Methodenartikel

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

DOI:

10.3791/54922

⸱

23 december 2016

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Sogang University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn veel chemische instrumenten waarover scheikundige probes introduceren in proteïnen om hun structuur en functie te bestuderen. Een bruikbare methode is eiwitconjugatie door genetisch inbrengen van een niet-natuurlijk aminozuur dat een functionele groep bioorthogonal. Dit rapport beschrijft een gedetailleerd protocol voor site-specific antilichaam vervoeging. Het protocol bevat experimentele details voor de genetische incorporatie van een azide-aminozuur, en de vervoeging reactie by-stam bevorderde azide-alkyn cycloadditie (SPAAC). Deze stam bevorderde reactie verloopt door eenvoudig mengen van de reagerende moleculen bij fysiologische pH en temperatuur, en geen extra reagentia zoals koper (I) ionen en koper-chelerende liganden vereisen. Daarom zou deze methode bruikbaar voor algemene eiwitconjugatie en ontwikkeling van antilichamen geneesmiddelconjugaten (ADCs) zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien de genetische incorporatie van p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli werd gemeld, zijn meer dan 1 100 onnatuurlijke aminozuren (UAAs) met succes opgenomen in diverse eiwitten. 1-3 Onder deze UAAs, de aminozuren met bioorthogonal functionele groepen zijn uitgebreid bestudeerd en vormen het grootste deel. De bioorthogonal functionele groepen die in de UAAs omvatten keton, 4 azide, alkyn 5, 6 cyclooctyne, tetrazine 7, 8 α, β-onverzadigd amide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 en bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Hoewel elke functionele groep heeft zijn voor- en nadelen, hebben de azide aminozuren het meest intensief gebruikt voor het eiwit conjugatie. p -Azidophenylalanine (AF), een van de azido-aminozuren, gemakkelijk beschikbaar, en de opneming efficiency is uitstekend. Mutante eiwitten die dit aminozuur worden omgezet met alkynen door koper gekatalyseerde cycloadditie of cyclooctynes ​​door SPAAC. 12-20

Recent zijn biofarmaceutische het aantrekken van veel aandacht in de farmaceutische industrie. Het antilichaam-geneesmiddel conjugaat (ADC) is een klasse van therapeutische antilichamen die voordelig zijn vanwege hun vermogen voor gerichte therapie voor de behandeling van humane kankers en 21 andere ziekten. Meer dan 50 ADC's zijn momenteel in klinische studies, en het aantal neemt snel toe. Bij ontwikkeling van ADCs moeten vele factoren worden beschouwd om de efficiëntie te maximaliseren en de bijwerkingen te minimaliseren. Onder deze factoren een efficiënte en plaatsspecifieke conjugatie reactie op een covalente binding tussen een antilichaam en een geneesmiddel is kritiek. De gewenste efficiëntie en specificiteit van de conjugatiereactie kan worden bereikt door conjugatie met een bioorthogonal functionele groep pernatuurlijk aminozuur dat op specifieke wijze een antilichaam is opgenomen. 22-26 Hier melden wij een protocol bij plaatsspecifiek te nemen AF in een antilichaamfragment conjugaat en het mutante antilichaamfragment met een biochemische probe.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plasmide Bouw

  1. Construct een expressieplasmide (pBAD-HerFab-L177TAG), die het doelwit antilichaam-gen (pBAD-HerFab-WT) met een Zijn 6-tag zou uiten, en vervang het codon voor leucine-177 met de amber codon (TAG) 27, met behulp van conventionele plaatsgerichte mutagenese techniek.
    Zie tabel van Materialen.
  2. Construct een andere uitdrukking plasmide (pEVOL-AFRS) die de genen voor de geëvolueerde tRNA Tyr en aminoacyl-tRNA synthetase (JAV) paar. Gebruik de speciaal ontworpen plasmidevector, pEVOL, voor een efficiënte opname van UAAs. De gedetailleerde informatie en plasmide klonen protocollen worden beschreven in het vorige verslag. 28
  3. Verkrijgen van hoge kwaliteit plasmide DNA door toepassing van commercieel verkrijgbare plasmide preparaat kits. De 260/280 verhouding van ~ 1,8 is optimaal voor het gezuiverde DNA. Desgewenst voeren 1% agarose gelelektroforese om de zuiverheid van het DNA te controleren.

2. cultuur Voorbereiding

  1. elektroporatie
    1. Voeg elk 1 pl DNA van pEVOL-AFRS 28 en pBAD-HerFab-L177TAG tot 20 pl Escherichia coli DH10β stam. Meng voorzichtig pipetteren. De plasmiden kunnen samen of in onafhankelijke reacties worden omgezet.
    2. Voor 0,1 cm cuvetten, zet de elektroporatie instellingen tot 25 uF en 2,5 kV.
    3. Plaats de cuvet in de schuif van de schokkende kamer. Duw de schuif in de kamer tot de cuvette maakt stevig contact met de kamer elektroden.
    4. Pulse eens door te drukken op de pulsknop totdat de elektroporatie apparaat piept.
    5. Voeg 1 mL super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium dat 2% (w / v) trypton, 0,5% (w / v) gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2 en 20 mM glucose de cuvette snel en het mengsel over te brengen naar een reageerbuis. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.
    6. Spread getransformeerde E. coli cellen op lysogenie bouillon (LB) agarplaten die geschikte antibiotica (35 ug / ml chlooramfenicol en 100 ug / ml ampicilline voor het selecteren pEVOL-AFRS en pBAD-HerFab-L177TAG respectievelijk). Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 12 uur.
  2. cultuur voorbereiding
    1. Inoculeer een enkele getransformeerde kolonie in 5 ml LB medium met antibiotica. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C onder schudden.

3. Expressie en zuivering van HerFab-L177AF

  1. Expressie van HerFab-L177AF
    1. Breng de primaire kweek (5 ml) in 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug / ml) en AF (1 mM), gevolgd door incubatie bij 37 ° C onder schudden.
      OPMERKING: 100 mM voorraadoplossing AF (10 ml) werd bereid door 206 mg AF in 100 mM zoutzuur (10 ml, eindvolume).
    2. Voeg 2 ml van 1,6 M arabinose (16mM uiteindelijke concentratie) als de cultuur van de log-fase (OD 550 = 0,8, OD = optische dichtheid) bereikt. Incubeer gedurende 12 uur bij 30 ° C onder schudden.
    3. Oogst de cellen door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en bevriezen van de pellet bij -20 ° C.
  2. cellysis
    1. Resuspendeer de celpellets in 20 ml periplasmatische lysisbuffer die 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sucrose en 0,2 mg / ml lysozym, en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    2. Centrifugeer het cellysaat bij 18.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe buis en gooi de pellet.
  3. Ni-NTA affiniteitchromatografie
    1. Add Ni-NTA hars suspensie aan elke centrifugebuis (400 ul hars een 200 ml kweek) en meng voorzichtig bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    2. Giet de suspensie in een polypropyleen kolom en was de hars driemaal met 5 ml wassen buffer bevattende 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazool en 300 mM NaCl.
    3. Elueer het doelantilichaam met 300 ul elutiebuffer die 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazool en 300 mM NaCl.
    4. Bepaal de concentratie van het mutante eiwit door Bradford eiwit assay 29 of door meting van de absorptie bij 280 nm. Bereken de extinctiecoëfficiënt (75.866 M -1 cm -1) voor HerFab-L177AF bij 280 nm door eiwit extinctiecoëfficiënt rekenmachine met behulp van de extinctiecoëfficiënt (2471 M -1 cm -1) voor AF.
      LET OP: De aminozuurvolgorde van HerFab kan worden gevonden in de NCBI website (GI: 783.282.791 en GI: 783.282.792).

4. Conjugatie van gezuiverde HerFab-L177AF met Acetyleenalkoholen Probes Met behulp-Strain bevorderd azide-alkyn Cycloadditiereacties (SPAAC)

  1. Voeg 20 ul van Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) in H2O (20081; M eindconcentratie) aan een oplossing van 10 uL HerFab-L177AF (10 uM eindconcentratie) in fosfaatbuffer die 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) en 100 mM NaCl.
    LET OP: Als alternatieven, difluorinated cyclooctyne (DIFO) en bicyclo [6.1.0] nonyn (BCN) derivaten zijn ook beschikbaar voor dezelfde toepassing.
  2. Laat de-stam bevorderde cycloadditiereactie men gedurende 6 uur bij 37 ° C. Als een lichtgevoelige sensor (bijv Cy5.5) wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie.
  3. Zuiver het gemerkte HerFab volgens stap 5.

5. Zuivering van gelabelde HerFab

  1. Voeg 500 ul van het monster op een centrifugaal filter spinkolom.
  2. Centrifugeer de spinkolom bij 14.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
  3. Discard doorstroom en overdracht gezuiverd monster van de spinkolom een ​​1,5 ml microcentrifugebuis.
  4. Als alternatief voor stap 5.1- 5.3 Voer Purificatie door dialyse tegen dezelfde buffer.
  5. Bewaar de gezuiverde gemerkte HerFab bij 4 ° C.

6. SDS-PAGE analyse van gelabelde HerFab

  1. Voeg 5 ul LDS eiwit monsterbuffer bevattende 106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris base (pH 8,5), 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250 en 0,175 mM fenolrood aan 13 pl gezuiverd gelabeld HerFab (7,8 uM of 0,38 mg / ml) in de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van 2 pl dithiothreitol (DTT, 100 mM eindconcentratie). Incubeer het mengsel bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
  2. Bevestig de 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel cassette aan de elektroforese cel en voeg loopbuffer. Laad het geconjugeerde eiwit monsters en de pre-lood gewicht marker moleculair. Voeren gelelektroforese 35 minuten bij 200 V.
    Opmerking: Bewaar de elektroforese cel in het donker tijdens de gehele periode van de foto-bleken van de fluorofoor te minimaliseren.
  3. Na elektroforese overdragende gel een gel fluorescerende scanner en scannen op fluorescentie-emissie bij de geschikte golflengte. Voor Cy5.5, gebruik maken van de Cy5-modus in de scanner software.
  4. Vlekken op de gel met een commerciële eiwit vlek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd een antilichaamfragment eigen specifiek een fluorofoor geconjugeerd door het opnemen van een azide-aminozuur in het fragment en het reageren van het mutante antilichaamfragment met een gespannen cyclooctyne (figuur 1). HerFab werd geselecteerd als het doel antilichaamfragment waarin AF werd opgenomen als een azide-aminozuur. Aan het residu in HerFab de vervanging AF kiezen, het röntgen kristalstructuur van HerFab geanalyseerd. 30 Bela...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De genetische incorporatie van niet-natuurlijke aminozuren in eiwitten heeft verscheidene voordelen boven andere werkwijzen voor eiwitmodificatie. 1-3 Eén van de belangrijkste voordelen is de algemene toepasbaarheid op elke vorm van eiwit. In principe is er geen beperking in het selecteren van een doeleiwit en een doelwitplaats van het eiwit. Echter kan vervanging van een structureel of functioneel belangrijke residuen met een UAA leiden tot veranderen van de structuur en functie van het doeleiwit. Algemeen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Plasmid Constructie
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptioneel bevat de amber stopcodon (TAG) op een gewenste positie. Ko, W. et al. Efficiënte en Site-specifieke Antilichaam Labeling door Strain-gepromoveerde Azide-Alkyne Cycloadditie. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., en Schultz, P. G. Een verbeterd systeem voor onnatuurlijke aminozuur mutagenese in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expressie Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Cultuur Preparatie
2.1 Electroporatie
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm elektrode gap, pkg. van 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expressie en Zuivering van HerFab-L177AF
3.1 Expressie van Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cel Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Afiniteit Chromatografie
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capaciteit
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugatie van Gezuiverde HerFab-L177AF met Alkyn Probes Gebruikmakend van Strain-gepromoveerde Azide-alkyne Cycloadditie (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Zuivering van Gelabelde HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capaciteit
6. SDS-PAGE Analyse van Gelabelde HerFab en Fluorescerende Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genetische incorporatie van azide aminozuurProtocol voor prote neconjugatieElektroporatie van E coli DH10 betaNi NTA harszuiveringSPAAC reactieconditiesSDS PAGE gelelektroforeseCy 5 5 AzadibenzocycloctynAntilichaam geneesmiddelconjugaten

Gerelateerde artikelen