Methodenartikel

Gecombineerde Intravital microscopie en Contrast-enhanced Ultrasonografie van het stuk van de muis om te bestuderen van de insuline-geïnduceerde vasodilatatie en spier perfusie

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54912

⸱

20 maart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Insuline-geïnduceerde vasodilatatie regelt spier perfusie en verhoogt de Microvasculaire oppervlakte (microvasculaire werving) beschikbaar voor opgeloste uitwisseling tussen bloed en weefsel interstitium. Gecombineerde intravital microscopie en contrast-enhanced Ultrasonografie is bedoeld om te beoordelen gelijktijdig insuline de actie op de grotere schepen en de microcirculatie in vivo.

Samenvatting

Het is aangetoond dat insuline de vasculaire acties tot de regulering van de insulinegevoeligheid bijdragen. Insuline de effecten op de spier perfusie regelen postprandiale levering van voedingsstoffen en hormonen aan insuline-gevoelige weefsels. Hier beschrijven we een techniek voor het combineren van intravital microscopie (GODT) en contrast-enhanced Ultrasonografie (CEUS) van de adductor compartiment van de muis stuk spier weerstand slagaders gelijktijdig te visualiseren en perfusie van de microcirculatie in vivo. Insuline de effect op meerdere niveaus van de vasculaire boom tegelijkertijd te bepalen is het belangrijk te onderzoeken relaties tussen insuline van meerdere vasoactieve effecten en spier perfusie. Experimenten in deze studie werden uitgevoerd in muizen. Ten eerste, de staart ader canule wordt ingevoegd voor de infusie van anesthesie, vasoactieve verbindingen en echografie contrast agent (lipide-ingekapseld microbellen). Ten tweede, een kleine incisie wordt gemaakt in de liesstreek bloot de arteriële boom van het compartiment van de musculus adductor. De ultrasone sonde geplaatst dan aan de contralaterale bovenste stuk te bekijken van de spieren in doorsnede. Om te beoordelen volgens basislijn parameters, de arteriële diameter wordt beoordeeld en microbellen vervolgens met een constante snelheid te schatten van de doorbloeding van de spier en microvasculaire bloed volume (MBV) worden toegediend. Wanneer toegepast vóór en tijdens een hyperinsulinemic-euglycemic-klem, toestaan gecombineerde GODT en CEUS beoordeling van insuline-geïnduceerde veranderingen van arteriële diameter, spier microvasculaire perfusie en hele lichaam insulinegevoeligheid. Bovendien kan de temporele relatie tussen reacties van de microcirculatie en de slagaders resistentie aan insuline worden gekwantificeerd. Het is ook mogelijk om follow-up van de muizen overlangs in tijd, waardoor het een waardevol hulpmiddel om te studeren van wijzigingen in vasculaire en hele lichaam insulinegevoeligheid.

Inleiding

In antwoord op een stijging van de bloedglucose niveau scheidt de alvleesklier insuline in de bloedbaan, waar het wordt snel verspreid onder haar onderzoeken weefsels, zoals skeletspieren, via weerstand aders en haarvaten. Skeletspieren is verantwoordelijk voor ~ 80% van de postprandiale glucose opname1. De levering van insuline aan de skeletspieren interstitium gebleken te zijn van een snelheidsbeperking stap voor de metabole acties van insuline die glucose verwijdering2,3,4te bevorderen. Binnen 10-15 min verhoogt insuline het capillaire bloed volume (microvasculaire werving), een effect dat optreedt voordat de totale doorbloeding stijgt5,6. Microvasculaire werving breidt de endothelial oppervlakte beschikbaar voor uitwisseling van voedingsstoffen (en insuline)7,8. Insuline-gemedieerde microvasculaire aanwerving voorafgaat aan en is onafhankelijk geassocieerd met veranderingen in skeletspieren glucose opname8,9. Het effect van de insuline op de therapieën is 'vasculaire insulinegevoeligheid' genoemd.

Het is aangetoond dat insuline-gemedieerde microvasculaire werving en insuline-geïnduceerde vasodilatatie beperkingen in zwaarlijvige Zucker-ratten-10,11 ondervinden. Bovendien, mager muizen met verminderde capillaire dichtheid spier insuline resistentie12weergeven In hun invloedrijke werk toonde Kubota et al. dat verminderde insuline signalering in de endotheliale cellen veroorzaakt vermindering in insuline-geïnduceerde microvasculaire werving, die glucose opname in skeletspier met ongeveer 40%13verminderd. Deze abnormaliteiten in microvasculaire functie treden niet alleen op in de spier, maar ook in meerdere andere weefsels en organen zoals het hart, netvlies en nier14,15,16. Deze voorbeelden en andere studies17,18,19,20 suggereren dat vasculaire effecten van insuline een belangrijk mechanisme in de (patho) fysiologie van insulineresistentie zijn en haar complicaties.

Hoewel er afdoende bewijzen dat insuline microvasculaire bloed volume (MBV) in skeletspieren5,6 verhoogt, zijn de mechanismen waarmee dit gebeurt niet volledig begrepen9. Endotheel-afhankelijke vasodilatatie is essentieel in veel aspecten van vasculaire insuline gevoeligheid21,22,23 op verschillende niveaus van de therapieën. Vasculaire insulinegevoeligheid kan manifesteren door insuline-geïnduceerde ontspanning van weerstand slagaders en ontspanning van vooraf capillaire arteriolen toe de microvasculaire uitwisseling geperfundeerd oppervlakte7,24, 25.

Intravital microscopie (GODT) is gebruikt in een verscheidenheid van weefsel preparaten, met inbegrip van huidplooien kamers van de muis dorsum26, mesenterium van de muis en rat27, modellen van ledematen ischemie in de muis28 en de hamster Wang etui 29. contrast-enhanced Ultrasonografie (CEUS) is een andere beeldvormende techniek waarmee de beoordelingvan de microcirculatie in cardiale30 evenals skeletspieren31. Het maakt gebruik van inert gas gevulde microbellen die rheologically als rode bloedcellen gedragen en blijven volledig binnen de vasculaire lumen. Deze microbellen worden intraveneus toegediend met een constante snelheid te bereiken van een steady-state. Een hoge energie echografie Golf, vervolgens kan worden gebruikt om te vernietigen de microbellen. De microbellen aanvulling snelheid in de regio van belang (ROI) vertegenwoordigt stroomsnelheid (MFV). De totale signaal intensiteit van de contrast-afbeelding vertegenwoordigt de MBV. CEUS kan herhaaldelijk worden uitgevoerd (ook bij de mens) en het heeft geavanceerde inzicht te krijgen in de vasculaire dysfunctie dat zich in insuline-resistente Staten voordoet (besproken in Barrett et al. 32).

In de huidige studie beschrijven we een nieuwe techniek voor het bestuderen van de regulering van de spier perfusie, door gelijktijdig gebruik van zowel GODT en CEUS. Hier richten we ons op de vasculaire acties van insuline in de adductor compartiment van het stuk van de muis. Dit compartiment is één van de grootste groepen van de skeletspieren in de muis, studies van lokale glucose opname in een representatieve spier inschakelen. Dit compartiment is ideaal voor GODT zoals de voorbereiding en de visualisatie van de bloedvaten gemakkelijk toegankelijk door een gestandaardiseerde chirurgische ingreep28 zijn. Bovendien, onze eigen fractie en anderen hebben aangetoond dat CEUS kan worden gebruikt in dit compartiment33,34.

Een voordeel van de gecombineerde GODT en CEUS techniek is de mogelijkheid van insuline uitwerking op het niveau van de grotere arteriolen (diervoeders of weerstand slagaders) en de microcirculatie (capillaire bedden) in de dezelfde spiergroep te kunnen beoordelen. Daarnaast is de gelijktijdige toepassing van de twee methoden biedt inzicht in de temporele werking van insuline op het niveau van de slagaders van de weerstand en de microcirculatie. Dit gecombineerd GODT en CEUS techniek kan ook worden geïmplementeerd in andere velden vasculaire biologie. Bijvoorbeeld, kan de rol van verschillende eiwitten en bepaalde pathofysiologische omstandigheden op het gebied van het endotheel bestudeerd worden met behulp van knock-out modellen. Bovendien kunnen beide technieken in één muisklik op meerdere tijdstippen vermindering van de tijd en de kosten van het onderzoek worden gebruikt.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale dierenverzorgers en ethisch comité. Het gehele protocol van inductie van de anesthesie in de muis tot het einde van de hyperinsulinemic-euglycemic-klem duurt ongeveer 2 h.

1. microchirurgische voorbereiding

  1. Induceren van anesthesie samen met analgesia in een mannelijke muis met een gewicht van 20-25 g na een 14u of 's nachts vasten met een intraperitoneale injectie van Fentanyl (0.31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) en Acepromazine (6,25 mg/kg) (FMA anesthesie) en plaats deze op een rectaal-temperatuurgevoelig warmbloedig verwarming pad die lichaamstemperatuur bij 37 ° C. handhaaft
  2. Desinfecteer de operatie tafel en de apparatuur herhaaldelijk met behulp van een alcohol-gebaseerde oplossing.
  3. Een 27 G naald hechten aan een 10 cm lange polyethyleen buis (PE-20) en bevestigt u de buis op de connector van een 4-weg. Plaats de naald in de ader van de staart en fixeren met behulp van weefsel zelfklevende gel. Deze canule zal worden gebruikt voor infusie van anesthesie, microbellen, insuline en glucose.
    Opmerking: Het toevoegen van heparine (5 U/mL) in een steriele zoutoplossing tijdens de cannulation proces voor het spoelen van de staart ader (ongeveer 10 µL) vermindert de mogelijkheid van verstopte cannulas.
  4. Tijdens de chirurgische ingrepen en experimentele protocollen, anesthesie te handhaven door een continue intraveneuze infusie van FMA verdoving via de canule ader staart snelheid van 33.75 µL/kg/min.
  5. Plaatst u de muisaanwijzer met de ventrale zijde omhoog en de voeten met behulp van een thermostable tape om het bovenbeen gebied bloot te monteren. Gebruik een lichte exorotation van het heupgewricht (stuk poten naar boven) en een hoek van 40-60° op het kniegewricht op de standaardisering van de rekken van de spier op de adductor compartiment van de dij.
  6. Verwijder de haren op de lies en bovenbeen gebieden bilateraal met behulp van een ontharende room. Verzamel alle losse haren met een vochtig wattenstaafje.
  7. Plaats de muis onder een stereomicroscoop en het uitvoeren van chirurgische volgt met behulp van 10 X tot 16 X vergroting.
  8. Maak een incisie van 2 cm, met behulp van huid schaar die parallel lopen aan de inguïnale ligament, gewoon laterale aan de abdominale kromming (Figuur 1). Breng tractie op de distale zijde van de incisie distally met behulp van een bulldog klem (Figuur 1 d). Dit zal helpen pas het venster zo nodig te helpen houden de Paraffineolie (beschreven in 1.12).
  9. Het ontleden van het vetweefsel verwijderd van de buikwand. Om te voorkomen bloeden, zachtjes de vet pad van de muur in plaats van ontrafeling rechtstreeks via de pad te scheiden. Zachte tractie op de vet pad in de distale richting vergemakkelijkt het proces (Figuur 1 c).
  10. Identificeren van de femorale slagader en volg deze tot de eerste grote takken (de epigastrische slagader en de slagader gracilis) (Figuur 2). De slagader gracilis is de eerste belangrijke tak van de femorale slagader wordt uitgevoerd op de musculus adductor magnus en vervolgens loopt diep tot de musculus gracilis. De slagader gracilis zal worden gebruikt voor GODT.
  11. Het identificeren van de transparante diepe fascia die betrekking hebben op de spieren en de schepen. Met behulp van scherpe pincet, de fascia naar boven trekken en snijd met behulp van een microscissor.
  12. Dekking van de blootgestelde spier met een druppel (200 µL) van medicinale vloeibare paraffine (kamertemperatuur of vooraf opgewarmd tot 37 ° C) om te voorkomen dat het bereid weefsel uitdrogen. Zorg ervoor dat de daling van de olie niet weg doet lekken. Aanpassen van de huidplooien van de incisie met behulp van de bulldog klem te maken van een kleine holte te houden de paraffineolie die de schepen baadt.
  13. Plaats de muis onder een eerder gekalibreerd Microscoop (16 X optische vergroting) op zodanige wijze dat de slagader gracilis verticaal op het computerscherm is. De Microscoop kunnen koppelen aan een camera en computer op basis van analysesysteem welk annuleerteken uittreksel naar de diameter van de vaartuigen van de gegevensset van de afbeelding. De diameter is de afstand tussen de twee luminal zijden van het schip. Continue monitoring en meting van de diameter van de slagader is wenselijk.
  14. Plaats de lichtbron op een voldoende afstand (minimaal 20 cm) van het stuk om hoofd geleiding van het licht.
  15. Voorverwarmde echografie transductie gel van toepassing op de bovenste contralaterale stuk. Plaats de ultrasone sonde loodrecht op de lengteas van het bot van het dijbeen.
  16. Zorgvuldig pas de hoek en richting van de sonde van de echografie een transversale beeld van de adductor spiergroep te krijgen. Zorgen om de positie van de ultrasone sonde met betrekking tot de muis stabiel te houden hetzelfde imaging vlak voor de basislijntaken en de hyperinsulinemic metingen.
  17. Laat de muis stabiliseren gedurende 30 minuten. De diameter van de slagader gracilis moet stabiel gedurende 10 minuten voordat het documenteren van de diameter van de basislijn.

2. volgens de basislijn en Hyperinsulinemic metingen

  1. Controleer of de basislijn gracilis slagader diameter is opgeslagen door het computerprogramma gebruikt voor de GODT.
  2. Bereid de microbellen tevoren als beschreven35 en graaf met Coulter strijd met een concentratie van 2, 5 x 109 bubbels/mL net voor het experiment.
  3. Zoals de microbellen kunnen alleen worden bekeken in de modus van het contrast van de echografie machine, controle van de parameters die gevolgen hebben voor de afbeelding en contrast gegevens verzameld (beschreven in 2.3.1) en gebruik consequent tijdens overname.
    1. Gebruik de volgende instellingen op de echografie machine: contrast winst op 35 decibel; de tijd krijgen compensatie op OFF; Lijn dichtheid op hoog; Aantal Focal Zones aan WIDE; Verzenden van macht tot 4%; Verzenden van bundel breedte standaard; SV poort naar 4; Gevoeligheid voor 1; Persistentie uitgeschakeld. Het niveau van de locatie van Focal Zones naar het midden van de regio van belang.
  4. Opslaan van een korte (5 s) clip. Dit zal worden gebruikt voor het berekenen van het signaal van de achtergrond.
  5. Schud de flacon met de microbellen met de hand om een uniforme schorsing. Start de microbellen met behulp van de staart ader canule met een 5 µL/min snelheid infunderen. Plaats de buis infusie op een trillende draaikolk (200 x per min) om een uniforme microbellen schorsen.
  6. Laat 5 min van continue infusie van microbellen zodat een steady-state-niveau wordt bereikt. Gaat u verder met het verkrijgen van de curven van de tijd-intensiteit van de bellen met de microbubble destruct functie (MBD) op de echografie machine op 5 min en op 10 min. na het begin van microbellen infusie (figuur 3A). Neem het gemiddelde signaal van deze twee metingen om de basislijngegevens van de perfusie.
  7. Na het verkrijgen van de basislijngegevens, start u de klem hyperinsulinemic-euglycemic als beschreven34. Gebruik de staart canule (geplaatst in 1.3) voor het beheer van de insuline en glucose (en anesthesie).
    1. Kortom, induceren een hyperinsulinemic staat door de invoering van een 200 mU/kg insuline bolus gevolgd door continue insuline-infusie (7,5 mU/kg/min) voor 60 min. gebruik een variabele infusie van 20% D-glucose te handhaven euglycemia.
    2. Evalueren bloedglucose uit de staart ader elke 5 min met een Glucose Monitoring apparaat en zorg ervoor dat u 5 mM door de infusiesnelheid variabele glucose aan te passen. Insulinegevoeligheid door het gemiddelde van de gemiddelde glucose infusiesnelheid tijdens de laatste 30 min te bepalen.
  8. Zorg ervoor dat de diameter van de slagader gracilis is gedocumenteerd in de gewenste perioden (bijvoorbeeld bij 10, 30 en 60 min) van het begin van de hyperinsulinemic-euglycemic-klem met het computerprogramma.
  9. Na 25 min en/of 55 min van de insuline-klem, start de tweede (hyperinsulinemic) CEUS meting om te documenteren van de MBV op 30 en/of 60 min, respectievelijk. Volg dezelfde stappen beschreven in 2.4 en 2.5. Loskoppelen en gebruik van de poort van de verdoving van de connector 4-weg om de infusie van de microbellen. Opnieuw koppelen de verdoving buis na het einde van het infuus microbellen.
  10. Na voltooiing van GODT en de CEUS metingen 60 min na het vertrek van insuline-infusie, trekken bloed uit de muis door een hart punctie procedure voor latere analyse. Dit zal ook de muis euthanaseren. Zorgvuldig ontleden de gracilis en femorale bloedvaten en bewaar ze voor verder gewenste experimenten (voor bijvoorbeeldWestern blots, Immunohistochemistry, ex vivo druk myography experimenten36,37, 38).

3. off line analyse

Opmerking: De analyses van GODT en CEUS metingen moeten offline worden uitgevoerd door een geblindeerde onderzoeker. CEUS biedt de mogelijkheid om te onderscheiden van de microcirculatie van grotere schepen door tijdelijk vernietigende de microbellen door hoge intensiteit ultrasone golven met behulp van de functie MBD. Het signaal (gemeten in willekeurige units (a.u)) in grotere schepen is sneller dan die in de microcirculatie hersteld vanwege de microbellen snelheid in de bijbehorende schepen.

  1. Gebruik een offline werkstation of de software op de echografie machine te doen van de analyses.
  2. Tekenen van een regio van belangen (ROI) te nemen van de microcirculatie. Teken een aparte ROI tot de grotere femorale schepen (figuur 3A).
  3. Dupliceren de microcirculatie van en grotere schepen ROIs voor de achtergrond, de basislijn en de hyperinsulinemic metingen met behulp van de kopieerfunctie van ROI gebouwd in de software.
  4. Aftrekken van het signaal van de intensiteit van de meting van de achtergrond van de basislijn en de metingen van de hyperinsulinemic.
  5. Het signaal van de intensiteit van de microcirculatie door het signaal van de intensiteit van de femorale vaartuigen verdelen. Basislijn en hyperinsulinemic MBVs kunnen nu worden vergeleken.

Resultaten

Glucose infusiesnelheid tijdens de hyperinsulinemic-euglycemic-klem (insulinegevoeligheid) was 180.21 ± 19.81 µmol/kg/min. lokale toepassing van paraffineolie op het compartiment van de musculus adductor naar het stabiliseren van het schip veranderde niet de gemiddelde basislijn diameter van de slagaders (73.6 ± 29,0 µm vs. 68.8 ± 17,9 µm; p = 0,58) maar geholpen om de variatie de dieren getest (figuur 4A). Insuline steeg consequent de diameter van de slagader gracilis (14.58 ± 6,2% in 60 min; N = 9) die verschilde significant (p < 0.0001) uit de diameter verandering veroorzaakt door zoute infusie (-6.3 ± 4,9%; N = 6). Insuline-geïnduceerde vasodilatatie was merkbaar na 10 min (10.09 ± 5,1%; p = 0.002) en ongeveer 95% van de trage maximumcapaciteit bereikt na 30 min.

Met behulp van CEUS, insuline consequent steeg spier MBV (figuur 5A) met 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0.0009) vergeleken met zoute infusie (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (figuur 5B). De gepresenteerde gegevens zijn de signaal-intensiteiten van de spier MBV gedeeld door die in het femur vaartuigen. Dit vermindert de experimentele variatie tussen verschillende metingen en tussen de verschillende muizen (gegevens niet worden weergegeven). De intensiteit van het signaal in de femorale vaartuigen komt lineair overeen met de concentratie van microbellen in de omloop (Figuur 3 c). Correctie voor de femorale schepen signaal theoretisch corrigeert voor verschillen in de concentraties van microbellen gebruikt (figuur 3D). Gegevens worden gepresenteerd in deze sectie als bedoel ± standaardafwijking.

figure-results-1
Figuur 1: Chirurgische expositie van de Adductor-afdeling van het stuk. (A) een incisie gemaakt in de lies, parallel aan de richting van de lies ligament. De zachte tractie (B) op het vet pad in de distale richtingen (zwarte pijlen) presenteren het bindweefsel (*) tussen het vet pad en de buikwand. (C) de huid plooien van de incisie kunnen worden aangepast met behulp van de bulldog klem te maken van een kleine holte te houden de paraffineolie die de schepen baadt. (D) de echografie sonde wordt geplaatst op de contralaterale bovenste stuk achter de bereid gracilis slagader wordt bekeken met behulp van een gekalibreerde Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: Intravital microscopie van de muis stuk. De femorale slagader (A) geeft aanleiding tot de epigastrische slagader (B) en de gracilis slagader (C), die over de adductor spiergroep (D loopt). De gracilis slagader wordt gebruikt voor het gebruik van een gekalibreerde Microscoop GODT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: Signaal intensiteit van Contrast-enhanced Ultrasonografie in spier microvasculaire bloed Volume en femur vaartuigen. (A) zicht op de niet-lineaire contrast modus van de digital imaging platform imaging tijdens microbellen constante infusie in het bovenste stuk van een mannelijke muis. Rechter paneel: twee ROIs te vertegenwoordigen de spier MBV en de femorale vaartuigen worden getekend. Alleen het oppervlakkige deel van het compartiment van de musculus adductor opgenomen is in de ROI als het signaal intensiteit daalt met diepte. Linker paneel: tijd-intensiteit curve van de spier MBV ROI. Verticale lijnen geven de vernietiging van de microbellen (MBD) met hoge energie golven. Onmiddellijk na de MBD ontbreekt niet geen contrast agent in de beeldvorming vlak die begint te vullen met microbellen geleidelijk. Na 10-15 s, is het hoogtepunt van de contrastverbetering bereikt. (B-D) Na een signaal van de stationaire toestand is bereikt, de infusiesnelheid van 2.5 x 109 bubbels/mL werd verdubbeld (5, 10, 20 µL/min). Signaalsterkte van muscle MBV (B) en femur vaartuigen (C) parallel aan de verdubbeling van de concentratie van de microbubble in het verkeer. (D) Correcting muscle MBV voor het signaal van de femorale vaartuigen verwijdert de variabiliteit in signaalsterkte veroorzaakt door verschillende microbubble concentraties (N = 9;-foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: Intravital microscopie metingen van de slagader Gracilis. (A) paraffineolie vermindert de variatie van de slagaders gracilis van verschillende dieren (die 29.0 µm zonder paraffine vs 17,9 µm na het toepassen van de olie) terwijl de gemiddelde basislijn diameter stabiel (73.6 µm vs. 68.8 µm; p = 0,58). (B) arteriële diameters op basislijn en na 60 min van insuline of zoutoplossing infusies. Insuline na 60 min infusie consequent de slagader gracilis uitgezet (p < 0.0001) in vergelijking met zoute infusie. (C) insuline-geïnduceerde vasodilatatie optreedt bij 10 minuten na het begin van de infusie (p = 0.002) en bereikt van 95% van het maximumbedrag op 30 min. foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking; ongepaarde Student T-test wordt gebruikt voor statistieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5: Microvasculaire bloed Volume metingen met behulp van Contrast-enhanced van de Adductor spier compartiment van de muis stuk Ultrasonografie. (A) insuline resulteerde in een consistente toename MBV 30 min na het begin van insuline-infusie. (B) het verschil tussen de hyperinsulinemic en de basislijnmetingen (MBV wijzigen) wordt aangeduid als de insuline-gemedieerde microvasculaire aanwerving. Insuline veroorzaakt een 33,5% (± 31.04%, p = 0.016; N = 7) microvasculaire werving in vergelijking met zoute infusie (-10.63 ± 27.87%, N = 6). Foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking; ongepaarde Student T-test wordt gebruikt voor statistieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

We hebben een techniek om gelijktijdig schatten insuline de vasculaire acties op de grotere aders (met behulp van GODT) en de microcirculatie van de skeletspieren (met behulp van CEUS) ontwikkeld. De kritische stappen voor een succesvolle en betrouwbare metingen zijn: 1) correct bloot de slagader gracilis zonder verbloeden; 2) voorkomen lekkage van de paraffineolie baden de slagader; 3) hebben een octrooi veneuze toegang (staart ader canule) voor infusie van vasoactieve verbindingen (insuline) en contrast agent (microbellen).

De studie van microvasculaire dysfunctie in spier is het verkrijgen van aandacht in het kader van obesitas en insuline resistentie14,25,39,40. De negatieve gevolgen van obesitas en insulineresistentie op vasculaire functie manifesteert zich op verschillende niveaus van de vasculaire boom. Verschillende benaderingen moeten voortaan beoordeelt deze wijzigingen. Het gecombineerd gebruik van de GODT en CEUS technieken in de dezelfde muis biedt een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren van de effecten van insuline op verschillende niveaus van de therapieën. GODT biedt directe visualisatie en kwantitatieve analyse van de slagader van de weerstand en CEUS zorgt voor beoordeling van insuline-geïnduceerde veranderingen in spier perfusie.

Bestuderen van het compartiment van de musculus adductor heeft verschillende voordelen. De slagaders zijn gemakkelijk toegankelijk en het oppervlakkige karakter van de incisie maakt het mogelijk om de huid incisie met een 5.0 absorbeerbare steriel hechtdraad sluiten nadat het experiment is voltooid. De dieren waren subcutaan ingespoten met buprenorfine na de experimenten als pijnstiller bij een dosis van 0,1 mg/kg en toegestaan om te herstellen in een warme omgeving. De muizen getolereerd de procedure zeer goed en we ervaren geen verlies van dieren, noch infecties van het stuk in meer dan 35 dieren studeerde. Dit maakt het mogelijk om follow-up of de dieren in een longitudinale mode bestuderen. De dieren die worden gebruikt in deze experimenten, echter waren verdoofd met behulp van 1,8% ingeademd Isofluraan evenwichtig met zuurstof stroomt op 0.4 L/min al een verdoving masker. In tegenstelling tot Isofluraan verdoving41,42verstoort FMA verdoving perifere insulinegevoeligheid niet. Een toekomstplan is om te bestuderen hoe goed de muizen herstellen van FMA anesthesie.

Het compartiment van de musculus adductor is ook nuttig sinds verschillende vasoactieve verbindingen bemiddelen lokale en stroomafwaartse vasculaire effecten kunnen worden geëvalueerd. Topische toediening van deze verbindingen naar het doelweefsel is bijvoorbeeld haalbaar met behulp van superfusion technieken28 of chirurgische manipulatie en implantatie van drug-eluerende manchetten rond de schepen43. Bovendien kan de slagader gracilis worden geïsoleerd en studeerde in de druk-myograph. Onze fractie en anderen hebben verzameld aanzienlijke experimenteel bewijs met behulp van de druk-myograph voor het documenteren van de effecten van insuline en andere vasoactieve verbindingen op deze slagader ex vivo36,37,38.

Een beperking die inherent zijn aan het gebruik van de GODT-techniek is de chirurgische expositie van de spier en toepassing van paraffineolie te stabiliseren van de schepen. Het is niet duidelijk of de oorsprong van de slagader van de invloed van deze acties. Figuur 3A blijkt echter dat de diameter van de basislijn van de slagader van de gracilis badend in paraffineolie niet aanzienlijk gewijzigd. Het heeft ook aangetoond dat minerale olie met succes de diffusie van zuurstof, het weefsel te beschermen tegen hyperoxique voorwaarden44remt. Bovendien helpt de olie te reduceren van de variatie in de diameter van de basislijn van de slagaders. Dit is de reden waarom wij voorstander van paraffineolie gebruiken en laat de rest van de voorbereiding voor minstens 30 min. Van de nota resulteerde het gebruik van gebufferde zoutoplossing in plaats van olie- of geen olie helemaal – in zeer variabel diameters en vernauwing van het schip (gegevens niet worden weergegeven). Bovendien, we aan het eind van de experimenten, geïsoleerd van de slagaders gracilis - badend in paraffineolie - en getest hun reactiviteit in de druk-myograph ex vivo. De paraffine olie-gebaad slagaders gereageerd op dezelfde manier als u wilt bepalen van de slagaders wanneer gestimuleerd met insuline en acetylcholine (een vaatverwijdende) (gegevens niet worden weergegeven). De consistente insuline-geïnduceerde vasodilatatie toont duidelijk aan dat het protocol van de GODT beschreven in deze studie betrouwbare resultaten oplevert.

Het voordeel van de toepassing van beide technieken in de dezelfde muis overwint aantal intrinsieke beperkingen van een techniek die door de andere: CEUS schat MBV in het ongestoord spier in vivo, maar individuele vaartuigen niet zichtbaar; GODT maakt het mogelijk om te zien van individuele vaartuigen, zij het niet kan MBV schatten. Een toekomstplan is om te gebruiken GODT microscopie van de Musculus cremaster in combinatie met CEUS van de adductor spier aan de contralaterale zijde. Deze wijziging kan een schatting van de MBV (met behulp van CEUS) en directe optische toegang tot de haarvaten (met behulp van GODT) opleveren. Het protocol kan verder worden gewijzigd; de 4-weg-connector gebruikt voor de staart canule kan op een 5-polige connector worden geschakeld. Door dit, kunnen we voorkomen dat het loskoppelen van de verdoving buis tijdens het uitvoeren van de tweede CEUS meting (beschreven in punt 2.9). In onze ervaring, de muizen het huidige protocol goed getolereerd. Een andere wijziging die kan worden gemaakt bij dit protocol is de insuline klem snelheid gebruikt. Gebruikten we 7,5 mU/kg/min klem tarief, die wordt beschouwd als supra-fysiologische. Afhankelijk van de studie, kan een lager tarief van de insuline klem (bijvoorbeeld 3 mU/kg/min) worden gebruikt.

Terwijl we het beschreven protocol betrouwbaar hebben gevonden, zijn er bepaalde beperkingen die aandacht nodig hebben. Er zijn situaties waarin de meting van de arteriële diameter niet optimaal is. Het uitvoeren van de stappen van de voorbereiding vereist enige ervaring met het model. Het is cruciaal dat de paraffineolie niet lek uit de omgeving van het schip als haar aan te vullen met nieuwe olie zal verstoren van het vaartuig en het veranderen van de diameter, waardoor het noodzakelijk wordt om te laten de rest van de slagader voor een andere 30 min. Daarnaast is de reflectie van het licht (beschreven in stap 1.14 van het protocol) op het oppervlak van de paraffineolie was soms ook helder, waardoor het moeilijk is om weer te geven van de slagader. Dit kan worden tegengewerkt door het regisseren van de lichtbron zodat het licht op een hoek aan de paraffineolie oppervlak en evenwijdig aan de slagader valt.

Kortom, maakt de combinatie van GODT en CEUS technieken beschreven in deze studie het mogelijk te kwantificeren van de verschillende effecten van insuline op verschillende niveaus van de therapieën. GODT van de slagader gracilis biedt inzicht in de upstream vasculaire wijzigingen bijdragen naar downstream microvasculaire perfusie gemeten met behulp van CEUS. Wij pleiten voor de combinatie van verschillende experimentele technieken in de dezelfde muis beter beoordelen de vasculaire functie.

Openbaarmakingen

Visuele Sonics Inc. bedekt de open toegang vergoedingen, overwegende dat de structuur en de inhoud van het artikel bleef de volledige verantwoordelijkheid van de auteurs.

Dankbetuigingen

Wij danken de Ing. Duncan van Groen voor het programmeren van de afbeelding analysesoftware (ImageGrabber) gebruikt in deze studie. Financiering voor dit onderzoek is verstrekt door een VIDI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (grant 016.136.372).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6 MuizenCharles RiverGebruikte muizen werden in eigen beheer gefokt
Vevo 2100 hoge resolutie echografie systeemVisualSonics inc.
MS250 niet-lineaire transducerVisualSonics inc.
Vevo 2100 softwareVisualSonics inc.
Echografiegel (Aquasonic 100, kleurloos)CSP Medical133-1009Echografiegel gebruikt om de ultrasone golven te verzenden
VortexVWR international58815-234
Verwarmingskussen Pantlab
Freestyle Precision Xceed AbbottOm de bloedglucosespiegel te meten tijdens de hyperinsulinemische-euglycemische clamp
Insulin NovorapidNovo Nordisk
Glucose monohydraat Merck Millipore1083421000
Gebufferde zoutoplossingB. Braun152118062
PE-20 medische slangBecton, Dickinson and Company427405
Naald, 27 Gauge Becton-Dickinson & Co305109
Medische tape3M
Echografie sonde houderIn eigen beheer gebouwd
WattenstaafjesMeerdere Equivalent
Creme depilatorMeerdere Equivalent
Gel weefselkleefstofDerma+flexGA30005-2222
InfuuspompHarvard ApparatusHarvard Apparatus PHD 2000
Kleine fijne rechte schaarFine Science Tools (FST)14090-09
NaaldhaakFine Science Tools (FST)12500-12
Rechte pincet met fijne puntFine Science Tools (FST)11251-20
StereomicroscoopOlympusSZX12
CameraBaslerscA1390-17gc
Image Grabber programmaIn eigen beheer gebouwdBeeldverwervingssysteem
TimerVWR33501-418
Spuiten, 1 mLFisher14-817-25
Lichtbron, glasvezelSchottKL1500Idealiter met verstelbare armen
Paraffine olieMeerdere Equivalent
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microbubbels
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine Avanti Polar Lipids850365C
polyoxyethyleen stearaat  Sigmap3440
perfluorobutaan gas F2 ChemicalsC4F10(g)
Decon FS200 ultrasone bad Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix Lantheus Medical Imaging515370-0810
Multisizer Coulter CounterBeckman Coulter Inc

Referenties

  1. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
  2. Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
  3. Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
  4. Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
  5. Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
  6. Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
  7. Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
  8. Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
  9. Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
  10. Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
  11. Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
  12. Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
  13. Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
  14. Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
  15. Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
  16. Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
  17. Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
  18. Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
  19. Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
  20. Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
  21. de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
  22. Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
  23. Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
  24. Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
  25. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  26. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  27. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
  28. Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91(2011).
  29. Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
  30. Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  31. Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
  32. Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
  33. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
  34. Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
  35. van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631(2016).
  36. Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
  37. Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
  38. Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
  39. Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
  40. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
  41. Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
  42. Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519(2014).
  43. Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
  44. Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).

Herprints en machtigingen

Tags

Arteri le diametermicrovasculair bloedvolumehyperinsulinemische euglycemische klemstaartadercanuleechoprobe
Gecombineerde Intravital microscopie en Contrast-enhanced Ultrasonografie van het stuk van de muis om te bestuderen van de insuline-geïnduceerde vasodilatatie en spier perfusie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.