Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

15.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54929

⸱

15 december 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het opzetten van cultuursystemen voor de expansie van volwassen neurale stamcellen (aNSCs) maakt het mogelijk om aNSCs te onderzoeken en toe te passen voor therapie. De subcallosale zone (SCZ) is onlangs herkend als een nieuwe neuroblastvormende regio in volwassen muizen. Hier worden methoden beschreven voor de isolatie, expansie en differentiatie van SCZ-aNSCs.

Samenvatting

Volwassen neurale stamcellen (aNSCs) kunnen worden gebruikt voor de regeneratie van beschadigd hersenweefsel. NSC's hebben het potentieel voor differentiatie en proliferatie in drie soorten cellen: neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Het identificeren van aNSC-afgeleide regio's en het karakteriseren van de aNSC-eigenschappen zijn cruciaal voor het potentiële gebruik van aNSC's en voor het ophelderen van hun rol bij neurale regeneratie. De subcallosale zone (SCZ), gelegen tussen witte stof en de hippocampus, is recentelijk gerapporteerd om aNSC's te bevatten en continu neuroblasten voort te brengen. Een laag percentage van aNSC's uit de SCZ is gedifferentieerd in neuronen; de meeste cellen zijn gedifferentieerd in gliacellen, zoals oligodendrocyten en astrocyten. Deze cellen worden gezien als potentieel therapeutisch voor traumatische corticale schade. Dit protocol beschrijft in detail het proces om SCZ-aNSC's te genereren uit een volwassen muizenhersenen. Een hersenmatrix met intervallen van 1 mm wordt gebruikt om de SCZ-bevattende coronale secties te verkrijgen en om de SCZ nauwkeurig te dissekeren uit de hele hersenen. De SCZ-secties worden aanvankelijk onderworpen aan een neurosfeercultuur. Een goed ontwikkeld kweeksysteem maakt de verificatie van hun kenmerken mogelijk en kan onderzoek naar NSC's verhogen. Een neurosfeercultuursysteem biedt een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van proliferatie en het verzamelen van echte NSC's. Een monolaagcultuur is ook een in vitro systeem om proliferatie en differentiatie te meten. Belangrijk is dat dit kweeksysteem een meer homogene omgeving biedt voor NSC's dan het neurosfeercultuursysteem. Dus, door gebruik te maken van een discrete hersenregio, zullen deze kweeksystemen nuttig zijn voor het uitbreiden van onze kennis over aNSC's en hun toepassingen voor therapeutische doeleinden.

Inleiding

NSC's hebben kenmerken van zelfvernieuwing en differentiatie in meerdere lijnen. Om deze eigenschappen te bevestigen, is er op grote schaal gebruik gemaakt van een neurosfeer-kweeksysteem. Het neurosfeer-kweeksysteem werd ontwikkeld in de vroege jaren 1990 en diende als een standaard stamcelkweeksysteem1. Afhankelijk van de potentie voor zelfvernieuwing, prolifereren NSC's continu en genereren ze een celmassa in een suspensiekweek. Het aantal cellen en de grootte van de neurosfeer worden beschouwd als nauw verbonden met de proliferatie-eigenschappen van de NSC's. Monolayer-kweeks zijn ook wijd gebruikt voor het onderhoud en de differentiatie van NSC's. In vergelijking met de neurosfeer-kweek, biedt het monolayer-kweeksysteem een betere homogene onderhoud en uitbreiding van NSC's2. Deze twee goed ontwikkelde kweeksystemen hebben bijgedragen aan de karakterisering van aNSC's in vitro.

NSC's bevinden zich in verschillende hersengebieden, zoals de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus3-5. De subcallosale zone (SCZ) van de caudale subcorticale witte stof wordt erkend als een nieuwe neurogene regio6-8. Recent werd gemeld dat de SCZ-aNSC's therapeutisch potentieel hebben bij traumatisch hersenletsel9. In vergelijking met andere neurogene regio's, bevindt de SCZ zich langs de subcorticale witte stof. In de menselijke hersenen neemt de subcorticale witte stof een groter gebied in dan in de muizenhersenen10. Daarom is een begrip van de kenmerken van SCZ-aNSC's met behulp van een in vitro kweeksysteem belangrijk om het potentiële gebruik van deze cellen voor neurale regeneratie te bevorderen. Precieze dissectie van de gewenste hersengebied is vereist om mogelijke besmetting door ongewenste regio's met actieve of rustige NSC's uit te sluiten. Bijvoorbeeld, aNSC's in niet-neurogene regio's kunnen worden geactiveerd en nieuwe neurale cellen produceren in gewonde hersenen of tijdens in vitro kweken11. Om NSC's uit de SCZ te verkrijgen, werden cellen verzameld uit hersensneden die de SCZ bevatten. Vervolgens werd een zorgvuldige microdissectie van de SCZ-regio uitgevoerd met behulp van een fijne naald. Om de neurosfeer uit de SCZ te genereren, werden microdissected SCZ-weefselklompjes gedissocieerd in enkele cellen en vervolgens gekweekt als een suspensie in aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en basische fibroblast groeifactor (bFGF). Nadat SCZ-aNSC's neurosferen hebben gevormd, kunnen ze ook worden onderhouden als neurosferen of monolayers voor uitbreiding. Deze procedure toont ook immunokleuring processen met verschillende markers voor de detectie van NSC's en hun nakomelingen na hun uitbreiding en differentiatie in een monolayer-kweek. Hier wordt een visuele protocol van het SCZ-aNSC-kweeksysteem gepresenteerd. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor de microdissectie van de SCZ-regio en voor het onderhoud en passeren van de cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van Materialen en Cultuur Medium

  1. Voor de dissectie en dissociatie van de SCZ, wikkel de hersenen matrix, tweesnijdend scheermesje en pincet met aluminiumfolie, en vervolgens steriliseren ze in de autoclaaf.
  2. Bereid 50 ml koude PBS buffer om de gehele muizenhersenen wassen.
  3. Het opzetten van een dissectie microscoop en de voorbereiding van de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de dissectie van de hersenen (geautoclaveerd schaar en pincet) en de isolatie van de SCZ (1 ml spuit, 30 G naald, hersenen matrix, en fijne tang).
  4. Bereiding van N2 Medium:
    1. Bereid F-12 / DMEM (+ L-glutamine, natriumbicarbonaat +) medium met 2% B27, 1% N2 supplementen, en 1% penicilline-streptomycine.
      Noot: Het groeimedium bestaat uit N2 medium en groeifactoren (20 ng / ml gezuiverd epidermale groeifactor (EGF) en 20 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF2)).
  5. Bereid een spijsvertering buffer (40 eenheden / ml papaïne, 2,4 eenheid / ml Dispase II en 2% penicilline-streptomycine in PBS) voor weefsel spijsvertering.
  6. Voorbereiding van de Coating Plate en Coverslip:
    1. Bereid poly-L-ornithine (PLO; 0,01%) en laminine (10 ug / ml opgelost in DH 2 O). Het coaten 6-well platen voor het onderhoud van SCZ-aNSCs als een monolaag of 18 mm dekglaasjes voor immunokleuring, incubeer ze met PLO nacht bij 4 ° C. Was ze vervolgens 3 maal met DH 2 O. Laat de platen en dekglaasjes te drogen na de laatste wassen.
    2. Vervolgens incuberen van de platen met laminine overnacht bij 4 ° C. Vervolgens was ze 3 keer met DH 2 O.
      Let op: de laminine niet droog, welke cel beslag zal beïnvloeden.
      Opmerking: De coating oplossingen kunnen 3 keer worden hergebruikt.

2. Isolatie en dissociatie van de Adult SCZ

  1. Voorafgaand aan de cultuur voorbereiding, plaatst de hersenen matrix en tweesnijdend scheermes op ijs.
    Opmerking: Niet in de vriezer van de hersenen matrix, omdat de brain kon hechten aan het.
  2. Offer een muis (8 weken oud) door CO 2 stikken of cervicale dislocatie.
    1. Snijd het hoofd met een scherpe schaar na het spuiten 70% ethanol. Om het hoofd te immobiliseren, houdt beide zijkanten van het hoofd stevig vast. Snijd de huid met een schaar op de middellijn in een caudale-rostrale richting. Dit bevordert de volledige verwijdering van de huid van de schedel.
    2. Verwijder het caudale deel van de schedel (posterior naar lambda), en dan steek de tang tussen de schedel en de hersenen bij de dorsale middellijn positie. Pak de links (of rechts) pariëtale bot en zorgvuldig afschilferen. Herhaal deze procedure voor het verwijderen van de andere pariëtale botten.
      Opmerking: Verbreking van de optische zenuw en verwijdering van de hersenvliezen van de hersenen het gemakkelijker maken om de hersenen losmaken van de schedel.
    3. Breng de hersenen koude PBS buffer (25 ml) en spoel tweemaal om overtollig bloed te verwijderen.
  3. Plaats de hersenen in de hersenen matrix op ijs en make coronale bezuinigingen op 1 mm dikke plakken te verkrijgen. Breng de hersenen plakjes (1 mm) die de SCZ gebieden die zich in het achterste deel van de hersenen om een ​​koude PBS in een 35 mm plastic petrischaal.
    Let op: Met het oog op een parallelle vlak van coronale secties te verkrijgen, ervoor zorgen dat de hersenen spleet wordt geplaatst in de middellijn van de hersenen matrix; is het essentieel om onnodige variaties in de mijden.
    Let op: Verkrijg hersenen plakjes op 2-3 mm achter bregma; Hierdoor kan de scheiding van de SCZ de SVZ.
  4. Onder de microscoop ontleden met een lage vergroting, micro-ontleden de SCZ van de witte stof gebied van de cortex en de hippocampus met een gebogen 30G naald 6,9. Verwijder vervolgens de cortex regio's boven de SCZ. Plaats de ontleed regio SCZ van de plakjes in een 35 mm plastic petrischaal op ijs zonder koude PBS.
    NB: Besmetting van extra gebieden met volwassen neuronen kunnen hebben voor de levensvatbaarheid van aNSCs en neurosphere vorming bmdat ze ondergaan celdood in ANSC kweekomstandigheden.
  5. Met behulp van een gebogen 30 G naald, onmiddellijk Hak de ontleed weefsel in kleine stukjes.
    Opmerking: Als er een langere tijd nodig is voor het ontleden van de SCZ weefsel, dompel de ontleed weefsels in koude PBS voor het hakken.
  6. Resuspendeer de gesneden weefsel met 1 ml digestiebuffer, breng het weefsel naar een 15 ml buis met 2 ml digestiebuffer en incubeer gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad.
    Let op: Schud de buis om de 10 min goed te mengen.

3. Subcallosal Zone-afgeleide volwassen neurale stamcel Cultuur

  1. Tik de buis licht tot het gedigereerde weefsel dissociëren en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, geresuspendeerd het gedigereerde weefsel met 1 ml voorverwarmd medium N2 uitwasbaar de digestiebuffer en voorzichtig pipet de monsteroplossing maximaal 5 keer met een pipet P1000.
    Opmerking: Over-tritureren met een smallepipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen.
  2. Centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 1 ml N2 medium.
  3. Bereid 1 ml N2 medium in een niet-beklede 6-well plaat en voeg 1 ml van de gesuspendeerde cellen op een eindvolume van 2 ml te maken.
  4. Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) in elk putje. Schud de 6-well cultuur schotel met de hand om de toegevoegde groeifactoren mengen met de vergulde cellen. Houd de 6-well plaat in een 37 ° C en 5% CO2 incubator.
  5. Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) aan elk putje elke dag gedurende 8 dagen. Elke derde dag, voeg 200 pl media N2 bij benadering volume 2 ml van het medium te handhaven.

4. Passage van NSCs als Neurosferen en monolaag culturen

  1. Verzamel de neurospheres en overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis.
    Let op: het aantal neurosferen (> 50 micrometer diameter) per en de SCZ van één muizenhersenen was 64,3 ± 7,31, die lager is dan die van de SVZ was (190,5 ± 6,33) 9.
  2. Incubeer de neurosferen met 0,5 ml dissociatie buffer gedurende 5 minuten in een 37 ° C waterbad voor de neurosferen dissociëren in enkele cellen. Primaire neurospheres los kan worden gezien in enkele cellen en onderhouden over meerdere passages als neurosphere of monolaag culturen.
    Opmerking: Uitbreiding SCZ-aNSCs als een monolaag is superieur aan neurospheres omdat SCZ-aNSCs kan worden gepasseerd> 10 keer in een monolaag cultuur formaat, maar <5 keer in een neurosphere cultuur formaat.
    Voorzichtig: SCZ-aNSCs vertonen sterke aggregatie, en het is moeilijk om ze dissociëren in enkele cellen. Aldus wordt de neurosfeercultuur formaat niet geschikt voor routinematige celexpansie.
  3. Voorzichtig pipet de monsteroplossing op en neer met een P1000 pipet minder dan 5 maal en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en re-subrengen de neurospheres met 1 ml N2 medium.
    Opmerking: Over tritureren met een smalle pipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen.
  4. Om de cellen te tellen, maak een 1: 1 mengsel van de celsuspensie (10 ui) en 0,4% trypan blauwe oplossing, en tel het aantal levende cellen op een hematocytometer. Na het bekleden van een 6-wells plaat met PLO / laminine, plaat de cellen bij 2,5 x 10 5 cellen / ml met 2 ml N2 medium voor elk putje.
    Opmerking: wijzigingen in cel dichtheid kan hun conditie en differentiatie potentieel beïnvloeden.
  5. Handhaaf de SCZ-aNSCs met een dagelijkse behandeling van groeifactoren (2 ml, 20 ng / ml) gedurende 5 dagen, en deze passage hen.

5. Differentiatie van Subcallosal Zone-afgeleide adulte neurale stamcellen

  1. ANSCs plaat op een PLO / laminine beklede 18 mm dekglaasje met 1 x 10 5 cellen / ml in 1 ml N2 met groeifactoren (20 ng / ml) voor differentiatie van de SCZ-aNSCs.
  2. De volgende dag,wanneer de cellen stevig aan de dekglaasje, wisselen het groeimedium met N2 tot de groeifactoren te verwijderen.
  3. Na 6 dagen was de gedifferentieerde cellen met 1 ml PBS om celresten te verwijderen en ze op te lossen voor immunokleuring.
    Opmerking: BrdU kan in het nieuw gesynthetiseerde DNA van prolifererende cellen worden opgenomen. Derhalve desgewenst BrdU (10 ug / ml) worden toegevoegd aan cellen leven voor de fixatie van cellen.

6. Immunokleuring adulte neurale stamcellen en gedifferentieerde Progenitors

  1. Voor immunokleuring, was de cellen met PBS en bevestig ze met 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    Let op: PFA is zeer giftig; Aanraking met de huid en ogen te vermijden.
  2. Verwijder de 4% PFA, spoel de gefixeerde cellen met PBS 3 keer, en bewaar ze bij 4 ° Cuntil ze nodig zijn voor immunokleuring.
  3. Incubeer de cellen op het dekglaasje met blokkeeroplossing (3% runderserumalbumine en 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS) gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Bereid de primaire antilichamen in verse blokkerende oplossing en incubeer de monsters gedurende de nacht bij 4 ° C.
    1. Immunokleuring de aNSCs
      1. Vlekken aNSCs het gebruik van anti-Nestin en anti-BrdU-antilichamen. Vóór fixatie, voeg 20 ug BrdU de aNSCs en incubeer ze gedurende 2 uur. Voer de denatureringsstap middels 2 N HCl gedurende 20 minuten bij 37 ° Cbefore uitvoeren van de blokkeringsstap.
    2. Immunokleuring de gedifferentieerde voorlopers:
      1. Met anti-O4, anti-BIII-tubuline en anti-gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichamen tegen de gedifferentieerde voorlopercellen labelen.
  5. Was de monsters met PBS 3 keer en incubeer ze met secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluorescente kleurstoffen (1: 500) in blokkeeroplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens was de monsters 3 maal met PBS.
    Opmerking: Gebruik secundaire antilichamen die overeenkomen met de gastheren van de primaireantilichamen. Hoechest33343 (1: 2000) wordt gebruikt voor kleuring van kernen.
  6. Voeg montage oplossing voor een dia glas en ga verder met de montage. Observeren en beeld het monster op een confocale microscoop op verschillende golflengten: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), en Hoechest33343 (405 nm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Definieert het kweeksysteem voor aNSCs van de onbekende neurogene regio essentieel voor het begrijpen van deze cellen en het ontwikkelen van hun potentieel gebruik in de hersenen reparatie 12. Het is bekend dat NSC's op verschillende ontwikkelingsstadia en in verschillende gebieden zich anders gedragen 3,4. Onlangs werd bericht dat SCZ-afgeleide cellen vertonen differentiële potentieel voor neuronale differentiatie in vivo en in vitro vergeleke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om NSC's te genereren uit de volwassen muis SCZ en te handhaven voor diverse toepassingen. Er zijn drie cruciale stappen voor het vaststellen van de in vitro kweeksysteem die nodig zijn om te zuiveren en uit te breiden SCZ-NSC. Ten eerste is het belangrijk dat de regio SCZ precies wordt doorsneden van andere potentiële neurogene regio's (Figuur 1B). Dik en nauwkeurige gedeelten met de SCZ gebieden werden verkregen met een 1 mm interval h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Brain Research Program via de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het Koreaanse Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (Grants NRF-2015M3C7A1028790); en door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Gezondheid & Welzijn, Republiek Korea (HI14C3347).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Medium components
DMEM/F12 Gibco11320-033+L-glutamin, +Sodium bicarbonate
Pen/StrepInvitrogen15140-122
N2 supplementGibco17502-048
B27 supplementGibco17504-044
Growth factor
bFGFR&D233-FB
EGFGibcoPHG0313
Buffer
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x dilution
HBSSGibco14175-095
Dissociattion buffer
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Fine forcepsWPI555229F
ScissorsStorzE3321-C
Brain matrix (1 mm)RWD68707
Double-edged razorDORCOST-300
30 G needleSUNGSHIMN1300
Materials
15 ml tubesSPL50015
50 ml tubesSPL50050
35 mm dishSPL10035Petri dish
100 mm dishSPL10090Petri dish
Cover slip (18 mm)Deckglaser111580
12 well dishSPL32012non-coating
6 well dishSPL32006non-coating
Coating materials
PLOSigmaP49570.01%
LamininGibco23017-01510 mg/ml
Primary antibodies 
NestinMilliporeMAB353mouse (1:1,000)
EGFRAbcamab2430rabbit (1:1,000)
DCXSanta CruzSC8066goat (1:500)
Tuj1SigmaT2200rabbit (1:2,000)
GFAPInvitrogen13-0300rat (1:1,000)
O4MilliporeMAB345mouse (1:500)
BrdUAbcamab6326Rat (1:500)
Secondary antibodies
anti-mouse 488InvitrogenA212021:500
anti-mouse cy3Jackson715-165-151
anti-mouse 647Jackson715-606-150
anti-rabbit 488AlexaA21206
anti-rabbit cy3Jackson711-165-152
anti-rabbit 647Jackson711-605-152
anti-goat 488AlexaA11055
anti-goat cy3Jackson705-165-147
anti-goat 647InvitrogenA21447
anti-rat 488InvitrogenA21208
anti-rat cy3Jackson712-166-150
anti-rat 647Jackson712-605-153
Immunostaining materials
BSAMillipore82-100-63% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Dye for staining nuclei

Referenties

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
  2. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388(2007).
  3. Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812(2015).
  5. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  6. Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
  7. Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
  8. Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
  9. Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
  10. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
  11. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
  12. Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  13. Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
  15. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
  16. Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
  17. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  18. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
  19. Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
  20. Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
  21. Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
  22. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
  23. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van de subcallosale zoneneurosfeercultuurmonocuultuurweefseldigestiecelproliferatiedifferentiatie-assaybehandeling met groeifactorenimmunostaining-proceduredissectie van de hersenmatrix
Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.