Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 februari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

In dit artikel

Samenvatting

Bij de ziekte van Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge neuronen degenereren, waardoor motorische stoornissen. Hier melden wij een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van een muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promotor sequentie, het oogsten van individuele fluorescerende neuronen uit de culturen, en het meten van hun transcriptoom met behulp van RNA-seq.

Samenvatting

Bij de ziekte van Parkinson (PD) is wijdverbreid neuronaal verlies gehele hersenen met uitgesproken degeneratie van dopaminerge neuronen in de SNC waardoor bradykinesie, rigiditeit en tremor. De identificatie van levende dopaminerge neuronen in primaire ventrale mesencefale (VM) kweken met een fluorescente merker verschaft een alternatieve manier om de selectieve kwetsbaarheid van deze neuronen te bestuderen zonder te vertrouwen op de immunokleuring van gefixeerde cellen. Hier hebben we te isoleren, distantiëren en cultuur muis VM neuronen gedurende 3 weken. Vervolgens identificeren dopaminerge neuronen in de kweken met behulp eGFP fluorescentie (aangedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter). Individuele neuronen worden geoogst in microcentrifugebuizen met behulp van glas micropipetten. Vervolgens hebben we lyseren de geoogste cellen, en gedrag cDNA synthese en transposon-gemedieerde "tagmentation" om enkele cel RNA-Seq bibliotheken 1, 2 te produceren,ass = "xref"> 3, 4, 5. Na het passeren van een kwaliteitscontrole check, zijn eencellige bibliotheken gesequenced en de daaropvolgende analyse wordt uitgevoerd om de genexpressie te meten. rapporteren we transcriptoom resultaten voor de afzonderlijke dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen. Deze technieken zullen wijdverspreide toepassingen in de neurowetenschappen en moleculaire biologie.

Inleiding

Ziekte van Parkinson (PD) is een ongeneeslijke, leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoening. De oorzaak van deze relatief veel voorkomende aandoening blijft slecht begrepen. Er is wijdverbreid neuronaal verlies over de hersenen, met een uitgesproken neuronale degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra (SNC) waardoor kenmerkende klinische kenmerken van bradykinesie, stijfheid en tremor.

Primaire gemengde kweken die SNc dopaminerge neuronen vooral relevant voor de ziekte van Parkinson. Ventrale tegmental Area (VTA) dopaminerge neuronen zijn betrokken bij beloning en verslaving. Ventrale mesencefale (VM) primaire gemengde embryonale culturen bevatten zowel SNc en VTA dopaminerge (DA) neuronen en GABA-erge neuronen. VM primaire kweken kan nuttig zijn voor neuroprotectie assays en de selectieve kwetsbaarheid van dopaminerge neuronen helderen. Er is geen betrouwbare manier om dopaminerge cellen in kweek op basis van morfologie te identificeren. Hijre ontwikkelen we technieken te identificeren en te oogsten enkele dopaminerge neuronen, en de bouw van single-cell, high-yield RNA sequencing bibliotheken.

Wij rapporteren representatieve RNA transcriptoom data voor alleenstaande dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Dit protocol kan worden gebruikt voor neuroprotectie, neurodegeneratie en farmacologische assays om het effect van diverse behandelingen op de DA / GABA transcriptoom studie. Omdat dopaminerge neuronen vormen een kleine minderheid van de neuronen uitgedrukt in primaire kweken VM, zal het vermogen om deze neuronen in levende culturen betrouwbaar te identificeren een verbeterde reeks eencellige studies inschakelen. Deze nieuwe technieken zullen vooruitgang in het begrip van de mechanismen die plaatsvinden op cellulair niveau te vergemakkelijken en kunnen toepassingen elders op het gebied van neurowetenschappen en moleculaire biologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor verzorging en gebruik van dieren die door de National Institutes of Health, en protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan het California Institute of Technology.

1. Afleiding van primaire dopaminerge celkweken uit embryonale muizenhersenen

  1. Oplossingen en Cultuur Medium
    1. Bereiding van Ascorbinezuur voorraadoplossing
      1. Weeg 352 mg ascorbinezuur. Voeg steriel H 2 O tot een totaal eindvolume van 20 ml. Plaats in 37 ° C waterbad op te lossen. Filteren door middel van 0,2 um spuit tip en op te slaan in 500 ul fracties bij -20 ° C.
    2. Bereiding van Papaïne voorraadoplossing
      1. Verdun papaïne tot 15 eenheden / ml in 1 x Hanks'-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Pipet op en neer 5 keer om goed te mengen. Voor te bereiden op de dag van dissectie.
    3. Bereiding van DNase voorraadoplossing
      1. Weeg 20 mg DNase. Voeg steriel H2O tot een totaal eindvolume van 20 ml. Steriel filter met 0,2 um spuitfilter tip. Bewaar bij -20 ° C in 1 ml porties.
    4. Bereiding stopoplossing
      1. Verdun 5 ml donor paard paarden serum tot 10% in 45 ml 1x HBSS. Steriel filter met een 0,2 um spuitfilter tip. Bewaren bij 4 ° C.
    5. Bereiding van 4% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing
      1. Weeg 2 g BSA en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan een totaal eindvolume van 45 ml. Filter steriliseren met 0,2 um spuitfilter tip. Bewaren bij 4 ° C.
    6. Voorbereiding van de Plating Medium
      1. In 494 ml medium, voeg 1,25 ml kweekmedium dat L-alanyl-L-glutamine (een gestabiliseerde bron van L-glutamine) en 5 ml donor paarden serum bevat. Filter steriliseren met 0,2 urn spuit filter tip. Bewaren bij 4 ° C.
    7. Bereiding van celkweekmedium
      1. In 196 ml plating medium, voeg 4 mL B27 en 200 pi ascorbinezuur. Filter steriliseren met 0,2 urn filter. Bewaar de oplossing bij 4 ° C en binnen een week.
    8. Bereiding van 4% paraformaldehyde (PFA) Oplossing
      Let op: Algemene voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van paraformaldehyd zijn als volgt: Gebruik een zuurkast, vermijd de huid en contact met de ogen, vermijd inademing van de dampen, uit de buurt van hitte of open vuur. Draag geschikte persoonlijke beschermende kleding. PFA kan sensibilisatie en dermatitis veroorzaken, dan was uw handen grondig wassen.
      1. Voeg 10 ml 16% PFA tot 30 ml 1x PBS, pH 7,4.
    9. Bereiding van 0,1% Triton X-100
      1. Pipetteer 1 ml Triton X-100 in 9 ml 1x PBS tot een 10% oplossing. Pipet langzaam te laten viskeuze oplossing pipet tip vullen. Warm in 37 ° C waterbad tot dislossen. Bewaar 10% voorraad bij 4 ° C.
      2. Verdun 10% aandelen tot 0,01% (bijvoorbeeld door het uitvoeren van 2 seriële verdunningen 1:10: verdun 1 ml 10% oplossing in 9 ml 1x PBS tot 1% oplossing te maken, 1 ml 1% oplossing in 9 mL 1 x PBS om 0,1% oplossing).
    10. Bereiding van 10% en 1% donkey serum
      1. Voeg 1 ml donkey serum 9 ml 1x PBS gedurende een 10% oplossing. Voeg 0,5 ml donkey serum 49,5 ml 1x PBS, pH 7,4 voor een 1% oplossing.
    11. Bereiding van 1x PBS
      1. Verdun 10x PBS tot 1x door toevoeging van 50 ml in 450 ml H2O Stel de pH van de oplossing op pH 7,4 met behulp van een pH meter.
  2. Het bekleden van de Culture Dishes
    1. Poly-L-Ornithine Coating
      1. Coat alleen de 10 mm diameter glazen bodem in het midden van de 35 mm schalen met 120 pl poly-L-ornithine met steriele techniek. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Gebruik een vacuüm aspirator de poly-Lo zuigenrnithine. Spoel de gerechten tweemaal met steriele H 2 O.
    2. Laminine Coating (stock concentratie van 1 mg / ml)
      1. Verdun 20 ul laminine met 2 ml steriele H 2 O (eindconcentratie 0,01 mg / ml).
      2. Coat alleen de 10 mm diameter glazen bodem in het midden van de gerechten met 120 pi van laminine verdund tot 0,01 mg / ml met steriele techniek en incubeer gedurende 1 uur of O / N bij 37 ° C vóór gebruik.
  3. muis Dissection
    Opmerking: De methoden van deze dissectie zijn ontworpen voor minimale blootstelling van cellen, worden overgedragen uit embryonale zakken naar de incubator. De levensvatbaarheid van de cellen behouden blijft door het verwijderen van slechts een gedeelte van de hersenen dissectie van de middenhersenen. Isolatie van de middenhersenen verloopt sneller zonder dat de gehele hersenen om de regio ontleden. Zie Tabel Materialen voor de muizenstam gebruikt in deze studie.
    1. Euthanaseren een getimede zwangere muis op zwangerschapsdiabetes dag 14 met behulp van CO 2.
    2. Spray de buik van het inslapen muis met 70% ethanol. Pak de huid van de onderbuik behulp van een tang met 2 x 3 tanden en open de buikholte behulp bot mes chirurgische schaar. Maak twee sneden bewegen zijdelings en proximaal aan elke kant. Vouw over de buikwand met behulp van een tang om de buikholte bloot te leggen.
      OPMERKING: De baarmoeder wordt nu bloot. Blootstellen van de borstholte en de creatie van pneumothorax zorgt er ook voor dat het dier niet terug te vorderen.
    3. Snijd beide uiteinden van de baarmoeder hoorn naar de baarmoeder scheiden. Plaats in een petrischaal in een steriele kap.
    4. Het gebruik van rechte-tip pincet in elke hand open de embryo zak en verwijder het embryo. Snel onthoofden door knijpen hoofd uit bij de hals met de tang. Stabiliseren het hoofd met de tang stevig op de snuit geplaatst, zodat het dorsale oppervlak toegankelijk.
    5. Behulp van de tang die in de andere hand, knijp de laag van de huid en de schedel net voor de nok van het mesencephalon. Trek de huid en de schedel caudaal langs de middellijn. Plaats tang rond de kam met een tip tussen de cortex en mesencephalon en de andere over het cerebellum.
    6. Knijpen en verwijder de gehele middenhersenen, met achterlating van de voorhersenen op de rostrale kant en cerebellum aan de caudale kant. Plaats in een petrischaal met koude HBSS onder een stereomicroscoop.
    7. Herhaal de procedure voor de resterende embryo's.
    8. Onder de microscoop ontleden, flip-over het brein segment, zodat de buikzijde is nu toegankelijk. Er zijn nu 4 kwadranten zichtbaar. Verwijderen van de hersenvliezen en bloedvaten door voorzichtig grijpen de hersenvliezen en omhoog te trekken weg van de hersenen.
    9. Gebruik een tang om de hersenen segment te stabiliseren, terwijl het scheiden van de middenhersenen. Plaats een tong pincetten in de ventrikel ongeveer in het midden van het segment. Maak de eerste pinch dorsaal, wijzend into de schotel, dan mediaal aan elke kant. Neem de onderste twee kwadranten door het maken van laterale snijdt aan beide kanten.
      LET OP: Het weefsel van belang is in het ventrale inferieure sectie, die dichte verschijnt. Deze regio bevat zowel de VTA en SNC.
    10. Trim en het weefsel dat is minder dicht weggooien: dit omvat de superieure en inferieure colliculi. Plaats de ontleed weefsel die zowel de VTA en SNc in verse HBSS op een apart deel van de petrischaal.
      Opmerking: In deze fase van muizenhersenen ontwikkeling (E14), wordt het gebied van belang in de ventrale middenhersenen gescheiden door een ventrikel van de zona incerta en andere hypothalamus celgroepen. Hoe meer lange structuur van de ontwikkeling van embryonale muizenhersenen maakt het onderscheid tussen deze gebieden, die dichter bij elkaar liggen in het volwassen muizenhersenen.
    11. Herhaal dit voor alle resterende hersenen segmenten.
    12. Immers de hersenen segmenten zijn ontleed, een tang en een No. 11 scalpel tot kwartaal each middenhersenen deel in stukken van ongeveer gelijke grootte.
  4. Dissociëren de cellen
    1. Enzymatische behandeling van cellen
      1. Gebruik een breed-boring P1000 pipetpunt tot het nemen van alle gevierendeeld middenhersenen segmenten in de HBSS en leg ze in een 15 ml conische buis. Laat de segmenten naar de bodem van de buis en verwijder HBSS die heeft opgenomen met de in vieren delen.
      2. Voeg 500 ul van papaïne oplossing aan de buis en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Resuspendeer cellen door vinger flicking de buis na 7,5 min.
      3. Met behulp van een breed boring P1000 tip, pipet alleen de middenhersenen segmenten in een 1 ml portie van deoxyribonuclease I (DNase) oplossing. Laat de segmenten naar de bodem van de buis.
      4. Met een brede boring P1000 tip, alleen overdragen de middenhersenen segmenten een 15 ml buis met 1 ml koud stopoplossing te spoelen. Laat de segmenten naar de bodem van de buis en herhaal de spoeling opce meer.
    2. Mechanische Wrijven celsuspensie
      1. Vervang de laatste spoelen met 1 ml vers stop-oplossing en pipet op en neer 7x met een P1000 pipet tip om cellen vermaal. Vermijd overmatige aanwrijven om cellysis te minimaliseren.
      2. Onderlaag de celsuspensie door langzaam pipetteren 200 pi 4% BSA oplossing in de bodem van de buis. Voorzichtig trekken de pipet tip om te voorkomen dat het verstoren van de celsuspensie laag. Na centrifugatie bij 280 xg gedurende 6 min, zuig de supernatant met P1000 en resuspendeer de cellen in 1 ml plaatmedium.
  5. Tellen en Plating de cellen
    1. Voeren celtelling met een hemocytometer. Verdun de celsuspensie tot 1000 cellen / ul, met plaatmedium.
    2. Met behulp van een vacuüm aspirator, zuig het laminine uit de beklede schalen in porties van ten hoogste drie gerechten. Plaat 120 pi (1,2 x 10 5 cellen / schaal (78,5 mm 2 )) Van de celsuspensie op het beklede oppervlak van de vaat direct na opzuigen elke partij. Dit voorkomt dat de gerechten uitdrogen en dat een oneffen oppervlak.
    3. Na 1 uur wordt voorzichtig 3 ml kweekmedium niet geplaatste gebied van de kweekschaal om verstoring van de cellen te minimaliseren.
    4. Voer een half volledige mediumverversing op celcultuurschalen 3 d intervallen gedurende 3 weken.

2. Oogsten Gekweekte-dopaminerge neuronen voor RNA Sequencing

OPMERKING: Een overzicht van de cel oogsten en eencellige RNA-Sequencing protocol gegeven in figuur 1.

  1. Stappen om uit te voeren voordat de dag van het experiment
    1. Schoon borosilicaatglas capillaire buizen door sonicatie in 100% ethanol gedurende 15 minuten en daarna weer in gedestilleerd H2O gedurende 15 min. Giet de buis en bak 's nachts in een oven op 200 ° C tot RNase inactiveren.
    2. Gebruik vers geopendeRNase-vrij pipetpunten een voorraadoplossing van 10x reactiebuffer bereid door het mengen van 19 ul van 10x lysisbuffer van de sequencing kit met 1 pi van de RNase inhibitor oplossing (20 pi totaal volume) in een microcentrifugebuis. Spin down van het mengsel kort met behulp van een micro-centrifuge en blijf op ijs.
    3. Voeg 2 pi van de 10x reactiebuffer aan elk van de afzonderlijke 0,2 ml PCR buizen (gebruikt om de geoogste neuronen verzamelen). Label de buizen met geschikte tags van neuronen worden geoogst en ingevroren opslag bij 4 ° C.
  2. Stappen uit te voeren op de dag van het experiment
    1. Fabricage van de Harvesting pipetten.
      1. Trek micropipetten grote-tip diameter (2-8 pm) van de gebakken capillaire buis met behulp van een micro-elektrode trekker en de glas-gecoate verwarming gloeidraad van een microforge. Zet de trekker te micropipetten met een lange taper vormen. Gebruik een microforge uitgerust met een geijkte oculairgraticule en een high-power obsubjectieve naar de punt van de micropipet breken om de gewenste tip grootte (10 - 20 urn).
      2. Bevestig de micropipet in de microforge pipet houder en monteer de houder op de microforge. Breng de punt van de micropipet in beeld boven de met glas beklede gloeidraad met de mechanische manipulator van de microforge en schakel de stroom naar de gloeidraad te verwarmen. Raak de pipet tip om de gloeidraad. Schakel de stroom als de pipet tip is gesmolten aan de juiste diameter.
        NOTITIE. Het afsluiten van de stroom zal ertoe leiden dat de gloeidraad plotseling naar beneden te bewegen en los te maken van de pipet tip, het produceren van een grote, open-tip pipet met de gewenste diameter.
      3. Bewaar de ingevulde micropipetten in een gesloten doos totdat het nodig is.
    2. Het oogsten van de neuronen.
      NOTITIE. Gekweekte neuronen werden geoogst na een gemodificeerde versie van een eerder gepubliceerd protocol 6.
      1. grondig clean alle oppervlakken van de cel-oogsten kamer die in contact komen met de cultuur gerechten en verzameling buizen met behulp van vloeibare ontsmettingsmiddel en water, gevolgd door een spoeling met water komen. Veeg de gedesinfecteerde oppervlakken met 80% ethanol en vervolgens een-RNase-inhibitor toegediend af te vegen.
      2. Vul twee geïsoleerde containers met ijs, een met gewone (water) ijs en een andere met droogijs. Plaats de 0,2 ml PCR-collectie buizen die eerder gevuld met 2 pl van 10x reactiebuffer op de reguliere ijs.
      3. Verwijder de kweekschaal met de neuronen van de incubator, laat het kweekmedium van de schaal, spoelen met 2 ml RNase-vrij Dulbecco's PBS (DPBS) en vervangen door 1 ml van DPBS voor het oogsten.
      4. Identificeer fluorescerende, TH-positieve neuronen in de primaire middenhersenen culturen met behulp van een omgekeerde, epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een 40X fase doelstelling, een Hg lamp, en een GFP filter set.
      5. Plaats de pipet in de cel soma met behulp van een gemotoriseerde of handmatige micromanipulator. Zuig het neuron in de glazen micropipet met zachte zuigkracht oraal toegepast door de plastic buis aan de zijpoort van de micropipet houder. Verwijder onmiddellijk de micropipet met de cel van de baden oplossing.
      6. Plaats de pipetpunt in een 0,2 ml PCR buis verzameling met reactiebuffer en de punt breken tegen de zijkant van de buis dichtbij de bodem. Verdrijf de resterende vloeistof (0,5-1,5 pl) van de gebroken punt van de micropipet door een steriele 21 G naald in de achterkant van de micropipet en het toepassen van uitwendige druk.
      7. Centrifugeer de collectie buis gedurende 5 s met behulp van een desktop micro-centrifuge en invriezen in droogijs. Bewaar de verzamelbuizen waarin de afzonderlijke cellen bij -80 ° C. Gewoonlijk worden 5 de cellen geoogst per schaal gedurende een periode van 1 uur bij omgevingstemperatuur.

3. Single-cell RNA-Seq Library Generation

  1. Generatie van de eerste streng cDNA
    OPMERKING: Voor de volgende stappen te gebruiken reagentia van het commerciële sequencing kit.
    1. Breng de volgende reagentia op ijs de PCR kast. Bereid een eerste streng master mix plus 10% door het combineren van de volgende reagentia bij kamertemperatuur in een PCR kast: 2 pl 5x eerste streng buffer, 0,25 ul DTT (100 mM), 1 uL dNTP mix (10 mM), 1 ui oligonucleotide ( 12 pm), 0,25 pl RNase Inhibitor, en 1 pl reverse transcriptase (100 eenheden). Dit is de reverse transcriptase master mix (5,5 pi totaal volume per reactie).
    2. Neem de monsters uit de -80 C op droog ijs en breng aan de PCR kast. Voeg de volgende aan de enkele cel monster: 1 ui 3 'primer 1 en 1 pi gekwantificeerd RNA spikes. Breng monsters op een koelmachine blok een hot-deksel thermocycler vooraf bij 72 ° C.
    3. Incubeer de buizen in de thermocycler gedurende 3 min bij 72 ° C, en vervolgens de monsters aan een PCR koeler rack.Voeg 5,5 pi van de master mix (uit stap 3.1.1) aan elke reageerbuis en meng door pipetteren voorzichtig. Draai de 0,2 ul buizen voor 5 s en incubeer in een thermocycler als volgt: 42 ° C gedurende 90 min, 70 ° C gedurende 10 minuten. Houden op 4 ° C.
  2. Zuivering van Amplified First Strand cDNA.
    OPMERKING: De PCR-geamplificeerde cDNA werd gezuiverd door immobilisatie op magnetische korrels. Gebruik een magnetische scheidingsinrichting voor 0,2 ml buizen.
    1. Aliquot de magnetische korrels in 1,5 ml buizen. Voor elk gebruik, brengt kraal aliquots tot kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten en meng goed te dispergeren. Vortex magnetische korrels tot het gelijkmatig gemengd.
    2. Voeg 25 ul van magnetische korrels aan elk monster. Meng door pipetteren het volledige volume omhoog en omlaag op zijn minst 10x om grondig te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de cDNA binden aan de kralen te laten.
  3. Bereiding van PCR Master Mix
    1. Bereid de ds-cDNA amplificatie PCR master mix voor alle reacties met een Additional 10% door 5 pl 10x PCR-buffer, 2 pl dNTP mix (10 mM), 2 pi PCR-primer 2 (12 uM), 2 pl 50x 2 polymerase mengsel en 39 pi nuclease vrij water (50 pi totaal volume / reactie).
  4. Amplificatie van First Strand
    1. Plaats de monsters en magnetische korrels op de magnetische scheidingsinrichting ≥5 min, tot de vloeistof volledig duidelijk en er zijn geen korrels meer in het supernatant.
    2. Het houden van de monsters op de scheiding apparaat, pipet het supernatant af en gooi. Spin de monsters gedurende 5 s aan de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters op de magnetische scheiding apparaat gedurende 30 s, verwijder alle resterende bovenstaande vloeistof met een pipet P10.
    3. Voeg 50 ul van het PCR master mix aan elke buis bevattende DNA gebonden aan de parels uit de vorige stap. Plaats de buis in een voorverwarmde thermal cycler (95 ° C) met een verwarmd deksel. Begin de thermische cycli met behulp van de volgende program: 95 ° C gedurende 1 minuut, 26 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 6 min. Dan 72 ° C 10 min. Houden op 4 ° C.
      OPMERKING: Raadpleeg sequencing handleiding voor meer informatie en om de sample-instellingen te optimaliseren.
  5. Zuivering van Amplified Dubbelstrengs cDNA
    1. Voeg 90 ul van kralen aan elk monster. Meng door pipetteren het volledige volume omhoog en omlaag op zijn minst 10x om grondig te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de cDNA binden aan de kralen te laten. Plaats de monsters plus parels op de magnetische scheidingsinrichting voor ≥5 min, tot de vloeistof volledig duidelijk en er zijn geen korrels meer in het supernatant.
    2. Terwijl de monsters op de magnetische scheiding apparaat, de bovenstaande vloeistof en gooi. Houd de monsters op de magnetische scheidingsinrichting. Voeg 140 ul vers bereide 85% ethanol aan elk monster zonder de kralen. Wacht 30 s. Pipet uit de bovendrijvende. cDNA wordt gebonden aan de bea blijvends tijdens het wasproces.
    3. Herhaal de ethanol te wassen eens te meer.
    4. Kort draaien de monsters om de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters op de magnetische scheidingsinrichting voor 30 s, verwijder alle resterende ethanol met een pipet. Plaats de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2-2,5 min totdat de pellet droog is en niet meer glanzend (dat wil zeggen voordat een scheur verschijnt).
      LET OP: Droog de pellet slechts tot het net droog. De pellet ziet er mat zonder glans. Als de pellet niet droog is, zal ethanol in de steekproef putten blijven, geeft het versterkte cDNA recovery rate en de opbrengst zal verminderen. Als de pellet voorbij droog, zal er scheuren in de pellet. Het zal langer dan 2 minuten te rehydrateren te nemen en kunnen versterkte cDNA herstel en de opbrengst te verminderen.
    5. Zodra de korrels droog, voeg 22,5 ul elutiebuffer aan de korrel pellet dekken. Verwijder de monsters van de magnetische scheidingsinrichting en meng om de kralen resuspenderen. Incubate bij KT gedurende 10 min hydrateren.
    6. Spin de monsters gedurende 5 s aan de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters weer op de magnetische scheidingsinrichting voor ≥1 min, tot de oplossing volledig helder.
      OPMERKING: Een kleine populatie van kralen kunnen niet tegen de magneet pellet tijdens incubatie. Pipetteer deze unpelleted kralen op en neer te mengen met het supernatant en pipet die naar de magneet waar de rest van de korrels reeds gepelleteerd (zonder verstoring van de bestaande pellet).
    7. Ga door met de incubatie tot er geen kralen in het supernatant blijven. Transfer heldere bovenstaande vloeistof die gezuiverde cDNA van elke buis naar een nuclease-vrij, lage wrijvingscoëfficiënt buis. Label elke buis met het monster informatie en bewaar bij -20 ° C. De monsters kunnen onbeperkt worden bewaard bij -20 ° C.
  6. Meting van DNA concentratie en fragmentgrootte
    1. Voer een kwaliteitscontrole door het kwantificeren van een 1 pl alIQUOT van het cDNA op een fluorometer. Cijfer 1 pl (3 ng) ds-cDNA met een elektroforesesysteem (zoals beschreven in 1).
  7. Fragmentatie van DNA
    LET OP: Gebruik een DNA-monster voorbereiding kit.
    1. Voeg 20 ul cDNA (35 ng totaal) met een buis. Voeg 25 ul van Tagment DNA (TD) buffer aan de buis met het cDNA.
    2. Voeg 5 ul van TDE1 (Tagment DNA Enzyme) aan de buis. Pipet op en neer 10x te mengen. Gebruik een nieuwe tip voor elk monster. Centrifugeer bij 280 xg bij 20 ° C gedurende 1 min.
    3. Plaats de monsters in een thermocycler met een verwarmd deksel en laat deze: 55 ° C, 5,5 min. Voeg snel 50 ul QG oplossing (gelextractiekit). Pipet op en neer 10x te mengen. Kunnen rechtstreeks naar de volgende stap.
  8. Zuivering van gefragmenteerde DNA
    1. Voeg 170 ul van kralen, pipet op en neer 10x te mengen. Laat het zitten voor 10 min. Zet buizen op de magneet. Laat de buizen zitten op de magneet gedurende 10 min.Terwijl de monsters op de magnetische scheidingsinrichting, pipet het supernatant en gooi.
    2. Laat de buis op de magneet en voeg 200 pl 85% ethanol. Laat zitten voor 30 s, verwijder dan ethanol. Herhaal de ethanol wassen. Spin de buis 1000 XG bij RT.
    3. Zet de buis weer op de magneet. Pipet off eventueel resterende ethanol. Laat de monsters gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    4. Voeg 21 ul elutiebuffer uit de gel extractie kit. Laat de buis zitten van de magneet, pipet op en neer 10x te mengen. Laat de buis zitten bij kamertemperatuur 15 min.
    5. Zet de buis naar de magneet voor 5 min. Pipetteer 20 ul oplossing (gezuiverde DNA) in een nieuwe buis.
  9. Tagging en PCR-amplificatie van het gefragmenteerde DNA
    LET OP: In deze stap wordt het gezuiverde DNA wordt versterkt via een beperkte-cyclus PCR-programma. De PCR-stap voegt ook index 1 (i7) en index 2 (i5) alsmede gemeenschappelijke adapters (P5 en P7) (vereist voor cluster generatie en sequencing). Zie de DNA'svoldoende voorbereiding gids voor meer details.
    1. In een nieuwe buis voeg 5 ul van index 2 primers (witte dop). Met behulp van een nieuwe pipetpunt voeg 5 ul van index 1 primer (oranje deksel). Voeg 15 ul PCR Master Mix aan elke buis.
    2. Voeg 5 ul PCR-primer cocktail aan elke buis. Voeg 20 ul van het gezuiverde DNA aan de buis. Voorzichtig pipet op en neer 3-5 keer.
    3. Voer PCR met het volgende programma op een thermocycler: 72 ° C gedurende 3 min, 98 ° C gedurende 30 s, 5 cycli van 98 ° C gedurende 10 s, 63 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 3 min. Houden op 10 ° C. Ga onmiddellijk de PCR clean-up of bewaar het monster bij 4 ° C gedurende maximaal 2 d.
  10. Zuivering van geamplificeerde DNA-fragmenten
    1. Breng de parels tot kamertemperatuur. Bereid verse 85% ethanol. Monsters te nemen uit de PCR-machine en spin down kort.
    2. Voeg 30 ul van kralen aan de buis. Voorzichtig pipet mengen op en neer 10x. Laat de buis op kamertemperatuur gedurende 5 minuten. plaats back op de magneet gedurende 5 min. Met de buis op de magneet gebruikt een pipet aan het supernatant verwijderen.
    3. Voeg 200 pl 85% ethanol aan elke buis. Pipette ethanol uit na 30 s. Herhaal dit 85% ethanol wassen. Pipette ethanol uit na 30 s.
    4. De buizen nog op de magneet en de doppen open en laat de korrels aan de lucht drogen gedurende 15 min. Verwijder de buizen uit de magneet.
    5. Voeg 32,5 ul elutiebuffer. Voorzichtig pipet op en neer 10x. Incubeer van de magneet voor 10 - 15 min.
    6. Zet de pijpen naar de magneet gedurende 2 minuten of totdat de bovenstaande vloeistof is verdwenen. Zorgvuldig overdracht 30 pi van het supernatant naar een nieuwe buis.
  11. Meting van DNA concentratie en fragmentgrootte
    1. Voer een kwaliteitscontrole door het kwantificeren van de DNA concentratie van 1 pi van de cDNA op een fluorometer. Bepaal de fragmentgrootte van het DNA door elektroforese. Beoordelen van 1 pl (3 ng) van ds-cDNA.
  12. sequencing
    1. Breng de enkele cel RNA-Seq bibliotheken om een ​​sequencing faciliteit. Genereer 100 bp sequencing leest op een sequencer naar aanleiding van een eerder gepubliceerd protocol 4.
      OPMERKING: Elke sequencing bibliotheek genereert> 20 miljoen unieke mapping leest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier beschrijven we een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van de muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase promotor sequentie, oogsten individuele fluorescente neuronen van de kweken en het meten van hun RNA transcriptoom middels RNA-seq (figuur 1). De gegevens toonden aan dat 100% van de TH-eGFP-positieve cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen, gebaseerd op de aanwezigheid van de volgende drie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier isoleren we enkele cellen uit een heterogene populatie met behulp van een fluorescent label, dan studeren elke cel met single-cell RNA-seq. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die we geoogst en de sequentie inderdaad dopaminerge neuronen, gebaseerd op de aanwezigheid van de volgende drie DA-gerelateerde gen transcripten, TH, DDC en slc6a3. Alle TH-eGFP positieve cellen brachten deze drie genen zoals beoordeeld door RNA-Seq. Dit was overeenstemmend met elektrofysiologische studies waaruit bleek da...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), de Michael J. Fox Foundation, en de Caltech Innovation Initiative die het Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory aan het California Institute of Technology financiert. We danken Brian Williams voor het optimaliseren van het RNA-Seq bibliotheekprotocol en voor de assistentie. We danken Henry Amrhein voor computationele training. We danken Barbara J. Wold voor het gebruik van haar apparatuur en laboratoriumruimte. We danken Igor Antoshechkin voor bibliotheek sequencing, en voor het beheer van de faciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PapaïneWorthington Biochemical Corporation LS003126
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1xGibco 14175-095
Donor Equine SerumThermo Scientific SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma A7030-50G
Medium: Neurobasal mediumGibco 21103-049
Culture media dat een gestabiliseerde vorm van L-glutamine bevat, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAXGibco 35050-0610,5 mM uiteindelijke concentratie.
L-Ascorbic acidSigma A7506
B27Gibco 17504-04450x stockoplossing, 1x uiteindelijke concentratie.
35 mm glazen bodemschalenMatTek  P35GC-1.5-10-C
Poly-L-OrnithineSigma P4957
LaminineSigma L2020Opgeslagen bij -20 °C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase)Sigma DN25
Blauwe pipettentips P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
10 mm ondiepe Petri-schaalVWR 25384-324
37 °C waterbad
37 °C, 5% vochtigheids incubator
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100Sigma X100-500ML
EzelsserumEquitech SD-0100HI100% stockoplossing, 1% uiteindelijke concentratie.
Standaard patroon chirurgische schaarFine Science Tools14000-14
Pincetten - 2x3 tandenFine Science Tools11022-14
Pincetten - Dumont #55Fine Science Tools11295-51
Pincetten - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS, pH 7,4Gibco 70011-044
Dulbecco's fosfaatgebufferde oplossing (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 G naaldBD PrecisionGlide naald305167100 naalden
Micropipet aantrekkrachtSutter Instrumentmodel P-87
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit voor Illumina SequencingClontech634936100 rnxs, incl Advantage2PCR Kit
oligonucleïde (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM)Van de SMARTer Kit 
Omgekeerde transcriptase (100 eenheden)SMARTcribe omgekeerde transcriptaseVan de SMARTer Kit 
Primer 13’ CDSIIa primer Van de SMARTer Kit
Primer 2IS PCR primerVan de SMARTer Kit
50x 2 polymerase mix50x Advantage 2 polymerase mixVan de SMARTer Kit
10x PCR buffer10x Advantage 2 PCR bufferVan de SMARTer Kit
RNA SpikesThermoFisher4456740
PCR koelrekIsoFreeze PCR koelrek
DNA Sample Preparatie Kit (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 Samples
PCR master mixNextera PCR master mix (NPM)Van de Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC) Nextera PCR primer cocktail (PPC) Van de Nextera Kit
FluoroMeterThe Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer kitAgilent5067-4626110 rxns
Elektroforese systeem Agilent 2100 Bioanalyzer.G2938C
Magnetische kralen: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 mL
RNAse doek: RNAse Zap doekjesAmbionAM9786Maat 100 vellen
Qubit ds HS Assay KitMolecular probes Q32854500 assays
Gel extractie kit: Qiaquick Gel Extractie KitQiagen 28704
Glazen capillair buis(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm o.d.)
MicroforgeNarishige (of equivalent) 
SequencerIllumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP muis stam MMRRC stocknummer: 000292-UNCStock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center
```

Referenties

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Oogsten van enkelvoudige cellenventraal mesencefale culturencelisolatiefluorescentiemicroscopiecDNA-synthesegenexpressieanalyse
Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.