Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Samenvatting

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Samenvatting

Analyse van de mitochondriële structuur-functierelatie is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de mitochondriële functionaliteit. Fluorescentiemicroscopie is een onmisbaar hulpmiddel voor de directe beoordeling van de mitochondriale structuur en functie in levende cellen en voor het bestuderen van de mitochondriële structuur-functierelatie, die voornamelijk wordt gemoduleerd door de moleculen die de splitsings- en fusiegebeurtenissen tussen mitochondriën regelen. Dit artikel beschrijft en demonstreert specifieke methoden voor het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in levend evenals in gefixeerd weefsel in het modelorganisme Drosophila melanogaster. Het weefsel van keuze hier is de Drosophila-eierstok, die kan worden geïsoleerd en geschikt gemaakt voor ex vivo levende confocale microscopie. Verder beschrijft het artikel hoe de mitochondriale splitsingseiwit, Drp1, genetisch kan worden gemanipuleerd in Drosophila-eierstokken om de betrokkenheid van Drp1-gedreven mitochondriale splitsing in het moduleren van de mitochondriële structuur-functierelatie te bestuderen. Het brede gebruik van dergelijke methoden wordt aangetoond in reeds gepubliceerde evenals in nieuwe gegevens. De beschreven methoden kunnen verder worden uitgebreid naar het begrijpen van de directe invloed van voedingsstoffen en/of groeifactoren op de mitochondriale eigenschappen ex vivo. Gezien het feit dat mitochondriale verstoring ten grondslag ligt aan de etiologie van verschillende ziekten, wordt verwacht dat de beschreven innovatieve methoden die zijn ontwikkeld in een genetisch hanteerbaar modelorganisme, Drosophila, aanzienlijk zullen bijdragen aan het begrip van de mechanistische details van de mitochondriële structuur-functierelatie en aan de ontwikkeling van mitochondria-gerichte therapeutische strategieën.

Inleiding

Mitochondriën zijn klassiek beschreven als de cellulaire powerhouse, omdat zij de belangrijkste zetels van de energieproductie in gedifferentieerde cellen. Bovendien mitochondria spelen een cruciale rol in de stofwisseling, warmteontwikkeling, lipide modificatie, calcium en redox homeostase, de orkestratie van cell signaling processen, etc ^1. Mitochondriën ook een actieve rol bij de inductie van celdood ^2, evenals regulering van de celcyclus ³ spelen. Dergelijke multifunctionaliteit roept de volgende fundamentele vragen: a) hoe mitochondriën presteren al deze functies gelijktijdig en b) zijn er specifieke mitochondriale zwembaden of subzones die gespecialiseerd zijn voor verschillende functies? In dit verband is het belangrijk op te merken dat de multifunctionele mitochondriën dynamisch van vorm, afmeting en structuur die afzonderlijke cellen en dat de steady-state vorm mitochondriën variëren tussen celtypen. Tientallen jaren van onderzoek uit verschillende labretorica suggereren dat de wijziging van de mitochondriale vorm, grootte en structuur, collectief genoemd mitochondriale dynamiek, is cruciaal voor het handhaven van verschillende mitochondriale functies _^4,5,6. Deze bevindingen opmerkingen de mogelijkheid mitochondriën hun multifunctionaliteit kan bereiken vanwege de structurele dynamiek.

Uitgebreide inspanningen worden gedaan om de mitochondriale structuur-functie relatie te begrijpen. De dynamiek van mitochondriale structuur wordt voornamelijk onderhouden door hun vermogen om splitsing en fusie gebeurtenissen ondergaan met elkaar. Splijting van grote mitochondria omzet in kleinere mitochondriale elementen, terwijl fusie tussen twee kleinere mitochondria ze over in een grotere mitochondriale element ^7. Bovendien kan voorbijgaande fusie van twee mitochondria opkomen bij het mengen van de inhoud mogelijk. De splitsing en fusie gebeurtenissen van de binnenste en buitenste membranen worden zorgvuldig geregeld door specific sets van eiwitten. De kern splijting machine is samengesteld uit dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1), die wordt gerekruteerd uit het cytosol naar de mitochondria van de interactie met bepaalde bonafide mitochondriale eiwitten (bijvoorbeeld Fis1 of Mff1), terwijl Drp1 functie ook kan worden geregeld andere eiwitten op het oppervlak mitochondriale ^4. Hoewel Drp1 werkt op de buitenste membraan, de splitsing vaardigheden invloed hebben op de binnenste membraan ook. De orkestratie van de splitsing van de buitenste en binnenste mitochondriële membranen is niet goed begrepen. Anderzijds is fusie van het binnenste membraan beheerst de kern door de activiteiten van Opa1, terwijl mitofusins regelen de fusie van het buitenste membraan ^5. Het saldo van het tegengaan van kernsplijting en kernfusie gebeurtenissen van mitochondria dicteren de steady-state mitochondriale vorm in een cel. Bijvoorbeeld, onderdrukking van mitochondriale splitsing leiden tot volledig en ongehinderd fusie, terwijl de overactiviteit van mitochondriënl splitsing zou leiden tot fragmentatie van mitochondria ^3.

De studie van de mitochondriale structuur-functie relatie omvat voornamelijk twee elkaar aanvullende benaderingen: a) analyses van de cellulaire en organismaal fenotypes na genetische manipulatie van mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten en b) directe beoordeling van mitochondriale structuur en functie. Het is opmerkelijk dat genetische analyses de directe werking van het molecuul op de hand (in dit geval mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten) niet altijd kan blijken, aangezien de fenotypes kunnen worden veroorzaakt door secundaire effecten. Het is daarom van het grootste belang te ontwikkelen en te gebruiken hulpmiddelen om mitochondriale structuur en functie direct bestuderen. Elke beoordeling van de mitochondriale structuur omvat verschillende microscopie gereedschappen. Het gebruik van fluorescentie microscopie van levende cellen is sterk gevorderd de studies van mitochondriale dynamiek, omdat mitochondriale dynamiek kan worden gecontroleerd, zowel kwalitatief als quantitattend met de juiste fluorescentiemicroscopie en -technieken ^8. Fluorescentie-microscopie instrumenten ontwikkeld om mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila melanogaster weefsels ophelderen van het belang van mitochondriale dynamiek in vivo ^9. Deze en verwante werkwijzen worden beschreven, met als doel het bestuderen mitochondriale structuur en functie in de Drosophila eierstok.

De Drosophila eierstok bestaat uit kiemlijn en somatische lijnen, die voortvloeien uit hun volwassen stamcellen die in de germarium ^10,11 bevinden. Zestien syncytieel kiemcellen (GC) krijgen ingekapseld door somatische follikel cellen (FCS) aan individuele ei kamers die naar voren komen uit de germarium (figuur 1) te vormen. Eén van de 16 GC gecommit om een ​​eicel te worden, en de resterende 15 GC ontwikkelen tot verpleegkundige cellen die de groei van de eicel kamerhouderVergemakkelijking van de rijping van de eicel voordat het wordt gelegd. De meerderheid van de FC's ondergaan 9 ronden van mitotische delingen voordat ze de mitotische celcyclus verlaten terminaal differentiëren in een patroon epitheliale cellaag bestaande uit anterior follikelcellen (AFCs), posterior follikelcellen (PFK's) en hoofdlichaam cellen (MBCS) . De opeenvolgende ei kamers zijn verbonden door steel cellen die gedifferentieerd cellen die ook zijn afgeleid van het FK vroeg in de ontwikkeling. Mitochondriale vorm gereguleerd door de mitochondriale kernsplijting eiwit Drp1 is actief betrokken bij het proces van differentiatie tijdens de normale ontwikkeling van de Drosophila eierstokkanker FC laag ^9,12. De in deze studies de betrokkenheid van Drp1 in Drosophila follikel cellaag ontwikkeling identificeren werkwijzen worden hier beschreven.

Protocol

1. Bereiding van Drosophila (het gereedschap zijn weergegeven in figuur 2A)

1. Voor elk van de beschreven experimenten, verzamelen Drosophila (gehandhaafd bij kamertemperatuur of 25 ° C) binnen 5 dagen na verpopping en plaats ze in een flesje gevuld met 5-7 ml Drosophila voedsel (zie Materialen tabel), met niet meer dan 25 vliegt in elk flesje; onderhouden van een vrouwelijk: mannelijk verhouding van 2: 1.
2. Strooi een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist Drosophila eieren stimuleren. Voer experimentele manipulatie binnen 2-4 dagen.

2. Dissectie van Drosophila Eierstokken (de instrumenten die nodig zijn weergegeven in figuur 2A)

1. Warm insect ontleden medium (zie Materialen Table) op kamertemperatuur, 25 ° C. Vul drie putjes van een acht-putjes ontleden glazen schaal met 200 ul medium in elk putje.
2. Verdoven Drosophila met CO _{2 door het plaatsen van de naald van de klap pistool onder de flacon plug. Leg ze op een vlieg pad. Met behulp van een microscoop ontleden, uitzoeken 5 vrouwen en plaats ze in het eerste putje van het ontleden schotel. Behandel een Drosophila op een moment dat het uitvoeren van live-microscopie.}
3. Terwijl u door het oculair van de dissectie microscoop, scheiden de thorax van de buik met behulp van twee paar tang. Behulp van de tang voorzichtig de buik dragen aan de tweede put van de schotel.
4. Met een pincet aan de buik aan het achtereinde houden en langzaam duw de eierstokken uit (samen met de andere abdominale inhoud) met het andere paar pincetten. Mocht deze poging mislukt, verwijder voorzichtig de buik exoskelet door het invoegen van de tang in de voorste einde aan de eierstokken vrij te geven.
5. Met behulp van de tang, houdt een individuele eierstok door de ondoorzichtige achterste einde (dat wil zeggen, de dooier gevuld, laat stadium eieren) en verplaats het goed naar de derde bron van de schotelom plagen te verwerken voor levende microscopie (stap 3) of voor bevestiging aan immunokleuring (stap 7) voeren.
6. plagen zorgvuldig de beschermhuls van rond de eierstokken door vegen een plagen naald licht van het achterste naar het voorste uiteinde van elke eierstok bij het vasthouden van het achterste uiteinde van een pincet.
   OPMERKING: Om schade te minimaliseren tijdens de plagen, buig de naaldtip en zoom in op elk eierstok door het verhogen van de vergroting van de microscoop (Figuur 2A). Plagen moeten effectief genoeg om het omhulsel te breken, maar moet zorgvuldig worden uitgevoerd om de integriteit van de ovarioles behouden.

3. Voorbereiding voor Live-weefsel Microscopie

Opmerking: Het gereedschap is weergegeven in figuur 2A.

1. Voordat Drosophila dissectie, bereiden polyL-lysine gecoate kamers. Hiertoe plaatst twee 20-pl druppels polyL-lysine (0,1 mg / ml) op de coverglass (14 mm, No. 0) van een glazen bodem petrischaal (35 mm) op een redelijke afstand van elkaar teneinde het samenvoegen van de druppels voorkomen. Lucht Droog de platen gedurende 1 uur bij 37 ° C en markeren de randen van de witte polyL-Lysine film op de onderzijde van de plaat met een wisbare marker.
   OPMERKING: De polyL-lysine-gecoate kamers kan een week bewaard bij 4 ° C. Bij gebruik van een eerder beklede kamer, breng het op kamertemperatuur voordat u de Drosophila dissectie.
2. Stel de scanparameters voor de confocale microscoop om ervoor te zorgen dat het monster onmiddellijk hieronder worden afgebeeld na voltooiing van de dissectie en montage.
3. Plaats een ontleed en geplaagd ovarium (na stap 2 en gekleurd, eventueel na stap 5) op vetgedrukte polyL-lysine-gecoate gebied en spreid het ovarium van de plagen naald om de ovarioles scheiden. Plaats een 10-ul druppel insect dissectie medium op de top van de eierstok, en zorg ervoor dat t dekkenHij gehele polyL-lysine-gecoate gebied. Dek de petrischaal.
4. Onmiddellijk uitvoeren confocale microscopie van de gemonteerde monster bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Slechts één Drosophila worden ontleed, verwerkt en afgebeeld op een moment. Ook moet microscopie niet worden uitgevoerd bij 37 ° C, die een hitteschok omgeving voor Drosophila weefsel nabootsen.

4. Fluorescentie Verlies In Fotobleken (FLIP) Assay te beoordelen mitochondriaal Matrix Continuity

OPMERKING: Mitochondriale matrix continuïteit van een gefuseerde mitochondriale structuur komt tot stand nadat de volledige versmelting van de mitochondriale binnenste en buitenste membranen na een voortgang door de tussenstappen. Deling van mitochondrien kunnen dezelfde stappen in omgekeerde richting (figuur 3A). FLIP is een time-lapse microscopie semikwantitatieve methode die kan worden gebruikt om de mitochondriale matrix continuïteit in het beoordelenuiteindelijke gesmolten toestand van de ex vivo mitochondria (stap 3 en 4 in figuur 3A) in levende Drosophila eierstokken ^9. De FLIP test wordt uitgevoerd als een klein gebied van belang (ROI) van de mitochondriën expressie brengen van een fluorescerend molecuul in de mitochondriale matrix die photobleached regelmatig (FLIP ROI in figuur 3A). Hierdoor zullen alle omringende mitochondriale regio die doorloopt in de FLIP ROI (experimentele ROI in figuur 3A) signaal verliezen als gevolg van de uitwisseling van moleculen in de continue mitochondriale matrix. De FLIP experimenten hier gedemonstreerd worden uitgevoerd op transgene Drosophila uitdrukken mitoYFP, die het mitochondriale targeting-sequentie van het menselijk cytochroom oxidase VIII subunit gelabeld met YFP bevat om het te richten op de mitochondriale matrix in een vrij diffundeerbare vorm. Een soortgelijk experiment kan worden uitgevoerd met mito pUASP-mito-GFP-transgen, zoals eerder gemeld ^{9. Een soortgelijk FLIP protocol kan worden gebruikt met een probe gericht op het mitochondriale inter-membraan ruimte kunnen de continuïteit als gevolg van de fusie van de buitenste sporen, maar niet het binnenste mitochondriale membranen (stap 2 in figuur 3A).}

1. Open de afbeelding acquisitie software op de confocale microscoop en stel de juiste scanparameters in het tabblad "Acquisition" (tabel 1). Controleer de "Time series", "Bleaching" en "regio" dozen om de individuele tabs te openen. Zorgen dat de verwerving parameterwaarden in elke lip (tabel 1).
   OPMERKING: De pinhole moet worden gelaten, aangezien dit experiment is ontworpen om de algemene signaal van de gehele mitochondriale populatie in afzonderlijke vakken volgen.
2. Gebruik het oculair op het gebied van belang snel te vinden in de gemonteerde levend weefsel.
   OPMERKING: Selecteer de ovarioles die goed verspreid over de glas-bottomed schotel Aangezien confocale microscopie kan niet worden uitgevoerd op drijvende ovarioles.
3. Klik op "live" naar een live-beeld van het geselecteerde gebied van belang te verwerven. Klik op "stop" om live het scannen te stoppen.
4. Indien nodig de verwervingsparameters zodanig dat het gedetecteerde fluorescentiesignaal onder het verzadigingsniveau (aangegeven door de afwezigheid van rode pixels wanneer de optie "bereik indicator" is aangevinkt), de gedefinieerde achtergrond als ingesteld door instellen van de correctiewaarden.
5. Teken een kleine ROI met behulp van de Bezier tekengereedschap uit het tabblad "Regio's" aan de fotobleken zone over de ervaringen van live-scanning afbeelding af te bakenen.
   OPMERKING: De grootte van de ROI moet ongeveer 20 zijn - 50% van de totale fluorescerende mitochondriale signaal binnen de cel.
6. Voer de afbeelding overname door te klikken op "start experiment."
7. Kwantificeren van de fluorescentie-intensiteit met behulp van de eigen of de open-source software (zie MaterialsTabel). Neem het gemiddelde signaal van de ROI waar de repetitieve bleking wordt gericht (FLIP); de ROI, waar bleken niet is uitgevoerd in dezelfde cel (experimenteel); de ROI van een andere ongebleekte cel in hetzelfde gezichtsveld, ter beoordeling totale bleken tijdens de experimentele periode (bleken); en het ROI op het achtergrondgebied (achtergrond). Trek de gemiddelde achtergrondsignaal verkregen uit het gemiddelde signaal in de andere ROI. Normaliseren het fluorescentiesignaal met de eerste pre-bleach signaal voor de betreffende cel.
8. Plot de genormaliseerde data met behulp van een standaard plotten software.

5. live kleuring met fluorescerende mitochondriale kleurstoffen

OPMERKING: Steady-state mitochondriale structuur en potentieel kunnen beoordeeld worden met kleurstoffen die specifiek in mitochondria nemen in levende cellen en weefsels. Live Drosophila eierstokken kan worden gekleurd ex vivo met fluorescerende mitochondrialevlekken op de mitochondria visualiseren, om mitochondriale reactive oxygen species beoordelen (Mito-ROS) productie, en mitochondriale potentiële per massa-eenheid te bepalen. Dit kan worden bewerkstelligd door co-kleuring met het mitochondriale potentiometrische kleurstof tetramethylrhodamine ethylester (TMRE) en een compatibele levende mitochondriale vlek die de mitochondriale massa (zie Materialen voor de specifieke kleurstoffen).

1. Verdun de voorraad van de vlekken in warm insect ontleden medium tot de uiteindelijke werkende concentraties: mitochondriale vlek, 250 nm; TMRE, 50 nm; en Mito-ROS vlek, 5 uM.
2. Na dissectie en plagen de eierstokken volgende stap 2, zet de eierstokken in 200 pi van een bepaalde kleuring oplossing in een putje van een dissectie schotel. Incubeer ze gedurende 10 min met de schotel onder een geschikte doos omwikkeld met aluminiumfolie om deze te beschermen tegen licht. Was de eierstokken gekleurd door ze voorzichtig te bewegen met een pincet in 3 opeenvolgende putten met dag medium zonder vlek.
3. Voor co-kleuring met TMRE en de compatibele totale mitochondriale vlek, volgt u de bovenstaande protocol om eerst met TMRE en direct daarna vlekken met de algemene mitochondriale vlek (zonder wasstappen daartussen).
4. Monteer de eierstokken op een polyL-lysine beklede glazen bodem schotel volgende stap 3 en voor te bereiden op confocale microscopie met de juiste scanparameters (tabel 1), naar aanleiding van de stappen 4,2-4,4.
   LET OP: Het signaal van de opgenomen kleurstoffen duurde niet bij een poging om de gekleurde monsters in montage medium te monteren.
5. Controleer de-Z snijden in om het tabblad te openen. Draai de focus wiel naar de onderkant van het monster terwijl het wordt live gescand en klik op "eerst" naar de onderste Z-sectie te definiëren. Doe hetzelfde tijdens het verplaatsen van het brandpunt wiel naar de andere richting naar het bovenste gedeelte definiëren.
6. Voer de afbeelding overname door te klikken op "start experiment."
7. Kwantificeren-achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van de ROI voor de achtergrond signaal en de afzonderlijke cellen (zoals in stap 4.7) en plot van de gegevens met behulp van een plotten software.

6. Genereren van Drp1 Null Mozaïeken

OPMERKING: De klonale strategie hier gebruikt introduceert green fluorescent protein (GFP) -negatieve Drp1 null klonen in de achtergrond van een GFP-positieve, fenotypisch wildtype achtergrond die genotypisch heterozygoot voor de Drp1 nulmutatie ^9. Heat-shock-geïnduceerde flippase-flippase herkenning target (FLP-FRT) gemedieerde site-specific mitotische recombinatie creëert homozygote klonen van de functioneel null drpKG03815 allel. Het genotype van Drosophila het dragen van de Drp1 mutant is drpKG03815 FRT40A / CYO, terwijl de genotype dragen van de heat shock-geïnduceerde FLP (hsFLP) en UbiGFP klonale marker is hsflp; ubiquitine NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / Cyo. Het genotype van de SEteerd nageslacht van de kruising tussen de bovengenoemde genotypen is hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Synchroniseer de Drosophila voor Virgin verzamelen door ze in nieuwe flesjes van vers voedsel elke 2 tot 3 dagen. Bewaken van de pupariating flacons dagelijks in om de opkomende maagdelijke vrouwtjes verzamelen.
2. Verzamel rode ogen, krullend-wing maagdelijke vrouwtjes uit de Drp1 mutant genotype elke dag, een keer in de ochtend en een keer in de avond, en plaats ze in een apart flesje. Daarnaast verzamelen mannelijke Drosophila met donker rode ogen en rechte vleugels dragen hsflp en UbiGFP binnen 5 dagen na verpopping.
3. Het opzetten van een kruis door het toevoegen van de mannetjes aan de Maagd vrouwtjes met een vrouwelijke: mannelijk verhouding van 2: 1.
4. Strooi een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist eiproductie stimuleren.
   OPMERKING: beweeg voorzichtig Drosophila een nieuwe flacon medium elke 2 tot 3 dagen om de hoeveelheid nakomelingen vergroten en flesje verdringing te verminderen.
5. Eenesthetize, sorteren, en het verzamelen van straight-winged, red-eyed vrouwelijke nakomelingen binnen 5 dagen na verpopping.
6. Voor de heat shock, plaatst de verzamelde Drosophila in lege flesjes met een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist en een kleine, zachte doek (om het vocht absorberen tijdens de heat shock). Plaats het flesje met de Drosophila in een waterbad bij 38 * C gedurende 1 uur, hoofdzakelijk follikel celklonen genereren, en bij 37 ° C gedurende 1 uur tweemaal per dag (waarbij ten minste 5 uur tussen de 2 warmte schokken) gedurende 2 opeenvolgende dagen , zowel kiemlijn en follikel celklonen genereren.
   LET OP: Zorg ervoor dat de flacon volledig wordt ondergedompeld in het water tot aan het niveau van de plug.
7. De heat shock kan de Drosophila immobiel te maken. Laat de warmte geschokt Drosophila te herstellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wanneer ze weer mobiel te worden.
8. Voeg de mannetjes terug naar de vrouwtjes in dezelfde verhouding als in het kruis, en verplaats ze naar verse flesjes met medium bestrooid met een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist. Handhaaf de Drosophila gedurende ten minste 5 dagen.
9. Ontleden de eierstokken als nodig is voor een live of vaste experiment.
   OPMERKING: Eierstokken geïsoleerd van de ouderlijke Drosophila expressie UbiGFP worden als negatieve controles om de efficiënte inductie van GFP-negatieve klonen door hitteschok bevestigen.

7. Co-immunokleuring voor Cycline E en Mitochondriën

LET OP: om te detecteren Drosophila Cycline E (dCyclinE), hebben we een commercieel verkrijgbaar antilichaam opgewekt specifiek tegen dCyclinE ⁹ gebruikt (zie Materials tabel). Als mitochondriale marker, gebruikten we een antilichaam tegen ATP-B (a subeenheid van het mitochondriale ATP synthase complex) ^9.

1. Warm 4% paraformaldehyde (PFA) op kamertemperatuur, 25 ° C. Voorzichtigheid! Paraformaldehyde is giftig.
   LET OP: Na het openende ampul moet PFA worden bewaard bij 4 ° C en binnen 7 dagen. Dit komt omdat de opslag van PFA oxidatie tot methanol, die dramatisch membranen zou veranderen tijdens fixatie kan toestaan, zelfs indien aanwezig in zeer kleine hoeveelheden.
2. Onmiddellijk na de dissectie, bevestig de eierstokken ontleed door ze in 200 pl vers PFA in een putje van een glazen ontleden schaal (zonder plagen). Houd het gerecht in een zuurkast voor 15 min. Was de vaste eierstokken door ze voorzichtig bewegen met de tang in 3 opeenvolgende putjes, elk 200 ui 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
   LET OP: Het experiment kan hier worden gestopt en de monsters kunnen bij 4 ºC worden gelaten voor 1 dag.
3. Plagen de eierstokken grondiger in PBS (vergelijkbaar met stap 2.6) naar verwijder voorzichtig de beschermende vezelachtige omhulsel dat antigeen toegang van het antilichaam kan belemmeren.
4. Permeabilize de eierstokken geplaagd door ze in een microfugebuis met 500 pi vers gemaakte 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) en incubeer gedurende 30 minuten onder schommelen bij 25 rpm.
   LET OP: Tijdens het schommelen, plaatst de buizen parallel aan de schommelbeweging; ze te plaatsen loodrecht kunnen toestaan ​​dat het weefsel te houden aan de kap van de buizen, hetgeen resulteert in weefsel verlies.
5. De PBS-TX verwijderen, plaatst de microfuge buizen in een rek om het weefsel te vestigen op de bodem van de buizen. Inspecteer ze visueel en tik op de buizen, indien nodig, een drijvend weefsels naar beneden te brengen. Zuig de oplossing voorzichtig uit de bovenkant en zorg ervoor dat het weefsel aan de onderkant van de pijpen ongestoord blijft.
6. Blokkeer de eierstokken door toevoeging van 200 gl 2% runderserumalbumine (BSA), opgelost in 0,5% PBS-TX en incubeer het op de rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder de blokkerende middel door stap 7.5.
7. Voeg primaire antilichamen in 200 pl vers blokkeermiddel: anti-konijn dCyclinE antilichaam (1: 100) en anti-muis antilichaam ATP-B(1: 100). Incubeer de weefsels op wip voor 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
8. Was de eierstokken met PBS-TX 3 keer voor 15 minuten elk, volgende stap 7.5.
9. Voeg 200 ul van de geschikte secundaire antilichamen in verse PBS-TX: anti-muis-CY3 (1: 1000) en anti-konijnen-CY5 (1: 500). Incubeer op wip voor 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
10. Was de eierstokken met PBS-TX 3 keer voor 15 minuten elk, volgende stap 7.5.
11. Om het DNA te kleuren, voeg Hoechst (1: 1000 verdunning) de laatste PBS-wassing TX.
12. Tenslotte laat het weefsel in 500 pi 1X PBS.
13. Met behulp van een 1 ml micropipet, verwijder de immuun-eierstokken van de microfugebuis in een frisse putje van een glazen dissectie schotel met 200 pi PBS.
14. Één druppel glycerol-based fixeermiddel een glasplaatje en voeg de immunogekleurde eierstokken een voor een naar het fixeermiddel.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de eierstokken inderdaad worden overgedragen aan de montage medium. Niet om s te doeno zal leiden tot verlies van weefsel.
15. Kijk door de dissectie microscoop, voorzichtig plukken de transparante ovarioles (jongere stadia) van de ondoorzichtige rijpe eicel kamers met behulp van de plagen naald terwijl de ondoorzichtige deel van de eierstok met de tang. Verwijder de rijpe eicel kamers van de montage medium.
16. Plaats een dekglaasje (22 mm, nr 1) op de glijbaan en druk licht om ervoor te zorgen dat de montage medium uniform daaronder wordt verspreid.
    LET OP: Door op de dekglaasje zorgt ook voor een goede afstemming van het weefsel langs de dekglaasje. Als u dit niet optimaal te doen kunnen toestaan ​​dat de kleinere podia te zweven in de montage medium, waardoor een optimale microscopie van deze weefsels.
17. Air-droog de monsters gedurende 15 minuten en sluit de randen van het dekglaasje voorzichtig met nagellak.
18. Voeren confocale microscopie per experimentele behoefte (tabel 1).

Resultaten

De beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om de mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila eierstokken (Figuur 2B). Verschaft zijn enkele voorbeelden van verwachte resultaten verkregen met de beschreven werkwijzen.

Dissectie van de Drosophila eierstok: Wanneer verder ontleed moeten de gescheiden buik (figuur 3B) vanaf het geh...

Discussie

Kritische stappen in het protocol

Photobleaching: Het voorkomen van onnodige fotobleken van TL-monsters absoluut noodzakelijk is om het uitvoeren van efficiënte confocale microscopie. Daarom moet de tijd gebruikt om monsters te lokaliseren door het oculair of beeldopname parameters via levende scanmodus worden geminimaliseerd om fotobleken te minimaliseren.

Weefselbeschadiging: Aangezien mitochondria worden beschouwd als de sensoren van ce...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute en verdeel in aliquoten
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute en verdeel in aliquoten
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute en verdeel in aliquoten
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging