Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Summary

We presenteren een methode voor het bereiken van sub-nanometer resolutie beelden met amplitude-modulatie (tapping mode) atomic force microscopy in vloeistof. De methode wordt gedemonstreerd op de commerciële atomic force microscopen. We leggen de grondgedachte achter onze keuzes van de parameters en suggereren strategieën voor het oplossen van optimalisatie.

Abstract

Atomaire krachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een gevestigde techniek voor nanoschaalbeelden van monsters in lucht en in vloeistof. Recente studies hebben aangetoond dat wanneer gewerkt wordt in amplitudemodulatie (tapping) modus, beelden met atomaire of moleculaire resolutie kunnen worden bereikt over een breed scala van zachte en harde monsters in vloeistof. In deze situaties verbeteren kleine oscillatieamplitudes (SAM-AFM) de resolutie door gebruik te maken van de gesolvateerde vloeistof aan het oppervlak van het monster. Hoewel de techniek met succes is toegepast in verschillende vakgebieden zoals materiaalwetenschap, biologie en biofysica en oppervlaktechemie, kan het verkrijgen van hoge resolutiebeelden in vloeistof nog steeds een uitdaging zijn voor beginnende gebruikers. Dit komt deels door het grote aantal variabelen dat moet worden gecontroleerd en geoptimaliseerd, zoals de keuze van de cantilever, de monstervoorbereiding en de juiste manipulatie van de beeldparameters. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van hoge resolutiebeelden van harde en zachte monsters in vloeistof met behulp van SAM-AFM op een commercieel instrument. Ons doel is om een stap-voor-stap praktische gids te bieden voor het verkrijgen van hoge resolutiebeelden, inclusief de reiniging en voorbereiding van de apparatuur en het monster, de keuze van de cantilever en optimalisatie van de beeldparameters. Voor elke stap leggen we de wetenschappelijke grondgedachte achter onze keuzes uit om de aanpassing van de methodologie aan elk specifiek systeem van de gebruiker te vergemakkelijken.

Introduction

Sinds de uitvinding, dertig jaar geleden, atomic force microscopy (AFM) ¹ heeft zich gevestigd als een techniek van de keuze voor het onderzoeken van monsters op nanoschaal, met name wanneer gemiddeld meer dan macroscopische oppervlakken is niet mogelijk en lokale informatie nodig is. In een typische AFM meting wordt de doorbuiging van een flexibele cantilever de interacties kracht kwantificeren tussen een klein aantal moleculen en een UltraSharp tip aan het uiteinde van de cantilever. Afhankelijk van het type interacties en de tijdschaal beschouwd, kan een grote hoeveelheid informatie worden verkregen, zoals de visco-elastische eigenschappen van zachte biologische membranen ^2,3, de sterkte van een enkelvoudige chemische binding of moleculaire ^4,5, de atomaire details van een oppervlakte ^6-8, de magnetische ^9, capacitieve ^{10, 11} geleidend, ^12,13 thermische en chemische ¹⁴ eigenschappen van de monsters ^{15. Een deel van het succes van AFM is de mogelijkheid om aan een breed scala van materialen 16 en in meerdere omgevingen zoals vacuüm 17, 11,18 gas of vloeistof 19,20, omdat het niet afhankelijk van een bepaalde kracht tussen probe en monster .}

In de praktijk, echter, werken de AFM in andere dan omgevingsomstandigheden kan een uitdaging en vele gepubliceerde resultaten nog steeds in lucht verkregen. Een bijkomend probleem is het feit dat het meestal noodzakelijk de AFM dynamische modus (trillende tip) om zowel tip en sample veilig te stellen door grote wrijvingskrachten werken. Hoewel meer uitdagende, dynamische werking kan in principe zorgen voor meer informatie over de geanalyseerde monster, en zonder verlies van de ruimtelijke resolutie. In de afgelopen tien jaar is het gebied van dynamische AFM in vloeibare belangrijke ontwikkelingen gezien, van de opkomst van video-rate AFM ^21-23, om meerdere frequenties metingen ^{24,25 en sub-nanometer beeldvorming van hydratatie structuren op interfaces 26-31. AFM operatie terwijl ondergedompeld in vloeistof wordt nu routinematig gebruikt in de biologie en biofysica 32-36, polymeer onderzoek 37, elektrochemie 38-40 en solid-vloeistof grensvlakken karakterisering 41-44. De aanwezigheid van vloeistof rond de trillende cantilever verandert aanzienlijk de dynamiek 45 en de interactie tussen de tip en het sample 29,42. Bij goed gebruik, kan de vloeistof worden benut beeldresolutie 26,29 verbeteren, met een typische verbetering van bijna een orde van grootte in vergelijking met de beste resolutie bereikt omgevingsomstandigheden 46.}

In AFM, de hoogst haalbare ruimtelijke resolutie voor een bepaalde meting hangt af van zowel de kwaliteit van de AFM zelf en de aard van de tHij interactie gesondeerd ^20,47,48. Op dit moment zijn de meeste high-end, in de handel verkrijgbaar AFMs huidige geluidsniveaus die dicht bij die van thermische limiet ¹² zijn zo bepalend voor de resolutie is meestal de tip-sample interactie. Het is in feite de ruimtelijke gradiënt van deze interactie dat de resolutie bepaalt: metingen gebaseerd op de korte afstand, snel rottend interactie produceren hogere resolutie resultaten dan wanneer langere afstand interacties in het spel. In vloeistof kan solvatatie krachten beeldresolutie verbeteren, omdat ze de neiging te verdwijnen over slechts enkele moleculaire diameters van de vloeistof (meestal <1 nm) bij het verplaatsen van het oppervlak van het monster ^49. Deze komen voort uit de interactie tussen de vloeibare moleculen en het oppervlak van het monster. Een vloeistof met een sterke affiniteit voor het oppervlak de neiging om meer geordende en minder mobiel dan bulkvloeistof aan het grensvlak met het monster ^29,42,50. Als gevolg,het zal meer energie te nemen voor een trillende AFM tip om grensvlak vloeistof moleculen verdringen dan vloeibare bulk ^42, waardoor de meting zeer gevoelig voor lokale variaties in het grensvlak vloeistof eigenschappen op nanoschaal -de solvatatie landschap.

Om solvatatie krachten te benutten, moeten verscheidene praktische aspecten in overweging te nemen. Ten eerste, de trillingsamplitude van de punt moet vergelijkbaar met het bereik van de solvatatie krachten zijn, typisch <1 nm. Ten tweede, de vloeistof die moet welomschreven solvatatie landschap aan het oppervlak van het monster te vormen. Macroscopisch is dit gelijk aan die een "bevochtiging" vloeistof voor het proefmonster. Bijvoorbeeld, in het water is het makkelijker om resolutie over hydrofiele mica dan op hydrofobe grafiet ^42,51 moleculair niveau te bereiken. Ten slotte moet de veerconstante van de cantilever ondersteunen het uiteinde geschikte ^52,53 geselecteerd. Bij het werken in deze convoorwaarden, de AFM niet alleen moleculair niveau afbeeldingen van de interface, maar het vloeit ook informatie over de plaatselijke sample-vloeistofaffiniteit die kan worden gebruikt om chemische informatie over het oppervlak van het monster ⁵⁴ te verkrijgen.

De meest voorkomende dynamische modi voor AFM in vloeistof amplitude-modulatie (AM, ook 'tapping mode'), AFM en de frequentie-modulatie (FM) AFM. In het eerste geval ^55, de tip-raster scant het monster terwijl de trillingsamplitude door een terugkoppellus die continu opnieuw past de tip-sample afstand constant wordt gehouden. Een topografisch beeld van het monster wordt verkregen door de terugkoppellus toegepaste correctie. FM-AFM ^28,41,56, is de oscillatiefrequentie van de cantilever / tip die constant wordt gehouden terwijl de tip scant het monster. Beide technieken bieden vergelijkbare topografische resolutie in vloeibare ^36,57. Kwantificering van de tip-sample interactie heeft de neiging om meer te zijn Straightforward en nauwkeurig in FM-AFM, maar AM-AFM is eenvoudiger te implementeren, meer robuuste, en maakt het werken met zachtere uitkragingen, iets nuttigs voor het bestuderen van gemakkelijk vervormbare of delicate samples. Significant, AM-AFM is wijdverspreid onder AFM gebruikers, deels om historische redenen, maar ook vanwege het feit dat het technisch gemakkelijker te geleiden.

Hoewel de amplitude constant door de terugkoppeling tijdens de AM-AFM beeldvorming wordt gehouden, wordt de fase-lag tussen de tip oscillatie en de drijvende oscillatie toegestaan ​​om vrij te veranderen. De fase-vertraging kan nuttige informatie verschaffen over de tip-sample interacties, is gerelateerd aan de energie afgevoerd tijdens oscillatie van de tip op het grensvlak met het monster ^58. Vandaar fase-beeldvorming kan gelijktijdig worden verworven topografische beeldvorming en vaak complementair aandacht voor de heterogeniteit van een monsteroppervlak. Fase beeldvorming is gebruikt voor diverse mapping interacties, waaronder direct in kaart brengen van de hechting energie ^42, visco-elastische eigenschappen ⁵⁸ en de hydratatie landschap van een interface ^44.

Praktisch, verkrijgen van hoge resolutie beelden in vloeistof blijft niet-triviale vanwege het grote aantal parameters te controleren, en het ontbreken van een eenvoudige, systematische protocol dat werkt in elke situatie. Beeldkwaliteit is meestal afhankelijk van de cantilever geometrie en elasticiteit, de punt chemie, de oscillatieamplitude, en het monster stijfheid oa ^55. AFM metingen ook per definitie perturbatieve het systeem. Hierdoor veranderen imaging variabelen en omgevingsomstandigheden zonder overdenking kan leiden tot moeilijkheden bij reproduceerbaarheid en / of misrepresentative observaties en valse resultaten.

Hier presenteren we ons protocol voor het bereiken van een hoge resolutie beelden van harde en zachte samples in oplossing, met behulp van commerciële instrumenten gebruikt in amplitude-modulatie. Ons doel is om een ​​praktische procedure bieden voor het optimaliseren van de belangrijkste parameters kans om de resolutie te beïnvloeden over verschillende monsters, uit te leggen in elk geval de redenen voor onze keuzes van de fysische principes die ten grondslag liggen aan de beeldvorming proces. We detail een stap-voor-stap benadering van het substraat reiniging en voorbereiding van de keuze van cantilever, aanpassing van de beeldvormingsparameters en de meest voorkomende problemen oplossen. Uitleg over de wetenschappelijke gedachte achter onze keuzes en procedures voor hoge-resolutie zou moeten helpen het maken van rationele keuzes bij de aanpassing van de methodologie, en dienen als uitgangspunt voor de beeldvorming nieuwe systemen.

In deze tekst gebruiken we AM te verwijzen naar de amplitudemodulatie werkingsmodus van een AFM. We verwijzen naar de parameter feedback constant gehouden tijdens ofwel de cantilever doorbuiging (contact modus) of oscillatie amplitude (AM-modus) als de gewenste waarde. In de AM-modus, wordt de cantilever extern gedrevenhetzij door een akoestische trilling of door een gepulste laser gericht aan de basis van de cantilever. De aansturingsamplitude is de intensiteit van de externe oscillerende signaal. De absolute waarde van de amplitude schijf om een ​​bepaald trillingsamplitude van de cantilever te bereiken hangt af van vele parameters, zoals de wijze van besturen (akoestisch, fotothermische of magnetisch), cantilever fixatie en parameters (stijfheid, geometrie) en laseruitlijning. De exacte waarde van de aandrijving amplitude derhalve niet relevant maar wordt aangepast elk experiment teneinde een geschikte (en kwantificeerbare) trillingsamplitude van de cantilever verschaffen. Wanneer de aangedreven cantilever ver van het monster en geen demping van de trillingen vindt plaats via tip-sample interacties, wordt de trillingsamplitude zogenaamde vrije oscillatieamplitude. Aangezien de trillende tip nadert het oppervlak van het monster, de amplitude begint te dalen. Als de feedback is ingeschakeld, zal de z-piëzo constantly opnieuw aan te passen de uitbreiding ervan, zodat de geselecteerde setpoint amplitude kiel, constant. De gewenste waarde is normaal gesproken altijd kleiner dan de vrije amplitude. Het is gebruikelijk om naar de gewenste waarde, de verhouding van de gewenste amplitude (imaging amplitude) via vrije amplitude. Hoe kleiner de gewenste verhouding, hoe harder de beeldvormende voorwaarden.

Protocol

1. Reiniging gereedschap en andere oppervlakken

OPMERKING: Wanneer het streven naar een hoge resolutie, kan elke vorm van besmetting nadelige gevolgen hebben. Het is daarom noodzakelijk om ervoor te zorgen alle instrumenten die worden gebruikt om te manipuleren van het monster, substraat of AFM tips worden grondig gereinigd. Het volgende geldt voor elk oppervlak of instrument (bijvoorbeeld pincetten) die in contact met het monster, cantilever AFM cel, inclusief de monstertafel zelf kan komen.

1. Bad ultrasone trillingen instrumenten in ultrazuiver water (18,2 MQ, <5 ppm organische), gevolgd door isopropanol (99,7% zuiverheid), gevolgd door opnieuw ultrazuiver water, elk gedurende 10 min. Gebruik indien mogelijk isopropanol onder een zuurkast om inademen van dampen te verminderen.
2. Droog onder een stikstofstroom.
3. Als volledige onderdompeling niet mogelijk is (bijvoorbeeld voor cantilever houder / elektronica), fysiek schoon het oppervlak schoon met enkellaags, pluisarme weefsels (lichte weefsels ruitenwissers) gedrenkt in ultrapuopnieuw water, isopropanol en ultrapuur water, sequentieel. Laat het oppervlak drogen in lucht (meestal binnen 15 tot 30 min).

2. Voorbereiding van de ondergrond

Opmerking: Het substraat duidt het vaste oppervlak direct ondersteunen van de monsters, typisch in contact komen met zowel de AFM scanner en het monster. AFMs meeste hebben een magnetische stand en stalen schijven kunnen worden gebruikt, maar hetzelfde protocol is ook geschikt voor substraten zoals glasplaatjes. Hier gaan we uit een stalen schijf waarop een mica schijf is aangebracht. Het doel van deze procedure is om zoveel mogelijk externe contaminatie die de beeldvorming kan beïnvloeden beperken. Handschoenen moeten worden gedragen ten alle tijden.

1. Bad ultrasone trillingen de stalen monsterdisk in ultrazuiver water (18,2 MQ), gevolgd door isopropanol en tenslotte door ultrazuiver water weer, elk voor 10 min.
2. Droog de schijven onder een stikstofstroom.
3. Bereid een kleine hoeveelheid epoxylijm met reagentia grondig gemengd en plaats ~ 1081, l op de stalen schijf.
4. Bevestig het substraat (muscoviet mica, SiO ₂ kristal, glas, enz.) Aan de stalen schijf door druk op het substraat. Laat de epoxy uitharden gedurende verscheidene uren bij een verhoogde temperatuur (zie specificaties van de fabrikant).
5. Voorkomen dat epoxy direct wordt blootgesteld aan de lucht, de randen van het substraat. Dit zal gebeuren als overmatige hoeveelheid epoxy wordt gebruikt en kunnen een bron van besmetting geworden.
   1. Een mica substraat krachtig op ~ 2,5 cm breed plakband op het substraat, zodat het hele gezicht bedekt, en soepel afschilferen. Met mild plakband en schil de mica door evenwijdig aan het oppervlak te trekken. Het verwijderde materiaal zichtbaar op de band. Herhaal dit proces 2-3 keer, totdat de mica spiegelgladde voor het oog.
   2. Voor glas / SiO _2, indien verdere chemische modificatie van het oppervlak nodig is, herhaal dan de bad-sonicatie routine stappen 2,1-2,2. U kunt ook gebruik maken van Ublootstelling V-eenheid (18 W UV-C kiemdodende lampen) gedurende 30-60 min, afhankelijk van het vermogen) op alle organische stoffen die kunnen worden overgelaten aan de oppervlakte pyrolyseren. Deze procedure maakt ook het oppervlak meer hydrofiel zonder aanzienlijke verhoging van ruwheid.

3. Voorbereiding van Cantilever en Tip

1. Dompel de cantilever chip in een bad van isopropanol, gevolgd door ultrazuiver water, elk gedurende 60 min.
2. Wanneer de cantilever / tip vereist intensieve reiniging (bijvoorbeeld na langdurige opslag in geldoos), voeg een 30 min onderdompelen in aceton (> 99,5% zuiverheid) vóór stap 1 (zie ook afdeling aan verontreiniging). De opslag tips gel in dozen is, in onze ervaring, een van de primaire bron van besmetting die zeer snel kan ⁵⁹ plaatsvinden.
3. Maak de tip licht kort (<5 min) UV teneinde de vorming van stabiele hydratatie plaatsen ⁶⁰ bevorderen. Vermijd langere overbelichting keer als het de tip of inc kunnen beschadigenrease de kromtestraal.
4. Plaats de cantilever in de AFM cantilever houder en pipetteer ~ 50 pi imaging-oplossing (de aard van de oplossing hangt af van het monster dat wordt onderzocht, maar gebruikt in dit geval een 10 mM oplossing van rubidium chloride in ultrazuiver water) op de cantilever en kantel het om natte pre; Dit zal het verschijnen van luchtbellen te beperken bij het naderen van het monster.

4. Set-up van de AFM Cell

1. Monteer het monster schijf en substraat op de monstertafel en voeg een druppel imaging vloeistof (vloeibare kenmerkend 2-3 mm dik op het hoogste punt).
2. Sluit de cantilever houder aan de AFM.
3. Breng de cantilever en sample in dichte nabijheid teneinde een capillaire brug tussen de vloeistoffen op cantilever / tip en het monster vormen.

5. initialiseren Meting en kalibratie van de cantilever

1. Lijn het meten laser (meestal rood) in de buurt van de top-end van de cantilever. Afhankelijk van het AFM-model, dat doen hetzij via software-instellingen of door handmatige instelling van de laser positie. Verwerven thermische spectrum van de cantilever in vloeistof (zie figuur 1A). De werkwijze neemt de thermische fluctuaties van de cantilever met de laser, om de frequentie van resonantie van de belangrijkste cantilever's (fundamentele eigenmode) vinden. In de meeste moderne AFM gebeurt dit door geautomatiseerde procedures in de software-instellingen, maar gegevens kunnen per AFM AFM.

Figuur 1: Tuning en het kalibreren van de cantilever. A: thermische ruis spectrum van verticale doorbuiging van de cantilever's (zwart) met een eenvoudige harmonische oscillator (SHO) fit van de fundamentele eigenmode (rood). Hier is de resonantie is 18,7 kHz in water. De eerste drie resonantiefrequenties die overeenkomen met de eerste drie buigzame eigenmodi zijn highligewoge n met blauwe pijlen. B: De kalibratie van de cantilever de Inverse Optical Lever Gevoeligheid. De lineaire doorbuiging van de cantilever gedrukt tegen een stijf (niet-vervormbaar) oppervlak wordt gebruikt om de conversiefactor (InvOLS) tussen de afwijking gemeten in volt en de bijbehorende waarde in nanometer meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Neem een vervorming versus curve afstanden de cantilever op een stijf substraat (bv, mica of glas) en kalibreer de afbuiging door het opleggen dat de helling van de curve in de lineaire afbuiggebied (zoals in figuur 1B) is eenheid ^61-63.
   OPMERKING: Dit proces vindt de omrekeningsfactor tussen de gemeten afbuiging van de fotodetector (in volt) en de reële doorbuiging van de cantilever (in nanometers) - known als het omgekeerde Optical Lever Sensitivity (InvOLS). De kalibratie kan de tip beschadigen, dus het is beter om het uit te voeren nadat alle metingen zijn voltooid. Gebruik de InvOLS afgeleide waarde voor een cantilever van dezelfde soort in een voorgaand experiment een schatting (gewoonlijk> 90% nauwkeurig) van de werkelijke amplitude voordat kalibratie.
3. Monteer de resonantie piek in de thermische spectrum met een eenvoudige harmonische oscillator model ^64-66 aan de veerconstante van de cantilever opleveren. Deze procedure is geautomatiseerd meeste AFM software en meestal niet vereist specialistische kennis van dat model.
4. Tunen van de cantilever. Vind de amplitude respons van de cantilever bij uitwendig aangedreven (bijvoorbeeld akoestisch of fotothermische excitatie) over een bereik van frequenties dicht bij de nominale resonantiefrequentie. Stel de aandrijffrequentie de bij de maximale in dit spectrum, iets naar links. Als de cantilever is Acoustically gedreven, vele valse maxima kan verschijnen bij het stemmen.
   1. Selecteer een resonantiepiek zo dicht mogelijk (binnen de omhulling van) de resonantie die in de thermische spectrum met de besturingssoftware van de AFM maar details kan afhangen van het type software versie die de AFM controleert.

6. Aanpak en eerste controle van Monster

1. Stel de aandrijvende amplitude zodat het vrije trillingsamplitude ongeveer 5 nm. Dit komt in principe overeen 0,2-0,8 V op de meeste AFMs (indien de InvOLS niet gekalibreerd). Stel de amplitude setpoint ~ 80% van de vrije amplitude.
2. Stel de feedback krijgt relatief hoog (de absolute waarde is afhankelijk van de AFM), maar voorkomen dat instabiliteit of beltoon optreedt.
3. Stel de eerste scan snelheid en grootte van de scan om kleine waarden (bijvoorbeeld om ~ 1 Hz en 10 nm respectievelijk). Dit helpt bij het behoud van de tip in het geval een aantal feedback parameters slecht zijn afgestelddoor het vermijden scanning over grote afstanden. De scan grootte kan vervolgens worden verhoogd tot een hogere waarde (bijvoorbeeld 100 nm) indien de scanvoorwaarden verschijnen geschikt.
4. Bepaal de geschatte lengte van het oppervlak (in sommige gevallen optisch moet gebeuren) vóór aanpak.
5. Initiëren aanpak van de punt aan het oppervlak met behulp van de AFM besturingssoftware. De fijne details van dit proces is afhankelijk van het model van AFM en software.
   1. Als er problemen zijn met de aanpak zijn bij het gebruik van een zachte cantilever, het gedrag van de aanpak in contact mode. In dit geval is ervoor te zorgen dat de winsten zijn lager dan in de AM-modus, en stel het setpoint op een relatief lage waarde (0,1-0,2 V na het centreren van de laser op de fotodetector) tot aan de punt te behouden.
   2. Beoordelen of de tip het oppervlak heeft bereikt zonder opnieuw te beginnen om het met iets veranderen van de gewenste waarde (verhoging in contact modus of afname van de AM-modus). Of het dopje aan de oppervlakte, het effect op te verlenging van de Z-piëzo moet verwaarlozen. De live bewegingen van de Z-piëzo gewoonlijk grafisch weergegeven in de besturingssoftware van de meeste AFM. Als de gewenste verandering veroorzaakt een zichtbare beweging van de piëzo, is er een verkeerde grijpen. In het laatste geval herstart de benadering van de actuele positie uiteinde, met een iets hoger (contact) of lager (AM) setpoint.
6. Zodra de punt van de grond heeft bereikt, trek de Z-piëzo (meestal door gewoon op 'stop') en opnieuw af te stemmen de cantilever (herhaal stap 5.4.); de resonantiefrequentie zal waarschijnlijk zijn verschoven naar een lagere waarde als gevolg van tip-sample interacties.
7. Verander het setpoint tot ~ 80% van de nieuw afgestemde gratis amplitude (in deze tip-sample afstand).
8. Schakel de cantilever en voeren een 10 × 10 nm ^2-scan van het oppervlak in de AM-modus om te controleren of de imaging parameters zijn geschikt.
   1. Controleer of de trace (scannen van links naar rechts) en terugvinden (scannen van rechts naar links)profielen over elkaar. Indien niet verder te verminderen het setpoint en probeer het verhogen van de winst.
   2. Verlaag de winst als het beeld wordt luidruchtig.
9. Herhaal deze stappen een grote - 1 x 1 micrometer ² tot 5 x 5 micrometer ² - toont het monster mits beschikbaar. Op zachte of biologische monsters, kan dit een verontreiniging van de tip tot gevolg.

7. High-resolution Imaging

1. Verminder de grootte van de scan op een waarde die geschikt zijn voor het visualiseren van de functies (bijvoorbeeld 100 x 100 nm ² voor eiwitkristallen of 20 × 20 nm ² voor mica of calciet).
2. Verminder de aansturingsamplitude van de cantilever genoeg voor de terugkoppellus zich automatisch intrekt de Z-piëzo en daardoor de tip van het oppervlak. Terwijl de cantilever van het oppervlak, stel de aansturingsamplitude zodat de cantilever amplitude ~ 1-2 nm (piek-piek).
3. Met behulp van de AFM besturingssoftware, Progrestend verminderen setpoint enkele tientallen mV in tot de Z-piëzo opnieuw uitstrekt naar het oppervlak en het oorspronkelijke beeld wordt teruggewonnen. Houd de gewenste amplitude tussen 75% en 95% van de nieuwe vrije amplitude.
4. Stel de winst met behulp van de AFM besturingssoftware; hogere winsten kunnen worden gebruikt bij lagere amplitudes zonder dat er veel lawaai.
   1. Herhaal de stappen 7,2-7,4 teneinde de beste combinatie van vrije amplitude setpoint bepalen en krijgen voor hoge resolutie. De optimale omstandigheden afhangen van het monster (solvatatie landschap en bevochtigingseigenschappen van de vloeistof), maar ook de cantilever (veerconstante, stijfheid).
   2. Bekijk verschillende combinaties van amplituden aan beeldvorming te optimaliseren. Het kan nodig zijn opnieuw te verhogen de vrije amplitude ⁴² zijn. In dat geval moet u eerst het instelpunt op een hogere waarde en vervolgens krachtiger aandrijving (dwz omgekeerde volgorde dan gebruikt om de amplitude te verlagen).
   3. Houd de setpoint amplitude in het gebied van 0,5 nm - 1,5 nm (piek tot piek) regelwaarde verhoudingen bleef boven 0,7 (kenmerkend 0,75-0,95). Voor solvophilic interfaces, gebruiken uitkragingen met een veerconstante van 0,5-2 N / m. Dit is voldoende voor de tip de meeste grensvlak vloeistof te verwijderen zonder het raken van het oppervlak. Een vuistregel is voorgesteld in eq. 4 van referentie ^29.

Results

De in de vorige paragraaf beschreven protocol is met succes toegepast op verschillende commerciële AFMs moleculair of atomair niveau beelden te verkrijgen. Alle beelden werden verkregen met het werken amplitudes tussen 0,5 nm en 1,5 nm aangepast individueel na de procedure stappen 7,1-7,4. Resultaten kunnen worden verkregen over een breed gebied van zachte (figuur 2) en stijf (figuur 3) monsters. In elk geval worden de belangrijke kenmerken gemarkeerd. Een van de grote voordelen van de techniek is dat kleine oscillatie amplitudes en hoge set-punten minimaliseren van de kracht die wordt uitgeoefend door de tip over het monster, waardoor kwetsbare zelf-assemblage van lipiden (figuur 2A), eiwitten (Figuur 2B en D), en amfifiele moleculen (figuur 2C) te beelden zonder schade in oplossing. Hardere kristallijne materialen zoals mineralen (Figuren 3A, B, D) enenkelvoudige metaalionen geadsorbeerd op een oppervlak (figuur 3C) worden afgebeeld volgens de methode, omdat in elk geval is het grensvlak vloeistof die effectief is afgebeeld de beschreven protocol. De solvatatie krachten vergelijkbaar op de getoonde figuren 2 en 3 monsters: alle monsters zijn hydrofiel (meer algemeen, "solvophilic" voor van de figuren 2C, 3B, 3D) ten opzichte van de imaging-oplossing. Consequent, cantilevers vergelijkbare stijfheid (0,2-0,8 N / m) werden in alle gevallen. Zowel het monster en de punt moet solvophilic ervoor te zorgen dat vloeistof moleculen vormen een goed gedefinieerde solvatatie structuur die kan worden afgebeeld. Dit is niet altijd voldoende, maar in de meeste gevallen en voor relatief kleine moleculen vloeistof, de vloeistof opnieuw structuren zich op een manier die het monster symmetrie nabootst. De belangrijkste oorzaak van de hoge-resolutie is de lokale variatie in de affiniteit van de geadsorbeerde oplosmiddel moleculende oppervlakken (Ångström schaal, in het geval van de figuren 2A, 3A, 3C). De techniek is zo uitstekend geschikt voor stof, waarvan de structuur varieert oplosmiddel grotendeels over het oppervlak.

Figuur 2: Zachte interfaces afgebeeld door AM-AFM in waterige oplossingen. A: dipalmitoylfosfatidylcholine (DPPC) lipide dubbellaag in gelfase afgebeeld in in 150 mM KCl. De-hexagonaal verpakt lipide kopgroepen zijn te onderscheiden in zowel de topografie en fase, samen met de lokale contrast met vermelding van plaats-specifieke variaties in de hydratatie. B: Purple membranen van Halobacterium salinarum afgebeeld in 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7,4. Verschillende bacteriorhodopsine eiwit trimeren worden gemarkeerd. De fase vertoont een contrast anders topografie vanwege lokale hydratatie plaatsen op het eiwit. Individuele eiwit trimeren kan worden gemaakt (stippellijnen). C: Amfifiele kleurstof (Z907) geadsorbeerd aan het oppervlak van een TiO ₂ nanodeeltjes in een kleurstof-gesensibiliseerde zonnecel. Het beeld werd in ethyl-isopropyl sulfon verworven. Het sponsachtig uiterlijk wordt gecreëerd door de geadsorbeerde kleurstof moleculen. D: Aquaporin kristal in natief runder lens membranen afgebeeld in dezelfde buffer B. Een aquaporine tetrameer is gemarkeerd. Sub-structuur die overeenkomt met inter-spiraalvormige loops zijn zichtbaar in de topografie, terwijl fase een opvallend verschillend contrast toont als gevolg van de ongewone gedrag water in de buurt van het eiwit. De beelden zijn afgeleid refs ³⁶ (B), ref ³⁸ (C) en referentie ⁶⁷ (D). De schaalbalk is 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm in (C) en 15 nm (D) de kleurschaal geeft respectievelijk hoogte en fasevariatie van 200 pm en 15 ° (A), 600 uur en 4 ° (B), 2,5 nm en 2,5 ° (C) en 1,6 nm en 9,5 ° (D).load / 54924 / 54924fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve AM-AFM afbeeldingen harde monsters in vloeibare oplossingen. A: calcietkristal [ ] Surface afgebeeld in een evenwicht gebracht ultrapuur water oplossing. B: Strontiumtitanaat afgebeeld verkregen in dimethylsulfoxide (DMSO). Hoge resolutie is niet mogelijk in het water. C: Moskoviet mica afgebeeld in 3 mM RbCl - één geadsorbeerd Rb ⁺ -ionen zijn zichtbaar op rooster plaatsen van de mica's in zowel de fase en hoogte scans. D: silicium carbide in beeld gebracht in DMSO. De verwachte kristallografische bepalingen zijn weergegeven in afbeeldingen B en D. De beelden zijn afgeleid ref ⁶⁸ (A), ref ⁴² (B en D),en ref ⁴⁴ (C). De schaalbalk is 3 nm (A, B, D) en 5 nm (C). De kleurenschaal geeft respectievelijk hoogte en fasevariatie van 250 pm en 14 ° (A), 600 pm en 5,5 ° (B), 800 pm en 15 ° (C) en 500 pm en 3,5 ° (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Aangenomen dat de beeldvormende vloeistof en de cantilever stijfheid passende wijze zijn geselecteerd, de meest kritische stappen voor bereiken van succesvolle hoge resolutie is de aanpassing van de amplitude beeldvorming, en de algehele zuiverheid van het systeem onderzocht.

Amplitudes vergelijkbaar met de dikte van het grensvlak vloeistofgebiedje (typisch minder dan 2 nm) sondes hoofdzakelijk variatie in de eigenschappen van het grensvlak ⁴² oplosmiddel. Als de oscillatie amplitude te groot is, zal de trillende tip dwars lange afstand, niet-lineaire krachtvelden ⁵² dat de stabiliteit van cantilever beweging voorkomen, en onvermijdelijk sloeg het monster, ongeacht de beeldvormingsomstandigheden ^29, wat resulteert in verslechtering van de resolutie. Naast het verlies in resolutie, hogere harmonischen beginnen te verschijnen in de top beweging en het systeem ingewikkelder model ^55. Een defect imaging amplitude te klenly de interface wordt geprobed (gewoonlijk specifieke lagen van het grensvlak vloeistof) en stabiele beeldvorming kan alleen worden bereikt met stijve cantilevers (> 10 N / m in water ⁵³⁾ voor een goede signaal-ruisverhouding, met het risico schadelijke zachte samples over grote hoogteverschillen. De behoefte aan stijve uitkragingen is om de thermische ruis die belangrijker dat het signaal gemeten Bij het werken met kleine amplitudes, de lange afstand interacties tussen de tip en het monster zijn nog steeds aanwezig, maar zijn grotendeels constant en hebben geen invloed op kan worden overwonnen hoge-resolutie contrast in de beelden verkregen.

Netheid van de imaging-omgeving is van het grootste belang als het gaat om hoge-resolutie AFM. Ongewenste stoffen in het systeem interfereren met zowel de beeldvorming en de kracht spectroscopie. Er zijn twee hoofdcategorieën van verontreinigingen die de neiging hebben de experimenten beïnvloeden: (i) verontreinigingen direct zichtbaar bij beeldvorming ( Figuur 4B, 4C) en (ii) algemene onverklaarbare ontbreken van een hoge resolutie. Geval (i) neigt slechts in sterk geïdealiseerde systemen zoals de water-mica interface waar geadsorbeerde moleculaire aggregaten die interfereren met de tip-sample interacties duidelijk afsteken tegen atomair vlakke mica oppervlak (Figuur 4A) optreedt. Voordat u de tip en het monster, is het de moeite waard het verwerven van spectroscopische bochten met een grote uitslag, effectief herhaaldelijk op harde de tip tegen het monster. Dit zou normaal gesproken beschadigen van een nieuwe tip, maar kan af en toe een vuile tip schoon te maken of induceren stabiel hydratatie geschikte plaatsen voor de beeldvorming. Dit punt zal echter onvermijdelijk stomp en derhalve alleen geschikt voor vlakke monster zelfs als de beeldvorming ten goede komt. In geval van een vermoeden van besmetting dan stijf monsters, kan het proberen waard om de afbeelding met de tweede eigenmode van de cantilever voordat de ietwat destructieve procedure zoals hierboven beschreven zijn. Dit vereist gewoon swjeuk de drijvende frequentie naar de tweede eigenmode en bijstelling van de amplitude / setpoint (zie de discussie over het oplossen van problemen hieronder). De effectieve stijfheid van de cantilever aanzienlijk toeneemt bij gebruik bij de tweede eigenmode en eventuele zwak geadsorbeerd verontreiniging kan rijden met de punt, terwijl beeldvorming worden geduwd. Deze strategie is geen vervanging voor de behoefte aan een schone monster en tip, maar biedt wat meer mogelijkheden om goede foto's te verwerven wanneer een tip / monster is duidelijk niet ideaal.

Figuur 4: Voorbeelden van verontreiniging waargenomen wanneer beeldvorming micamica die hoge-resolutie beeldvorming te remmen. A: Mica afgebeeld in 5 mM RbCl - geen verontreinigende deeltjes zichtbaar zijn. B: Verontreiniging in de vorm van aggregaten van de orde van tientallen nm over, terwijl de beeldvorming in nominaal ultrapuur water. C: Zelf geassembleerde structuren gevormd door contaminant deeltjes vermoedelijk amfifiele in de natuur. Imaging werd opnieuw uitgevoerd in nominaal ultrapuur water. D: Verticaal offset secties die overeenkomen met de stippellijnen in A, B en C illustreren de afwijking van atomair vlakke ondergrond mica's. Schaalbalken in A, B en C komen overeen met 300 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geval (ii) komt vaker en vooral gekenmerkt door de frustrerende feit dat sub-nanometer functies kunnen simpelweg niet worden opgelost, ongeacht de beeldvormingsomstandigheden. De ondertekening van dit soort situaties is meestal zichtbaar kracht spectroscopie meting die de neiging hebben om een ​​aantal tegenstrijdigheden te laten zien. Deze kunnen onder meer slecht reproduceerbaar bochten en amplitude vs afstand bochten die significant afwijken van een typische sigmoïdale vorm ^42. Als verontreinigingen, ionische of anderszins, zijn dispersed homogeen door de vloeistof, kunnen ze niet worden weergegeven in topografische beeldvorming, maar kon de hydratatie structuur van het monster ^69, wat cruciaal is voor het handhaven van een regelmatige tip-sample interactie ²⁹ en het verkrijgen van hoge resolutie ⁷⁰ verstoren. Er kunnen ook directe effecten van de verontreinigingen op het monster, met name in zachte biologische experimenten. Zo is het bekend dat de aanwezigheid van alcoholen (van de reinigingsprocedure) gel-fase lipide bilagen kan fluidify ^71-73, waardoor subnanometerniveau resolutie mogelijk. Indien hoge resolutie niet mogelijk is, moet erop worden eerst in het reinigingsproces, met name gericht op alle apparatuur die in contact met de beeldvormende oplossing komt. Zelfs ogenschijnlijk stabiele verbindingen zoals epoxyhars solvaat in het fluïdum enigszins of zelfs volledig uitgehard.

Hoge-resolutie beeldvorming met AM-AFM is veeleisend, vereist geduld envaak meerdere processen voor het bereiken van de best mogelijke beeldvormende omstandigheden. Kleine experimentele problemen kunnen gemakkelijk belangrijker geworden genoeg om te voorkomen dat een hoge resolutie en het oplossen van problemen vaardigheden zijn essentieel. Hierna geven we een aantal van de meest voorkomende problemen die we met onze voorgestelde oplossing tegengekomen.

cantilever tuning

De meeste commerciële AFMs gebruiken akoestische excitatie om de cantilever drijven. In dat geval afstemmen van de cantilever, zoals beschreven in stap 5.4, nabij zijn resonantiefrequentie bepaalt vaak voldoende prestaties voor gebruik in lucht. In vloeibare milieus, de vloeistof de neiging om enkele koppeling tussen verschillende mechanische onderdelen van de AFM zoals cantilever chip en de houder veroorzaken. Dit kan invloed hebben op de schijnbare resonantie van de cantilever, vaak geïllustreerd door een cantilever frequentiespectrum dat veel scherpe pieken en dalen gewoonlijk omschreven als "bos pieken" vertoont. Daardoor is het vaak moeilijk de corre vindenct rijden frequentie. Deze pieken bestaan ook in gasomgevingen, maar vanwege de hoge waarde van de kwaliteitsfactor van cantilever, de amplitude van resonanties aanzienlijk groter ^74,75. In vloeibare selecteren van de juiste piek tot de cantilever rijden kan niet gemakkelijk zijn en kan trial and error nodig. In de praktijk frequentiepiek met steilste variatie in amplitude in de "bos pieken" rond de resonantiefrequentie is meestal de beste gok ondanks dat niet noodzakelijkerwijs precies op resonantie en geeft vaak een aandrijffrequentie voldoende hoge resolutie beeldvorming te verkrijgen.

beeldvervorming

Imaging drift is vaak een probleem bij het zoeken naar een hoge resolutie en maakt de afbeeldingen er vervormd (meestal uitgerekt). Zijn oorsprong is over het algemeen thermisch, hetzij omdat de scanner / AFM niet het evenwicht bedrijfstemperatuur heeft bereikt of omdat een deel van de monstervloeistof snel verdampende (bijvoorbeeld, weergave in alcoholen ). In alle gevallen is de afwijking verwaarloosbaar bij thermisch evenwicht. Het is daarom nuttig om de temperatuur van het monster indien mogelijk lossen. Anders is het de moeite waard het verlaten van de AFM om een ​​blanco monster (groot formaat scan bij lage scansnelheid) gedurende enkele uren scannen voordat het uitvoeren van het experiment. Als verdamping is geen probleem, wordt deze procedure best gedaan na stap 6 van de procedure, zorg ervoor dat eerst de tip te trekken op korte afstand (bijvoorbeeld 20 pm) van het oppervlak. Af en toe zal de drift zelfs na uitgebreide thermalisatie blijven. Dit geeft meestal dat de cantilever of de chip gedeeltelijk het monster te slepen terwijl imaging, iets dat kan gebeuren op zachte samenhangende monsters, zoals dunne films of als de tip / cantilever / chip is niet geschikt geplaatst. Op chips die host meer dan één cantilever / tip, is het vaak nuttig om de cantilever die niet in gebruik zijn, in plaats van hen te laten slepen over het oppervlak te breken.

ionsterkte

ntent "> Aangezien de beeldvorming wordt gedomineerd door het grensvlak vloeistof, is het soms nuttig om zout voor hoge resolutie afbeelding van het geladen oppervlak in water toegevoegd. De rol van het zout is tweeledig. Ten eerste wijzigt de hydratatie landschap van de oppervlakte afgebeeld op adsorptie, die vaak het contrast verbetert. Ten tweede helpt het scherm sterke elektrostatische interacties tussen de tip en monster (bijvoorbeeld op mica). over het algemeen grotere ionen zoals kalium, rubidium en cesium mogelijk betere beelden door hun specifieke hydratatie eigenschappen ^76, en het feit dat ze vaak adsorberen hoofdzakelijk in een unieke hydratatietoestand ^77.

Bad cantilever / tip

Als het vermoeden bestaat dat de cantilever is een bron van besmetting (zie de symptomen hierboven beschreven), moet het eerst worden geïnspecteerd onder een optische microscoop. Indien opgeslagen in een gel doos, kan de cantilever pick-up sporen van gel polymeren of siliconenolie ⁵⁹ die kunnen voorkomenIn extreme gevallen, zoals donkere vlekken, op de rug van de cantilever (zoals in figuur 5A). Fotothermische oscillatie van de cantilever kan dit vlekken veroorzaken, maar ze zijn vanwege afbraak / oververhitting van de cantilever bekleding van het groot laser. Verontreiniging neigt verschijnt op willekeurige cantilever. Een langere (12 hr) reiniging met isopropanol en vervolgens met ultrazuiver water kan ongewenste deeltjes uit de cantilever te verwijderen.

Figuur 5: Vergelijking tussen een nieuwe cantilever en een van dezelfde soort die uitgebreid is gebruikt voor harde oppervlakken en achtergelaten in een geldoos gedurende langere tijd. A: Top; optisch beeld van gloednieuwe cantilever dat is schoongemaakt (zie procedure). Bodem; optisch beeld aantonen van de verschijning van zichtbare verontreiniging (blauwe pijl) van de gel doos. B: Vergelijking van de respectieve thermische spectra uitkragingen '.Verbreding van de oude cantilever eerste resonantie piek is duidelijk (groene pijl) en een aantal hogere orde modi worden versterkt (blauwe pijl). Spectra werden verticaal afwijkend en gepresenteerd op een log-log schaal voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als de gewenste sub-nanometer resolutie niet is bereikt, ondanks aanvaardbare beelden met lage resolutie, is het mogelijk dat de AFM tip is geworden chemisch gewijzigd tijdens de opslagomgeving. Dit kan worden behandeld door blootstelling van de cantilever chip een ultraviolet oxidator voor 120 seconden, waarbij het creëren van hydrofiele oppervlaktegroepen helpt op het uiteinde ^60. Zorg dient echter te worden genomen, zoals de exacte tijd die nodig is kan variëren afhankelijk van de tip geometrie en UV macht, en overmatige blootstelling kan leiden tot afstomping van de tip en de lagere resolutie.

Thermische ruis

Hoge-resolutie beeldvorming vereist een grote gevoeligheid voor variaties in de kracht en de afstanden (meestal sub-pN krachten en sub-Ångström afstanden ^78). Voor zachtere cantilevers, kunnen de thermo-mechanische beweging van de cantilever vanwege zijn intrinsieke Brownse beweging (thermische trillingen) een probleem. In eerste benadering, met een cantilever stijfheid k, is het onmogelijk te bepalen kenmerkt kleiner dan De amplitude van de thermische ruis, waarbij k _B Boltzmann constante en T de temperatuur. Praktisch gebruik cantilever met hogere resonantiefrequenties verspreidt het geluid over een groter frequentiegebied, en vermindert de algemene geluidsniveau in de meetbandbreedte ^79.

Hogere eigenmode imaging

Soms kan het nuttig zijn om de cantilever draait met het tweede eigenmodusdoor de toename effectieve stijfheid (zie bespreking contaminatie). Praktisch, dit is gewoon gedaan door het besturen van de cantilever in tweede eigenmodus (de tweede resonantie piek bij een hogere frequentie, zie figuur 1A). Bij het afstemmen van de cantilever, selecteert u de tweede eigenmode in plaats van de belangrijkste resonantie en ga verder met stap 5.4. Merk op dat de InvOLS afwijkt als de cantilever op de tweede eigenmode wordt aangedreven; typisch ~ 1/3 van de InvOLS gemeten in stap 5.2 een rechthoekige cantilever.

De belangrijkste beperking van deze techniek is dat het een stabiel solvatatie landschap aan het oppervlak van het monster. Het monster moet robuust genoeg om te verstoren het grensvlak vloeistof zonder het induceren van significante vervorming van het monster zelf. Dit kan een uitdaging op zeer zacht en onstabiele monsters zulke grote biomoleculen zijn. Bovendien, kleine amplitude AFM zoals hier beschreven kan mechanische informatie over de p niet te verkrijgenigenschappen van een monster, zoals de cantilever tip besteedt het grootste deel van zijn tijd in het grensvlak vloeistof. Hierbij kan het gunstig zijn om andere benaderingen quantitative Nanomechanical Mapping ⁸⁰ gebruik of het gebruik van hogere harmonischen vrijdragende beweging. Hogere harmonica's zijn over het algemeen versterkt wanneer beeldvorming in vloeistof (met een lage kwaliteit-factoren) ^{29,81 - 83} en kan tegelijkertijd zorgen voor topografie en stijfheid van de monsters ^{25,81 - 84,} maar ze zijn over het algemeen nadelig voor hoge resolutie. Andere beperkingen inherent zijn aan alle scanning probe microscopie technieken nog steeds gelden hier met name het feit dat de resultaten onvermijdelijk informaties van het meetpunt bevatten. Het gebruik van kleine amplitudes is niet ideaal voor monsters met grote hoogteverschillen; de terugkoppellus onvermijdelijk reageren trager bij hoogteverschillen groter dan de beeldvormende amplitude, dus riskeren monster en tip schade. Het gebruik of zachtere cantilever verhelpt dit probleem tot op zekere hoogte.

Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde methode is het feit dat zij de hoogst mogelijke beeldresolutie AFM in vloeistof, maar kan worden uitgevoerd op commerciële AFM, mits het geluidsniveau van de machine laag genoeg. De vergelijkbare resolutie over commerciële instrumenten wordt meestal bereikt in contact modus, of zo nu en dan in FM-AFM met stijve uitkragingen. Werken in AM-modus en met relatief zachte cantilevers maakt een ruimere keuze van de monsters en is eenvoudiger te implementeren dan FM-AFM meeste systemen. De aanpak is gebaseerd op het benutten van de solvatatie krachten op het raakvlak tussen een vaste en vloeibare bestaande om de resolutie te verbeteren en krijgen lokale chemische informatie. Deze kan in principe worden gebruikt omgevingsomstandigheden, enkel op basis van de waterlagen (typisch enkele nanometers dik) opbouw op de meeste oppervlakken vanwege vochtigheid van de lucht. De beginselen die ten grondslag liggen aan dehoge-resolutie strategie ongewijzigd maar de meeste van de tip in de lucht, met slechts een capillair brug tussen de punt apex en het monster ^85. High-resolution is aangetoond op stijf monsters in deze voorwaarden ^86,87. De beeldvormende omstandigheden echter anders dan die ondergedompeld vloeistof door een hogere Q-factor oscillatie de cantilever is. Praktisch, vonden we het moeilijk bereiken stabiele werking via zacht of onregelmatige monsters, vermoedelijk als gevolg van tijdelijke veranderingen in de capillaire brug en verhoogde Q-factoren voor een bepaalde cantilever stijfheid.

De hierin beschreven protocol biedt een methode voor het bereiken van moleculair niveau resolutie beelden van de monsters in de vloeistof met de meeste moderne commerciële AM-AFMs. Wij zorgen voor de wetenschappelijke rationale achter onze keuze voor imaging parameters en benadrukken de rol van solvatatie krachten. We bespreken ook gemeenschappelijke problemen en in het bijzonder besmetting. De specifieke tip-sample interacties can variëren sterk afhankelijk van de inhoud van de imaging-oplossing, de cantilever geometrie en materialen, en het monster chemie. Een praktische kennis van de aard van de dominante krachten tijdens het scannen aanwezig is daarom essentieel om dit protocol aan te passen aan nieuwe en betrouwbare resultaten. Wanneer geoptimaliseerd, de experimentele benadering is krachtig te winnen in-situ lokale moleculair niveau inzicht van de monsters in oplossing.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimode IIIA AFM	Brucker	NA	Een van de gebruikte machines
Cypher ES AFM	Asylum Resarch	NA	Een van de gebruikte machines
AFM cantilever/tip	Nanoworld	Arrow UHF-AUD	best voor hoge frequentie
AFM cantilever/tip	Olympus	RC800-PSA	veelzijdig en goedkoop
ultrapuur water	Milipore	NA	Lab filtering systemen kunnen besmetting veroorzaken
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aaldrich	200-664-3	standaard chemie, geen verdere zuivering
Monovalente zouten	Sigma-Aaldrich		standaard chemie, geen verdere zuivering
Lipiden	Avanti Polar Lipids		lipide dubbellagen gevormd met behulp van standaard protocollen
Kristallen	MTI		geslepen kristallen
Scotch tape	3M	Scotch Magic Tape	Doorschijnende tape werkt het beste. Transparant plakt te sterk