561
fosforzuur	Sigma-Aldrich	W290017
Methl 4-Hydroxybenzoaat	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar	kan worden verkregen door elk bedrijf
maïsmeel	kan worden verkregen door elk bedrijf
Oma's melasse	B&G Foods, Inc	niet aangegeven
droog gist	kan worden verkregen door elk bedrijf