Proximale Cadaveric Femur Voorbereiding voor Fracture Sterkte Testen en Kwantitatieve CT-gebaseerde Finite Element Analysis

Samenvatting

We presenteren een robuust protocol over hoe om zorgvuldig te bewaren en voor te bereiden cadaveric dijbenen voor fractuur testen en kwantitatieve computertomografie beeldvorming. De werkwijze biedt precieze controle over ingangscondities voor het bepalen van verhoudingen tussen botdichtheid, breuksterkte en definiëren eindige elementenmodel geometrie en eigenschappen.

Samenvatting

Cadaveric breuk testen wordt routinematig gebruikt om factoren die van invloed proximale femur sterkte begrijpen. Omdat ex vivo biologische weefsels zijn gevoelig voor hun mechanische eigenschappen na verloop van tijd te verliezen, prepareren voor experimentele tests moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om betrouwbare resultaten die vertegenwoordigen in vivo omstandigheden te verkrijgen. Om die reden hebben we een protocol en een set van de inrichting aan de femorale exemplaren zodanig dat hun mechanische eigenschappen ervaren minimale veranderingen voor te bereiden. De dijbenen werden in bevroren toestand gehouden behalve tijdens bereidingsstappen mechanische testen. De relevante klinische metingen van de totale heup en femurhals botmineraaldichtheid (BMD) werden verkregen met een klinische dual X-ray absorptiometry (DXA) bot densitometer, en de 3D geometrie en verdeling van botmineraal werden verkregen met CT een calibratie fantoom voor kwantitatieve schattingen op basis van de grijswaarden. Eventuele botziekte, fractuur, Of de aanwezigheid van implantaten of artefacten die de botstructuur, werd uitgesloten met X-ray scans. Voor de bereiding werden alle beenderen zorgvuldig ontdaan van overtollig zacht weefsel, en werden gesneden en gepot aan de binnengrenzen draaihoek van belang. Een snij inrichting liet het distale uiteinde van het bot afgesneden waardoor de proximale femur bij een gewenste lengte. Om positionering van de femorale nek op voorgeschreven hoek mogelijk te maken tijdens later CT-mechanische testen werden de proximale dijbeenholtes gepot in polymethylmethacrylaat (PMMA) met een inrichting speciaal ontworpen voor de gewenste richtingen. De verzamelde gegevens uit onze experimenten werden vervolgens ter validatie kwantitatieve computertomografie (QCT) gebaseerde eindige elementen analyse (FEA), zoals beschreven in een ander protocol. In dit manuscript, presenteren we het protocol voor de precieze bot voorbereiding voor mechanische testen en de daaropvolgende QCT / FEA modellering. Het huidige protocol is met succes toegepast op ongeveer 200 cad bereidenaveric dijbenen over een 6-jarige periode.

Inleiding

Het bepalen van de werkelijke proximale femurfractuursterkte van het lijk met mechanische tests is een destructief methode die een rigoureuze testaanpak vereist voor nauwkeurige metingen. In het bijzonder zijn goede botvoorbereidingsmethoden noodzakelijk om de in vivo integriteit van de botten te behouden vóór mechanische fractuurtesten¹. Dit wordt bereikt door goede botopslag en minimalisering van handelingen bij kamertemperatuur. Deze testgegevens worden uitgebreid gebruikt om QCT/FEA-modellen van femurfracturen te valideren, die klinisch kunnen worden gebruikt om het fractuurrisico te begrijpen, vooral bij osteoporotische patiënten. Helaas is er geen huidige standaardprocedure om proximale femurmonsters voor mechanische tests voor te bereiden. Een goede testprocedure moet herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van het voorbereidingsproces garanderen. Daarom moeten de voor het monstervoorbereiding vereiste armaturen zorgvuldig worden ontworpen en vervaardigd om de kans op verschillende testfouten te minimaliseren. We moeten ook de voorbereidingstijd minimaliseren waarin botweefsel op kamertemperatuur is en dus gevaar loopt op degradatie met onomkeerbare veranderingen in mechanische eigenschappen.

Daarom hebben we een procedure ontwikkeld die botweefsel door meerdere voorbereidingsstappen heen behoudt. Dit is belangrijk om de blootstellingstijd bij kamertemperatuur tot een minimum te beperken en tegelijkertijd het aantal bevriezing/ontdooicycli te minimaliseren die de fysische eigenschappen van het weefsel kunnen beïnvloeden². De hele procedure is lang en niet triviaal, omdat de stappen over meerdere weken plaatsvonden en planning vereisten voor scanprocedures en beschikbaarheid van personeel. De stappen omvatten het ontdooien van botmonsters, het screenen van de monsters met DXA-scannen om botmineraaldichtheid (BMD) waarden te verkrijgen, röntgenonderzoek om zieke exemplaren uit te sluiten en ten slotte CT-scannen om de verdeling van botmineraal en femorale geometrie te schatten. Alle monsters werden voorbereid voor testen door overtollig zacht weefsel van het botoppervlak te verwijderen, het femur op een vereiste lengte voor testen te snijden en het femur in een gewenste oriëntatie te potten voor het simuleren van een zijwaartse val op de heup tijdens daaropvolgend testen. Het is essentieel om de tijdsperiode voor al deze operaties zo kort mogelijk te houden. Een robuust protocol is dus verplicht voor consistente monstervoorbereiding, weefselbehoud tussen stappen en voor het verminderen van de totale voorbereidingstijd.

Het doel van dit artikel is om in detail de procedures te presenteren die betrokken zijn bij de voorbereiding van femurmonsters voor latere mechanische tests onder verschillende omstandigheden. Behoud van het botweefsel is cruciaal in dit proces en we bereikten dit door monsters gedurende de stappen te behouden en ze zorgvuldig verpakt te houden in zoutvrije handdoeken op alle momenten behalve bij het scannen en mechanisch testen van de botten. De femurs werden ook verpakt in zoutvloeipapier handdoeken tijdens de stappen waarbij PMMA-uitharding betrokken was om uitdroging van het botweefsel te voorkomen.

Protocol

LET OP: Alle studies in dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in Mayo Clinic. De botten werden verkregen over een periode van 6 jaar uit verschillende organisaties. Alle monsters werden genomen binnen 72 uur na overlijden, verpakt in zoutoplossing verzadigde handdoeken en opgeslagen bij -20 ° C tot preparaat.

1. Het meten van botmineraaldichtheid Met behulp van DXA

1. Verwijderen monsters bewaard bij -20 ° C vriezer te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 24 uur; specimens niet te worden verwijderd uit originele verpakking als meest zacht weefsel is verwijderd.
2. Gebruik twee 5 lb zakken rijst om rekening te houden zacht weefsel. Bedek de twee rijst zakken op de DXA tafel met plastic zakken om besmetting te voorkomen. De rijst zakken simuleert omringende zachte weefsel (in vivo) bij het scannen zoals getoond in figuur 1.
3. Bescherm het oppervlak van de DXA scanner met plastic bekleed papier en plaats 2 plastic verpakt rice zakken op de scanner tafel (Figuur 1A).
4. Leg 2 dijbeen (rechts en links) bovenop rijst zakken zodat het proximale uiteinde (inclusief de femurkop) gecentreerd op zakken en de postérieure zijde naar beneden (Figuur 1B). Deze bootst een patiënt liggend op hun rug.
5. Cover anterior / blootgesteld proximale femur uiteinde met twee extra 5 pond rijst zakken (figuur 1C).
6. Plaats de machine hoofd over proximale dijbeen en scan het dijbeen volgens de standaard institutionele procedure voor de patiënt BMD meting (figuur 1C). Volg de specifieke DXA instructies van de fabrikant.
   1. Vanuit de DXA machine software-interface uitvoeren van een normale femur scan. Selecteer het dijbeen examen, plaatst u de DXA arm op de top van de postmortale dijbeen door dienovereenkomstig te drukken op de linker of rechter pijl op de DXA arm, en start het examen door te klikken op de knop "start". Voer de BMD analyse door te klikken op "Analyseren".
      NIETE: De resulterende automatische T-score van de scan classificeert het bot als normaal, osteopenie of osteoporose (figuur 1D). Volg de specifieke DXA instructies van de fabrikant.

2. Reiniging, snijden en boren van het distale einde van de Bone

1. Reinig de proximale 300 mm van het femur door voorzichtig resterende zacht weefsel uit het bot verwijderd. Deze stap is nodig om PMMA contact met het bot tijdens de potting proces ter voorbereiding van mechanische testen. De botten behoeven niet te worden ontdooid tot kamertemperatuur gedurende dit proces.
2. Ontsmetten van de werkruimte met 70% isopropylalcohol en dek de tafel met absorberend papier pads met plastic folie aan de ene kant (Figuur 2A). Stel de gehele dijbeen op tafel (figuur 2B) voor het gehele proces te beginnen met het reinigen snijden (figuur 2A tot 2H). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van handschoenenen oogbescherming.
3. Schraap het overtollige beenvlies en snijd overtollige weefsel verwijderd met behulp van een schraper en scalpel (figuur 2C, 2H).
4. Plaats het bot in de maat snijden zoals afgebeeld in figuur 2D met de kop van het dijbeen tegen de acrylplaat van het armatuur.
5. Lijn en houd de diafyse tegen de twee pinnen op de snij-armatuur (figuur 2D).
6. Beveilig het bot aan de armatuur door het aandraaien van beneden de schuimspaan uit de plaat op de diafyse; Als het bot niet plat komt te liggen op de armatuur, hangen distale einde off tafelblad en ook optioneel zip binden de femurhals als nodig is om het monster op zijn plaats (figuur 2D) te houden.
7. Snijd de distale schacht van het dijbeen met de cast mes (figuur 2E) door middel van sleuven plaat als een gids; Houd bot met een droge doek / handdoek voor een betere grip.
8. Verwijder het bot uit de houder; normaal bot lengte na cut is 255 mm (zie figuur2F).
9. Maak de mergholte van beenmerg met behulp van een curette ongeveer 25 mm diep. Plaats vervolgens een gaasje spons te helpen drogen het inwendige oppervlak. Verwijder het gaas vlak voor het plaatsen van het distale uiteinde van het dijbeen in de matrijs. Grip op het bot met een droge handdoek / doek en boor een gat van 10 mm door het distale einde op ongeveer 25 mm van het proximale afgesneden uiteinde van het monster. Let op: Dit is om de PMMA om het kanaal te dringen en zet het bot stevig.

3. Potting the Bone

1. Ontwerp en vervaardig oppotten container. Het oppotten containers zijn gemaakt van 5 mm dik acryl platen en hebben de volgende uitwendige afmetingen: 50 mm bij 50 mm vierkante doorsnede en 100 mm hoog (figuur 3A).
2. Label oppotten container met de juiste been identificatie (figuur 3A en 3B - zie etiket op acryl box).
3. Pas de inbedding armatuur naar de juiste oriëntatie (linkerbeenof rechterbeen; bijvoorbeeld 15 ° of 30 ° endorotatie).
4. Plaats potting container base van inbedding inrichting, plaats bot in de potting houder (figuur 3B) en lijn hals met aanwijzer inrichting (figuur 3C) aan de interne rotatiehoek van het bot op de gewenste waarde.
5. Meet 60 g PMMA poeder en meng met 30 g vloeibare hars onder zuurkast tot het poeder is opgelost. Het mengsel moet schenkbaar zijn. Gebruik een eenmalige kartonnen beker voor dit proces.
6. Giet het mengsel in potten houder met bot onder een afzuigkap (figuur 3D), laten uitharden ongeveer 10 - 15 min, totdat PMMA is helder en hard. Dit mag alleen vullen ~ 1/2 van de potgrond container met PMMA. Wikkel het bot in een zoutoplossing verzadigd handdoeken zorgvuldig om weefsel droogte als gevolg van generatie hitte tijdens PMMA polymerisatie (figuur 3E) te voorkomen.
7. Controleer regelmatig het dijbeen om te verzekeren dat blijft uitgelijnd in decontainer tijdens het uitharden.
8. Verwijder dijbeen uit oppotten armatuur en wikkel met een zoutoplossing gedrenkte papieren handdoek (figuur 3E).
9. Bereid 90 g PMMA onder een zuurkast zoals beschreven in stap 3.5 en het oppotten container volledig te vullen. Genezen van de PMMA voor ongeveer 10 - 15 min, totdat het moeilijk wordt.
10. Na het hars is uitgehard, strak wikkel / reWrap bot in een zoutoplossing gedrenkt papieren handdoeken, dek af met plastic zak en bewaar de monsters bij -20 ° C in de vriezer.

4. Imaging the Bone met X-ray

(LET OP! Bedien met de juiste zorg voor röntgenstraling bij het gebruik van de machine)

1. Bij gebruik van films voor X-stralen, draai X-ray ontwikkelaar op tenminste 20 min (instructies van de fabrikant) voorafgaand aan het scannen door de knop met de klok mee (in de ontwikkelaar kamer).
2. Zorg dat er onbelichte film in de cassette voordat X-Screenen; cassette mag alleen worden geopend in een donkere kamer.
3. Zet de machine aanontgrendelen en uit te breiden van de machine hoofd.
4. Plaats een kar onder de baan van de bundel en plaats een cassette op de wagen onder de balk (figuur 4A).
5. Plaats en positie het dijbeen op de cassette (Figuur 4B); twee oriëntaties zullen worden vastgelegd: mediale zijaanzicht en anterior-posterior view. Label het monster beelden dienovereenkomstig.
6. Na de eerste blootstelling, wisselen de leiding en bot locaties.
7. Bedek de reeds blootgesteld helft met lood en bloot de bot in de tweede oriëntatie op de onbelichte kant. Dit kan de gebruiker een röntgenfilm Voor één bot in twee oriëntaties (Figuur 4C-D).
8. Verander de cassette en draai elk dijbeen in de tweede oriëntatie.
9. Bij één femur, bedek de helft van de cassette lood deksel initiële blootstelling van de hele film röntgenstraling voorkomen.
10. Verplaats achter het lood beklede draagbare muur voor persoonlijke bescherming en het gebruik van de trekker bloot te leggende botten.
11. Na afloop terug X-ray hoofd te vergrendelen en de positie op te slaan, turn-key op OFF op de X-ray machine en verwijder blootgesteld X-ray film.
12. Ontwikkel de film röntgenbeelden (Figuur 4E) met een gewone film ontwikkelaar te verkrijgen. Schakel op het witte licht in de kamer en zoek de film ontwikkelaar. Zet het rode licht en zet het witte licht voor het openen van de cassette en ga verder met de film ontwikkelingsproces. Open de cassette en zet de film door de ontwikkelaar. Schakel op het witte licht en zet het rode licht nadat de film is ontwikkeld.

5. CT-scan of Bones

1. Verwijder de botten uit diepvries ongeveer 24 uur voorafgaand aan het scannen. Bones moet volledig worden ontdooid voorafgaand aan het scannen.
2. Zorg ervoor dat de botten zijn verpakt in plastic zakken voor het scannen om clean-up op het einde een minimum te beperken.
3. En bevestig het dijbeen en het calibratie fantoom in de CT-scan armatuur (figuur 5A-B). de fixture houdt de kalibratie fantoom (figuur 5C) en houdt ook het dijbeen in een oriëntatie (figuur 5D-E) identiek met de gewenste voor de daaropvolgende mechanische testen oriëntatie. Dit kruis registratie is vereist om de gegevens van CT (Figuur 5F) gebruik in de QCT / FEA modelleringsproces (in een ander protocol beschreven).
   Opmerking: Het toestel is zodanig ontworpen dat het dijbeen bloot CT scan zonder het belemmeren van de proximale femur (dijbeen hoofd, nek, trochanter major en proximale schacht).
4. Controleer de armatuur samen met het dijbeen in de CT scanner goed is uitgelijnd met het systeem lasers geleidingen (Figuur 5D-E). Controleer opnieuw de uitlijning van de armatuur met de CT lange as laser (door te drukken laser aan / uit-knop). Het fantoom hoeft niet te worden afgestemd met de laser als het is vastgezet in het armatuur. Nul de tafel positie van het bedieningspaneel van de machine door te drukken op de butto nuln (→ 0 ←) op het bedieningspaneel.
5. Na CT standaard procedure, opereren de CT machine op 120 kVp, 216 mAs, 1 s rotatietijd, en de toonhoogte van 1 met behulp van ultra hoge resolutie modus (Zuhr). Dit geeft een plakdikte van 0,4 mm en een pixelgrootte van 0,30-0,45 mm afhankelijk van de grootte van het gezichtsveld (FOV).
6. Controleer CT-scan gegevens voorafgaand aan mechanische testen om ervoor te zorgen dat de beelden van belang worden vastgelegd en opgeslagen. Invriezen het bot bij -20 ° C tot de dag van het experiment.

Resultaten

De dode femora werden bevroren verzonden en gehandhaafd op -20 ° C tot voorbereiding begon. BMD scanning werd uitgevoerd met een DXA scanner aan totale heup en BMD en T-score voor elk monster (Figuur 1) te meten. Een T-score is het aantal standaarddeviaties van de gemeten BMD ten opzichte van de gemiddelde waarden voor jonge gezonde proefpersonen. Het kan variëren van -2,5 of lager osteoporotische botten, tussen -1 en -2,5 voor osteopenisch botten en hoger dan -1 normale...

Discussie

Presenteerden we een robuust bot voorbereiding protocol voor het waarborgen van de mechanische testen en QCT / FEA modelleren van femur kracht in een zijwaartse val op de heup configuratie. Deze methode werd onze standaard in-house protocol. Gedurende 6 jaar, met wisselende personeel, ongeveer 200 dijbenen werden succesvol bereid volgens dit protocol. De uitkomsten van het protocol omvat het classificeren van botaandoeningen met behulp van DXA, het uitsluiten van metastatische ziekten, eerdere fracturen, of implantaten ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CT potting container en scanapparaat	Intern vervaardigd	N/A	Op maat ontworpen en vervaardigd
CT-scanner	Siemens	Somatom Definition-scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT-scanapparatuur
Kwantitatieve CT-fantoom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT-kalibratiefantoom	Gebruikt voor het verkrijgen van BMD-waarden uit Hounsfield-eenheden in de CT-afbeelding
Dual Energy X-ray Absorptiometrie-scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA-scanner voor botgezondheid of elke soortgelijke BMD-scanner
Hygienische orthodontische hars (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Gebrekkige stof en kan worden gekocht met de juiste goedkeuring
Vriezer	Kenmore	N/A	Dit is een -20 °C opslag voor botten
Röntgenscanner	General Electric	46-270615P1	Röntgenbeeldapparatuur.
Röntgenfilms	Kodak	N/A	Gebruikt om röntgenbeelden weer te geven
Röntgendeveloper	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Gebruikt voor het ontwikkelen van röntgenbeelden
Röntgencassette	Kodak X-Omatic	N/A	Gebruikt voor het vasthouden van röntgenfilms
5-ponds rijstzakken	Great Value	N/A	Gebruikt voor het nabootsen van zacht weefsel tijdens het DXA-scanproces
Fysiologische zoutoplossing (0,9% natriumchloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Gebruikt om monsters gehydrateerd te houden
Scalpels en schrapers	Bard-Parker	N/A	Gebruikt om het bot van zacht weefsel te reinigen
Kastsnijder	Stryker	810-BD001	Gebruikt om de femurschacht te snijden
Boormachine	Bosch	N/A	Gebruikt om de femurschacht te boren
Dampfkap	Hamilton	70532	Gebruikt voor ventilatie bij het maken van PMMA