High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Summary

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Abstract

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.

High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

Introduction

Leren is gebaseerd op de vorming van herinneringssporen en het onderhoud. Het is algemeen aanvaard dat een onderliggende mechanisme een activiteit-afhankelijke vorming van nieuwe en / of herschikking van bestaande synaptische contacten tussen neuronen kunnen vormen. Op moleculair niveau hebben verscheidene eiwitmodificaties, subcellulaire relocalizations en veranderingen in de omzet van synaptische eiwitten beschreven ^1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). De meeste studies tot nu toe gericht op specifieke eiwitten niet op het wereldwijde maar complexe synaptische proteoom samenstelling. De huidige aanpak maakt het mogelijk een onbevooroordeelde screening voor synaptische proteoom veranderingen in de hersenen van muizen regio's na een leerproces experiment. Het is geschikt om tijdpunt afhankelijke moleculaire snapshots van het leren geïnduceerde reorganisatie van de synaptische architectuur maken. De beschreven workflow vereist een bepaald samenspel van verschillende specialisten in het gedrag van dieren, eiwit biochemie, massaspectrometrie en biolnformatics.

De gekozen leerparadigma, namelijk frequentie gemoduleerde toon discriminatie (FMTD), is een goed gekarakteriseerde auditieve discriminatietaak bij knaagdieren ^5. Leren en lange termijn geheugenvorming in deze shuttle box Go / No-Go-taak behelst mechanismen afhankelijk van toegenomen corticale dopamine signalering en eiwitsynthese. Dienovereenkomstig proteomische recente studies over gerbils en muizen lieten dopamine en leren geïnduceerde herschikkingen van synaptische plastic componenten in corticale, maar ook in meer basale hersengebieden die zogenaamd interactie tijdens FMTD leren en geheugen ^6-8. Dit illustreert dat de vorming van het geheugen gaat om een ​​complex samenspel van de verschillende gebieden van de hersenen en dus kan verschillend worden geregeld binnen deze regio's op het proteoom niveau. Daarom is dissectie van geselecteerde corticale en subcorticale muizenhersenen regio's opgenomen in de workflow.

Bovendien betrouwbare characterizatiop zelfs zwakke veranderingen in synaptische eiwitsamenstelling vereist een verrijking van pre- en postsynaptische compartimenten in plaats van het analyseren van ruwe homogenaten of membraanfracties ^9. Daarom is de bereiding van synaptosomen gebruik vastgestelde protocollen vóór proteomische analyse beschreven om het detectieniveau en dynamisch bereik voor synaps-specifieke eiwitten ^10,11 toenemen.

Een essentiële voorwaarde voor het label-free high-resolutie massaspectrometrie te gebruiken voor de kwantitatieve doelen is een hoge mate van overeenstemming van eiwit monsters. Zoals eerder kleine veranderingen in synaptische eiwitsamenstelling naar verwachting zullen plaatsvinden na het leren, zal een label-free aanpak geschikt zijn om te vergelijken corresponderende eiwit verkregen uit opgeleid en naïeve muizen. Als alternatief, conditie-specifiek label strategieën van eiwitten / peptiden met behulp van stabiele isotopen (bijv TMT, iTRAQ, ICPL en SILAC) alsook MS2-based label gratis quantification (SWATH) zijn nuttig, maar ze zijn duurder dan de gekozen label-free aanpak of hebben speciale massaspectrometrie hardware.

Sinds proteomics screenings vaak op complexe datasets, is bioinformatic verwerking aanbevolen voor de juiste interpretatie van de gegevens. Extra meta-analyses kan een beter begrip van potentiële moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan-paradigma gerelateerde veranderingen en de identificatie van de betrokken belangrijke cellulaire processen en signaalwegen te ondersteunen. Geschikte methoden zijn ook hieronder beschreven.

Protocol

Alle procedures met inbegrip van dierlijke proefpersonen werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Duitse federale wet, de desbetreffende EU-regelgeving en de NIH richtlijnen, en zijn door de ethische commissie van de Landesverwaltungsamt Sachsen / Anhalt (42502-2-1102 IFN) goedgekeurd.

1. Auditieve Learning

1. Auditieve leren discriminatie in de shuttle box (FMTD paradigma) Opmerking: Draag altijd handschoenen tijdens de behandeling van de muizen.
   1. Huis C57Bl6 / J muizen in groepen van drie of vier met vrije toegang tot voedsel pellets en kraanwater in duidelijke polycarbonaat kooien. Zorg voor een 12 uur licht: donker cyclus in het dier faciliteit. Als dieren worden ontvangen van een ander laboratorium of van een bedrijf mogelijk te maken ten minste een week van acclimatisatie en afwikkeling in.
   2. Voer een shuttle box training per dag.
      1. Neem de muis uit zijn kooi in het dier faciliteit en plaats deze in een slecht verlichte shuttle doos in een geluidsdichte kamer.
      2. Gebruik een volledig computergestuurde leren schema voor auditieve leren discriminatie. Begin met een gewenningsperiode van 3 min van stilte, en start de training.
         1. Gebruik sequenties van de stijgende toon (4-8 kHz, CS +) als de Go-stimulus tijdens Go-trials: Het dier moet de hindernis binnen 6 sec toon presentatie steken (juiste antwoord, hit). Bestraffen een misser door een milde voet-schok van 50-300 uA, geleverd via de roostervloer van de shuttle box.
         2. Gebruik sequenties van de dalende toon (8-4 kHz, CS) als de No-Go-stimulus tijdens No-Go-trials: Het dier heeft tijdens de 6 sec toon presentatie in het huidige compartiment van de shuttle box te blijven. Straffen een vals alarm door een milde voet-schok van 50-300 uA, geleverd via de roostervloer van de shuttle box.
      3. Gebruik intertrial intervallen van 20 5 sec.
      4. Voer 30 Go-proeven en 30 No-Go-trials per sessie in een pseudo-willekeurige volgorde, zodat men sesie bestaat uit 60 proeven en duurt ongeveer 25 minuten.
   3. Zet de getrainde dier terug in zijn kooi in het dier faciliteit.
2. Brain dissectie
   1. Inslapen het dier op het gewenste tijdstip na een gewenst aantal trainingssessies middels cervicale dislocatie (bijvoorbeeld 24 uur na afloop van de eerste sessie). Onthoofden het dier.
   2. Snel ontleden de hersenen via de volgende stappen: Snijd eerst de huid en vervolgens de schedel met rechte schaar langs de Sutura sagittalis. Volledig verwijderen van de gedeelten van het bot dat het hersenweefsel omvatten het gebruik van sterke tang. Haal de hersenen met een lijmkam.
   3. Voor dissectie, plaatst de hersenen op een petrischaal gevuld met ijs. Ontleden de auditieve cortex, de frontale cortex, de striatum en hippocampus onder een stereomicroscoop met een scalpel en een naald.
      1. Lokaliseren van de auditieve cortex met behulp van visuele oriëntatiepunten op de hersenen sUrface zoals bloedvaten en de vorm van het oppervlak (Bregma -2,06 tot -3,4, maat rostrocaudale 2 mm, dorsoventral 1,3 mm) en bilateraal ontleden als rechthoekig weefselblok dikte van de cortex.
      2. Ontleden de frontale cortex als een brein slice tussen Bregma 3,56 en 1,54 met behulp van de chiasma Opticum als een mijlpaal en exclusief weefsel van bulbus olfactorius.
      3. Ontleden het striatum als een brein slice tussen Bregma 1,54 en 0,5 en zorgvuldig corticale weefsel te verwijderen.
      4. Ontleden de hippocampus bij de vaststelling van de hersenen met de naald door de kleine hersenen en het ontrollen van de cortex te beginnen bij de occipitale kwab.
   4. Shock-freeze ontleed hersenstalen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

2. Voorbereiding van Synaptosomen of alternatief kan een Postsynaptische-density (PSD) verrijkte Fraction

OPMERKING: Bij alle procedures Houd monsters en buffers bij 0-4 ° C.Buffers vers verdund proteaseremmer cocktail om proteolytische afbraak van eiwitten te voorkomen. Als eiwit fosforylering ook wordt bestudeerd, fosfatase inhibitor cocktails moeten worden toegevoegd. Alle G-waarden aangegeven zijn ter g (gemiddelde) gedurende de gehele protocol.

1. Bereiding van een ruwe membraanfractie (figuur 3A)
   1. Transfer ontleed hersenweefsel in een homogenisatie vat met 1 ml ijskoude buffer A (5 mM HEPES, 320 mM sucrose, pH 7,4) en gehomogeniseerd weefsel bij 900 tpm met 12 slagen.
   2. Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 10 min. Houd de supernatanten.
   3. Opnieuw homogeniseren pellets bij dezelfde omstandigheden hetzelfde volume homogenisering buffer vóór en centrifugeer monsters opnieuw bij 1000 xg gedurende 10 min. Combineer corresponderende supernatanten. Gooi de pellets P1, die voornamelijk bevatten kernen en celresten.
   4. Draai de gecombineerde supernatanten gedurende 20 min bij 12.000 x g. teruggooi Supernatants of het gebruik voor verdere fractionering ^11.
   5. Resuspendeer pellets in hetzelfde volume homogenisering buffer alvorens de homogenisator met 6 slagen bij 900 tpm en centrifugeren bij 12.000 xg gedurende 20 min. Discard supernatanten. De pellets P2 vertegenwoordigen de ruwe membraan fracties.
2. Zuivering van synaptosomen uit ruw hersenvlies fracties (Figuur 3A)
   LET OP: Ruwe hersenen membraan fracties kan worden gescheiden in myeline, licht membranen, synaptosomen en mitochondriën met behulp van sucrose dichtheid stap gradiënt ultracentrifugatie. Hiervoor 5 mM Tris / HCl pH 8,1 buffer bevattende sucrose op ofwel 0,32 M, 1,0 M of 1,2 M concentratie vereist.
   1. Tijdens het uitvoeren van centrifugatie om de P2 fracties produceren, bereiden sucrose gradiënten stap in de ultracentrifuge buizen. Begin met 2,5 ml 1,0 M sucrose buffer en onderlaag met 1,5 ml 1,2 M sucrose buffer met een glazen Pasteur pipet.
   2. Re-homogeniseren P2 fractiesin 0,5 ml 0,32 M sucrose buffer handmatig met 6 slagen en belasting bovenop de gradiënt.
   3. Spin bij 85.000 g gedurende 2 uur in een ultracentrifuge met behulp van een swingende emmer rotor.
   4. Gooi boven 0,32 M sucrose laag die het materiaal bij het grensvlak met de 1,0 M sucrose buffer (myeline, lichte membranen). Verzamel synaptosomen in de 1,0 / 1,2 M sucrose buffer interface. De pellet op de bodem van de buis bevat mitochondria.
   5. Voeg 0,32 M sucrose buffer om de synaptosomale fractie in 1: 1 verhouding, meng goed en centrifugeren bij 150.000 xg gedurende 1 uur. Synaptosomen in de korrel en kan nu worden geresuspendeerd in een buffer nodig is voor verdere verwerking.
3. Bereiding van een PSD-verrijkte fractie (Figuur 3B)
   1. Homogeniseer elk specifiek hersengebied van een enkel dier in 100 pl extractiebuffer (5 mM Tris / HCl pH 8,1, 0,5% Triton X-100) in een 200 ui ultracentrifuge buis met een PTFE (polytetrafluorethyleen) stamperbij 2000 rpm met 12 slagen.
   2. Voeg 100 pl extractiebuffer, meng en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C. Spin down bij 100.000 xg gedurende 1 uur en het verzamelen van de supernatant S1 voorzichtig met een 200 ul pipet.
   3. Opnieuw homogeniseren pellet P1 in dezelfde buis met 100 ui extractiebuffer opnieuw met een PTFE stamper bij 2000 rpm met 12 slagen.
   4. Voeg 100 gl extractiebuffer en meng met een pipet en centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 1 uur.
   5. Combineer de supernatant S2 S1 met de oplosbare eiwitfractie. Deze fractie bevat cytosolische eiwitten, 0,5% Triton X-100 oplosbare membraaneiwitten en extracellulaire matrix moleculen.
   6. Resuspendeer de resterende pellet in 50 ul 5 mM Tris / HCl pH 8,1. Deze fractie bevat PSD, detergent-resistente membranen, onoplosbare cytoskeletelementen, mitochondria en celresten waaronder kernen. Het is verrijkt in PSD's die de kern van postsynaptische structuren vormen ook belangrijke delen van de presynaptischecytomatrix bij de actieve zone. De factor voor de verrijking van de PSD is rond 4 en de verrijking van PSD componenten is eerder aangetoond. ¹²

3. Monstervoorbereiding voor Massaspectrometrie

1. Lysis en monster normalisatie
   LET OP: Sample normalisatie met betrekking tot het eiwit concentratie is een zeer cruciale stap om eindelijk te komen tot een betrouwbare kwantitatieve gegevens, zelfs voor zwakke synaptische veranderingen eiwitexpressie.
   1. Ontbinden synaptosomen of PSD-verrijkte preparaten van elk hersengebied van een dier in 20-50 pl (afhankelijk van de totale hoeveelheid materiaal: voor auditieve cortex met 5-15 mg weefsel gebruik 20 pl) van 8 M ureum en incubeer op ijs gedurende 1 uur in een ultrasoon bad.
      1. Voor de in-gel te verteren, te ontbinden synaptosomen direct in het SDS-monsterbuffer. berekenen de geladen hoeveelheid zorgvuldig om overbelasting van de gel te voorkomen. Dat in dit geval, de hoge overvloedige schavot Proteins verloren tijdens de gelelektroforese en in-gel verteren.
   2. Verdun met 1% van een verwijderbare detergens tot een eindconcentratie van 2 M ureum waarborgen. Vermijd temperaturen boven 30 ° C om eiwit carbamylering voorkomen.
   3. Uitvoeren SDS-PAGE met een hoeveelheid (bijvoorbeeld 10 pi) van het monster volgens standaardprocedures ^13,14.
   4. Vlekken op de gel met Coomassie Blue volgens het protocol van de fabrikant. De werkwijze combineert de vaststelling en kleuring stap met methanol en azijnzuur.
   5. De extinctie van elk monster voor de gehele baan met een gekalibreerde scanner gel in transmissiemodus en bereken de relatieve hoeveelheid eiwit.
   6. Normaliseren van de monsters volgens de berekeningen.
   7. Splits elk monster in twee verschillende delen. Gebruik een derde van de in-gel verteren en tweederde van de in-oplossing digest.
2. In-gel verteren
   1. Gel scheiding
      1. Voer een tweede SDS-PAGE onder toepassing van de concentratie aangepaste monsters. Vlekken en kwantificeren van de gels voor een tweede keer naar de normalisering kwaliteit te controleren.
      2. Knip elke baan van een monster in de gel in verschillende gebieden (8 / laan) maar exclusief het molecuulgewicht bereik boven 170 kDa. Breng de gel stukken in afzonderlijke buizen.
      3. Snijd de gebieden in kleinere stukken (ong. 1 x 1 mm) met een scherp scalpel in-gel spijsvertering werkzaamheid te vergemakkelijken.
   2. Digest ¹⁵
      1. Was de gelstukken meermaals (afhankelijk kleurintensiteit) gedurende 10 min bij 50-150 ul van een buffer die bestond uit 50% acetonitril (ACN) en 50 mM ammoniumbicarbonaat (NH ₄ HCO _3).
      2. Verwijder supernatanten. Bedek de gelstukken met ACN en incubeer bij 20 ° C tot gelstukken worden wit en krimpen.
      3. Verwijder de ACN en hydrateren de gel stukken voor 5min met 50 pi 0,1 M NH ₄ HCO _3. Voeg dezelfde hoeveelheid ACN en incubeer gedurende verdere 15 minuten bij 37 ° C.
      4. Verwijder en volledig gooi vloeistof. Droog de gelstukken in een vacuüm centrifuge.
      5. Rehydrateren gelstukken in 50 pl NH ₄ HCO ₃ met 10 mM dithiothreitol (DTT) en verwarm monsters gedurende 45 minuten bij 56 ° C aan cysteïneresiduen verminderen.
      6. Verwijder supernatant en voeg 50 ul NH ₄ HCO ₃ met 55 mM joodacetamide (IAA) gedurende 30 minuten in het donker verminderde cysteines carbamidomethylate.
      7. Verwijdert en weggooit alle vloeistof boven de gel stukken en was ze tweemaal met 50 gl NH ₄ HCO ₃ en ACN (1: 1) gedurende 10 min om resten te verwijderen IAA. Droge monsters in een vacuüm centrifuge.
      8. Beperkte eiwitvertering voeg 25 mM NH ₄ HCO ₃ met 12,5 ng / ul trypsine. Het benodigde volume hangt af van de grootte en hoeveelheid van de gel pieces. Incubeer gedurende een paar minuten en controleer of de buffer wordt geabsorbeerd. Voeg meer buffer indien nodig, gel stukken volledig moeten worden gedekt. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht (min. 12 uur).
   3. peptide-extractie
      1. Overlay gel stukken met 10-20 pl 25 mM NH ₄ HCO ₃ en voeg dezelfde hoeveelheid ACN. Incubeer gedurende 10 min op ijs met behulp van ultrasoon bad. Daarna en vang supernatanten die de meeste van de gegenereerde peptiden bevatten.
      2. Voeg 100 gl extractiebuffer bevattende 30% ACN / 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) om de gel stukken. Herhaal incubatie in een ultrasoon bad en zorgvuldig verzamelen deze supernatant.
      3. Herhaal de laatste extractie stappen verhogen de ACN concentratie 50%. Na 10 min van ultrasoon bad spin down en verzamel supernatanten.
      4. Combineer alle drie de corresponderende supernatanten van de winning stappen en droog ze in een vacuüm centrifuge. Let daar opals gevolg van de scheiding van de gel 8 gebieden per rijstrook / proefmodel worden opnieuw gecombineerd om een ​​monster in deze stap.
3. In-oplossing verteren
   1. Verteren
      1. Met de berekende hoeveelheid (bijvoorbeeld 100 ul van een 150 ul lysaat, afhankelijk van de hoeveelheid materiaal en het gebruikte volume te resuspenderen van een monster uit een bepaald hersengebied) van genormeerde bemonsteringen voldoende uitgangsmateriaal verkregen gedurende ten minste drie technische replicaten om het uitvoeren van label-free massaspectrometrie.
      2. Voeg 2 mM DTT in 25 mM NH ₄ HCO ₃ en voorzichtig vortex het monster. Verminder de monsters gedurende 45 min bij 20 ° C.
      3. Voeg 10 mM IAA de cysteïneresiduen carbamidomethylate. Meng en incubeer 30 minuten in het donker bij 20 ° C.
      4. Tenslotte voeg 1 pl trypsine voorraadoplossing (1 ug / ul trypsine in 25 mM azijnzuur) en incubeer bij 20 ° C gedurende 12 uur.
   2. Vaste-fase-extractie (SPE) -zuivering
      1. Het zuur splitsbare detergens verwijderen, afstellen monsters worden tot een eindconcentratie van 1% TFA en incubeer gedurende 1 uur bij 20 ° C.
      2. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min en zorgvuldig verzamelen supernatanten.
      3. Plaats de kolom SPE in een rek en equilibreren de matrix met 2 ml methanol. Was tweemaal met 2 ml 0,1% TFA in water (buffer B).
      4. Voeg 2 ml buffer B en plaats het monster. Was nog drie keer.
      5. Elueer de peptiden door toevoeging van 200 ul 70% ACN / 0,1% TFA. Herhaal deze stap.
      6. Pool zowel eluaten en droog ze in een vacuüm centrifuge.
4. Fosfo-peptide-verrijking door TiO ₂ chromatografie ¹⁶
   1. Ontbinden peptiden geproduceerd door in-gel of oplossing verteren in 150 ui 80% ACN / 2,5% TFA (buffer C) en equilibreren ~ 2 mg van het TiO ₂ parels in 50pl buffer C.
   2. beads toevoegen aan het monster en incubeer in een roterende inrichting voor 1 uur bij 20 ° C. Daarna draai kralen naar beneden (16.000 xg, 1 min) en het verzamelen van supernatanten.
   3. Was de parels driemaal met 100 ui buffer C door voorzichtig mengen en centrifugeren komen na 5 min. Verzamel supernatanten. Herhaal deze stap driemaal met 100 ul 80% ACN / 0,1% TFA, gevolgd door driemaal wassen met 100 pi 0,1% TFA (zonder ACN), respectievelijk.
   4. Combineer alle tien supernatanten, drogen in een vacuüm centrifuge en behandelen hen als de fosfo-peptide-verarmde fractie voor verdere zuivering volgens stap 3,5.
   5. Elueer de gebonden fosfo-peptiden met 20 pl 400 mM _NH4OH / 30% ACN van de bolletjes. Herhaal deze stap drie keer en het verzamelen van alle bovenstaande vloeistoffen na stoppen met draaien de kralen.
   6. Combineer de eluaten van de in-gel verteren en de in-digest oplossing van een monster en behandelen hen als de fosfo-peptide-verrijkte fractie. Droog ze in een vacuüm centrifuge tot een eindvolume van 4-8 pl.
5. Concentreren en ontzouten van fosfo-peptide verarmde fracties door micro-SPE
   1. Los de droge peptiden in 20 pi 0,1% TFA.
   2. Evenwicht van de vaste C ₁₈ -matrix door het tekenen van 20 ui ACN in de tip. Was de matrix door trekken 0,1% TFA in water in de tip. Herhaal dit proces drie keer.
   3. Langzaam laden aangezuurd monster in de punt (herhaal deze stap drie keer).
   4. Was de C ₁₈ -matrix driemaal met 20 ul 0,1% TFA in water en gooi de wasoplossing.
   5. Elueer peptiden uit de pipetpunt door herhaaldelijk (3 keer) tekenen 20 ul van 70% ACN / 0,1% TFA en het verzamelen van deze elutie oplossing in een afzonderlijke buis.
   6. Combineer de eluaten van een monster en drogen in een vacuüm centrifuge.

4. Proteome Analyse

OPMERKING: Proteoomonderzoek wordt uitgevoerd op een hybride dual-druk lineaire ion trap / orbitrap massaspectrometer uitgerust met een ultra HPLC. De HPLC bestaat uit een gekoelde autosampler met 20 pl injectielus, een binaire laadpomp (pl debietbereik), een binaire nano stroomscheiding pomp, een kolomverwarmer met twee micro omschakelventiel en een ontgasser. De monsters worden eerst onderworpen aan een trapping-kolom (bijvoorbeeld 100 um x 2 cm) met een stroomsnelheid van 7 pl / min, gevolgd door scheiding op een kolom (bijvoorbeeld 75 urn x 25 cm) bij 250 nl / min. De uitlaat scheidingskolom is rechtstreeks gekoppeld met een emitter bedekte Pico uiteinde gelegen in een nano-nevel-interface op de massaspectrometer ionisatiebron.

1. Nano-vloeistofchromatografie en tandem massaspectrometrie
   1. Oplossen peptide monsters in 12 gl 2% ACN / 0,1% TFA gedurende ten minste 30 min. Spin down voor 15 sec en de overdracht van 11 ul supernatans aan flesjes (conisch, verminderd diamete autosamplerr).
   2. Het opzetten van een automatische regeling voor aanbrengen van het monster, chromatografische scheiding en tandem massaspectrometrie op het beheersen van software (bijv Xcalibur) als volgt.
      1. Gebruik het volgende voor Temperatuur: Autosampler: 5 ° C; Column oven: 45 ° C.
      2. Gebruik de volgende voor injectie: Volume: 10 pl; Stroomsnelheid: 7 pl / min (2% ACN, 0,1% TFA); Tijd: 8 min; Valve instelling: trap column - afval; mass spec overname: off.
      3. Gebruik het volgende voor Scheiding: debiet: 250 nl / min Valve instelling: val kolom-scheiding kolom; mass spec overname: op.
         0 min - 100 min: 2% ACN, 0,1% mierenzuur - 40% ACN, 0,1% mierenzuur
         100 min - 105 min: 40% ACN, 0,1% mierenzuur - 95% ACN, 0,1% mierenzuur
         105 min - 109 min: 95% ACN, 0,1% mierenzuur
         109 min - 120 min: 2% ACN, 0,1% mierenzuur
      4. Gebruik het volgende voor massaspectrometrie instellingen: Volledige MS: FTMS; resolutie 60.000; m / z range 400 - 2000; MEVROUW/MS: Linear Iontrap; minimum signaal drempel 500; isolatie breedte 2 Da; dynamische uitsluiting tijdsinstelling 30 sec; enkelvoudig geladen ionen worden uitgesloten van selectie; genormaliseerd botsingsenergie wordt ingesteld op 35% en activeringstijd tot 10 msec.
         LET OP: Een volledige MS-scan wordt gevolgd door maximaal 15 LTQ MS / MS runs met botsingsgeïnduceerde-dissociatie (CID) van de meest overvloedig gedetecteerd peptide-ionen.
   3. Run drie technische replica voor alle monsters.
2. Eiwit identificatie en label gratis kwantificering
   1. Proces massaspectrometrische ruwe data in de richting van eiwit identificatie en label-free kwantificering met behulp van een commerciële software suite (bv, pieken Studio). In tegenstelling tot de meeste andere proteoom softwarepakketten gebruikt deze specifieke software een de novo -sequencing algoritme vóór eiwitdatabase uitlijningen. Toch kan deze stap gemakkelijk vervangen worden door andere populaire software pakketten.
   2. gebruik esstiële instellingen in tabel 2 vermeld.
3. Fosfo-proteomics
   OPMERKING: Efficiënte en betrouwbare fosfo-peptide overname vereist een paar essentiële veranderingen in de proteomics workflow setup.
   1. Na fosfo-peptide verrijking, nooit droog samples helemaal. Altijd monsters opgelost.
      LET OP: De fosfo-ester binding van gefosforyleerd threonines of serines is zeer broos. Tijdens botsing geïnduceerde fragmentatie in de ionenvangeenheid resulteert in een neutrale verlies van fosfaat. Dit voorkomt verdere fragmentatie van de peptide, wat weer nodig is voor identificatie. Toegestane wideband-activering in de massaspectrometrie opstelling laat de versnippering van fosfo-peptiden zelfs na een neutrale verlies van de fosfaatgroep. Het voert een tijdbesparende "pseudo-MS ^3". Fosfo-ter bepaling in MS / MS-gegevens vereist een bepaalde controle- en evaluatie en kan worden uitgevoerd door fosforen 3.0.

5. Bioinformatics - Meta-Analysis

OPMERKING: Voor het uitvoeren van functionele annotatie en netwerkanalyse, het eiwit lijsten moeten worden voorbewerkt. samenvoegen eerst de lijsten van gereguleerde eiwitten en fosfo-peptiden voor elk hersengebied afzonderlijk. Verwijder vervolgens alle dubbele UniProt-ID's voor elke fractie tot verkeerde interpretaties te voorkomen.

1. Singular verrijking analyse met GeneCodis ¹⁷
   1. Open de web-based tool van GeneCodis (http://genecodis.cnb.csic.es)
   2. Selecteer "Mus musculus" als organisme en "GO Biologische Process" als annotatie.
   3. Plak een lijst van UniProt-ID's van een bepaalde fractie. Verzenden en wacht tot de analyse wordt uitgevoerd. Klik op "Singular Verrijking Analyse van GO Biologische Process" en bekijk de resultaten.
   4. Herhaal stap 5.1.3 voor de andere drie fracties.
   5. Om dubbel werk en kruispunten tussen het resultaat lijsten te zienGebruik een scripttaal zoals Perl of Python om de nodige gegevens te filteren. Soortgelijke instrumenten voor een bijzondere verrijking analyse DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) en Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) met de plugins BINGO (http://apps.cytoscape.org/ apps / bingo) en ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego).
2. Het genereren van een kracht gebaseerd grafiek van GeneCodis gegevens Gephi (https://gephi.org/)
   LET OP: De gegevens voor de grafieken moet worden verstrekt door de gebruiker, hetzij in een grafiek formaat (.gexf, .graphml, .dot, .gv, .gml) of ingevoerd met de hand.
   1. Het genereren van de grafiek knooppunten
      1. Met de hand: Open Gephi en klik op "Data Laboratory". Maak knooppunten. Klik op 'knooppunten' aan de linkerkant om te schakelen naar de "Nodes" tafel. Klik op "knooppunt toevoegen". Voer de naam van het woord. Klik op "OK" / Druk op Enter.
      2. Alternatief: Save GeneCodis leiden naar de PC. Open het .txt met een spreadsheet-programma. Verwijder alle rijen except uit "Item_Details" (term namen). Change header "Item_Details" naar "Label". Save Spreadsheet als ".csv". Nu in Gephi, klik op "Import Spreadsheet". Kies spreadsheet uit de bestandsbrowser van Gephi. Klik op "Next". Klik op "Finish".
   2. Aansluiten nodes via randen.
      1. Klik op "Edges" aan de linkerkant om te schakelen naar de "Edges" tafel. Voor elk knooppunt (Term): opzoeken namen gen in andere termen. Indien één of meer genen worden gedeeld -> create edge.
      2. Klik op "Rand toevoegen". Selecteer "ongericht". Selecteer de bron en het doel knooppunt uit de drop-down lijsten. Klik op "OK" / Druk op Enter. Als er meer dan één gen wordt gedeeld, voert overvloed in "Weight" (tabel).
   3. Force gebaseerde grafische lay-out.
      1. Open Graph data-bestand, zet de grafiek type "ongericht" of gebruik maken van de gegevens zoals ingevoerd door de hand, klik op "Overzicht" als deze niet al selected.
      2. Resize knooppunten afhankelijk van de overvloed aan interconnecties. Klik op Statistieken, run ofwel "Average Degree" (ongewogen randen) of "Gem. Gewogen Degree '(gewogen randen) onder" Network Overzicht ". In "Appearance", klik op "Nodes" en vervolgens op de knop Grootte, naast kies "Eigenschappen" en zet de attributen parameter op 'Gem. Gewogen Degree "of" Average Degree ". Klik op Toepassen.
      3. Tot slot: Selecteer "Force Atlas" in "Lay-out" en uit te voeren; veranderen "Repulsion kracht" als knooppunten botsen.
   4. Exporteren naar beeld.
      1. Screenshot-functie: Klik op "Overzicht", verandering grafiek lay-out, randdikte, labelgrootte en schalen met het menu aan de onderkant van het venster "Graph". Klik op de camera linker knop, en de foto op te slaan.
      2. Export functie van de "Preview": "Preview". Verander Presets naar "Default straight". Verander instellings afhankelijk van de gekozen voorkeuren en klik op "SVG / PDF / PNG" te exporteren.

Results

Figuur 1 geeft een overzicht van de complete workflow van kwantitatieve synaptische proteoom profilering van muizenhersenen regio's na auditieve leren discriminatie. Het begint met het dier training in een shuttle box. In het in figuur 2 bijvoorbeeld muizen begon aanzienlijke FM toon discriminatie in de ^4e trainingssessie tonen, die op efficiënte leren. Dieren worden opgeofferd op geselecteerde tijdstippen voor hersengebied dissectie. De vereiste verrijking van synapsen kan ofwel worden bereikt door het bereiden van synaptosomen of alternatief door de bereiding van een PSD-verrijkte fractie, beide in detail beschreven in figuur 3. De PSD-verrijking methode ontwikkeld voor lage hoeveelheden weefsel, bijvoorbeeld 1 - 2 plakjes van de hippocampus van rattenhersenen ^{12, 18.} Het vereist kleine buisjes, PTFE stampers passend bij deze buizen, en een laboratorium boren aandrijving voor het aandrijven van de stamper.

Vanwege de bijzondere eiwitsamenstelling van synaptosomen, is het sterk aan te bevelen de bereiding van de monsters uit te voeren in twee verschillende, maar complementaire manieren. Steigers van de PSD vaak zeer hoogmoleculaire eiwitten zich in hoge stoichiometrie. In-digest oplossing is de beste manier om deze efficiënt te extraheren, maar kan leiden tot een overbemonstering van de gegenereerde peptidemengsel. De in-gel oplossing wordt uitgevoerd van hetzelfde monster parallel kunnen deze eiwitten gewicht hoog molecuulgewicht sluiten verkrijgen en de analyse van eiwitten met medium en lager molecuulgewicht. Voor een uitgebreide analyse beide soorten proteolytische digesties worden aanbevolen.

De verschillende hoeveelheden weefsels van de onderzochte hersengebieden moeten worden bijgesteld het toegepaste materiaal voor betere vergelijking. Binnen de vier onderzochte hersengebieden auditieve cortex algemeen de beperkende omstandigheidof. Het materiaal van alle andere hersengebieden moeten zorgvuldig worden aangepast om de hoeveelheid van de auditieve cortex na bereiding van synaptosomen of PSD-verrijkte fracties (zie 3.1.1.). Typische gewicht van vers bereide hersengebieden van muizen zijn als volgt: auditieve cortex (AC): ~ 50 mg; hippocampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg en frontale cortex (FC): ~ 100 mg.

De PSD-werkwijze van verrijking in paragraaf 2.3 beschreven leidde tot de identificatie van ongeveer 1500 verschillende eiwitten en ongeveer 250 verschillende fosfo-peptiden per hersengebied op het niveau van afzonderlijke dieren (Tabel 1). Proteoomanalyse 24 uur na de eerste trainingssessie bleek dat 7,3% van de geïdentificeerde eiwitten en 5,8% van de fosfo-peptiden significante (p <0,05) kwantitatieve veranderingen in de synaptische expressie vergeleken met naïeve controles (tabel 1). Een opvallende tendens naar beneden Regulatie van synaptische steigers kunnen wijzen op een uitgesproken herschikking van de synaptische architectuur tijdens de vroege stadia van FMTD leren. De overgrote meerderheid van de gereguleerde eiwitten werden veranderd in een hersengebied-specifieke wijze, terwijl slechts 22% bleken te zijn geregeld in twee of meer hersengebieden. Zes geselecteerde voorbeelden worden getoond in figuur 4.

Meta-analyse van het complex resultaten door IPA levert het bewijs voor de specifieke deelname / manipulatie van de volgende canonieke trajecten: "-Clathrine endocytose Signaling", "Axonal Guidance Signaling", "Calcium Signaling", "RhoA Signalering", "Notch signalering "," Verbouwing van epitheliale Adherens Knooppunten "," Glutamaat Receptor Signaling "," GABA Receptor Signaling "," Dopamine Receptor Signaling "en" Synaptic langetermijnpotentiëring ".

Enkele verrijking analyse onthulde significant oververtegenwoordigd biologische processen in de frontale cortex betreffende eiwittransport, celadhesie, fosforylering, endocytose, vesikel-gemedieerd transport, ontwikkeling en voorhersenen axonogenesis (figuur 5). In de auditieve cortex biologische processen, waaronder ion transport, vertaling, mRNA transport, eiwit transport en het leren waren merkbaar. De analyse van de eiwitfractie van de hippocampus detecteert aanzienlijk verrijkt processen bij ionentransport, celcyclus, vertaling, fosforylatie en zenuwstelsel ontwikkelingssysteem. In het striatum, oververtegenwoordigd biologische processen, waaronder mRNA transport-blaasje gemedieerd transport, axonogenesis, proteolyse, eiwit transport en endocytose werden gevonden.

Figuur 1: Systematische Workflow van de methodologische benadering. Dit cijfer schematisch overzicht van de workflow van hoge resolutie kwantitatieve profilering van hersengebied specifieke synaptische eiwitsamenstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeeld van de prestaties van Muizen in de FM-Tone Discriminatie Task. Dieren tonen een toenemende mate van de hits (blauwe curve) en een afnemend aantal valse alarmen (zwarte curve) in de loop van de trainingen. Significante discriminatie plaatsvindt van de vierde sessie. Foutbalken worden als SEM. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.

Figuur 3: Bereiding van de Synaptosome en PSD-verrijkte fractie. A: voorbereiding Synaptosome. B: PSD-verrijkte fractie preparaat. Beide figuren verklaren de gedetailleerde workflow van de voorbereiding van synaptosomen of als alternatief PSD-verrijkte fracties uit de hersenen weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Geselecteerde Kwantitatieve Proteoom resultaten. De relatieve abundanties van synaptische geselecteerde eiwitten vergelijkingen tussen muizen trained de FMTD opdracht (AV, n = 6) en naïeve controlemuizen (NV, n = 6) 24 uur na de eerste trainingssessie. De overvloed waarden werden berekend als gemiddelde van de piekoppervlakken van de drie meest intense peptiden van een eiwit. Eiwitten met significante veranderingen overvloed (AV / NV, t-test) gemarkeerd binnen plaatsen: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005. Error bars worden geleverd als SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Visualisatie van biologische pathways voor de frontale cortex door GeneCodis / Gephi. Enige belangrijke voorwaarden van de Gene Ontology (GO) database (http://geneontology.org) met betrekking tot "Biologisch proces" met een minimum eiwit nummer drie Hier worden getoond. De knopen GO termen, de grootte van het knooppunt, de lijnbreedte en het aantal verbindingen van een bepaald knooppunt tonen het aantal eiwitten waarvoor deze term GO met andere knooppunten delen. Als gevolg van de "Force Atlas" methode Gephi, worden verwante knooppunten dicht bij elkaar clusteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

hersengebied	AC	FC	HEUP	000 "face =" Calibri "size =" 3 "> STR	Σ
geïdentificeerde eiwitten	1435	1758	1572	1507	6272
gereguleerde eiwitten (p <0,05)	59	130	162	108	face = "Calibri" size = "3"> 459
↑ AV / NV	8	4	76	35	123
↓ AV / NV	51	126	86	73	336
geïdentificeerd phosphomoti fs	197	361	273	278	1109
gereguleerde phosphomotifs (p <0,05)	8	22	21	14	65
↑ AV / NV	4	00000 "face =" Calibri "size =" 3 "> 17	5	9	35
↓ AV / NV	4	5	16	5	30

Tabel 1: Overzicht van een Proteomic Result. Deze tabel vat een representatief experiment proteomics getrainde muizen (AV, n = 6) 24 uur na de eerste training in vergelijking met hun naïeve controles (NV, n = 6). Desom van 459 gereguleerde eiwitten bevat overlappende regelgeving. 283 verschillende regelingen werden bepaald zoals hersenen specifiek. In detail zijn 57 proteïnen gereguleerd in twee hersengebieden werden 18 eiwit voorschriften gedetecteerd in drie hersengebieden slechts 2 proteïnen zijn gereguleerd in alle vier onderzochte hersengebieden.

foutenmarges
voorloper massa (Fourier transformatie massaspectrometrie)	10 ppm
fragment ion massa (lineaire ion trap)	0,6 Da
Maximum gemiste splitsingen per peptide	3
vaste modificaties
in-gel digestie samples	Carbamidomethylation van Cysteine
in oplossing gedigereerde monsters	Methylthiolation van Cysteine
variabele modificaties	Oxidatie van Methionine
	Deamidations van Asparagine en / of glutamine
Database	Uniprot / Sprot
taxonomie	muis
Statistische identificatie-acceptatie instellingen
de novo gemiddelde lokale vertrouwen (ALC)	> 50%
Peptide-valse ontdekking rate (FDR, op basis van est. Decoy-fusion)	<1%
Eiwit significantie (-10logP, op gemodificeerde T-test)	> 20
unieke peptiden / eiwitten	≥ 1
Kwantificering instellingen:
Peptiden gebruikt voor kwantificering indien:
Peptide betekenis (-10logP)	> 30
Peptidenidentificatie in	≥ 50% van de monsters
Peptide signaalkwaliteit	> 1
Peptide gemiddelde oppervlakte	> 1E5
Peptide retentietijd tolerantie	<5 min
Normalisatie	door de totale ionenstroom (TIC)

Tabel 2: Instellingen voor eiwit Identification (stap 4.2.2).

Discussion

De studie geeft een methodologisch workflow geoptimaliseerd voor een nauwkeurige kwantitatieve profilering van synaptische veranderingen eiwitexpressie tijdens het leren en geheugen consolidatie in verschillende hersengebieden van muizen. De opstelling biedt de mogelijkheid om de eiwitexpressie op het niveau van één dierstudie ondanks de vereiste toepassing van ten minste drie technische replicaten per monster voor massaspectrometrische analyse.

De methode houdt rekening met de bijzondere eiwitsamenstelling van de pre- en postsynapse bestaande uit hoogmoleculaire scaffold proteïnen moleculaire maar ook belangrijke mediator eiwitten lagermedium of lagere molecuulgewichten. De in-oplossing digesties van synaptosomale preparaten in een efficiënte productie en derhalve een oververtegenwoordiging van scaffold afgeleide peptiden. Dit op zijn beurt kan de analyse van kleinere of minder overvloedige eiwitten onderdrukken. De voorgestelde bereiding van SDS-PAGE fracties uit eenaliquot van elk monster gecombineerd met een in-gel digestie procedure parallel vergemakkelijkt de analyse van gemiddelde en lage abundantie proteïnen en vormt een sterk aanbevolen aanvullende methode. Na afzonderlijke massaspectrometrische toepassing van alle fracties verkregen uit een monster (bijvoorbeeld in oplossing verteren, in-gel verteren combinatie-fosfo verrijkte fracties) de overeenkomstige MS / MS datasets worden gecombineerd en verder berekend voor eiwit identificatie en kwantificering van PEAKS software of andere populaire software pakketten.

Als alternatief, de individuele toepassing van-in-gel-vergisting afgeleide fracties van een monster (apart verwerkte gel-gebieden van een monster laan) en de fracties gegenereerd van de in-oplossing ontsloten monster (bv door ionenuitwisselingschromatografie) naar massaspectrometrie kan verhogen de analytische diepgang. Echter, deze uitgebreide workflow drastisch verhoogt de vereiste tijd voor LS-MS / MS data-acquisitie. voor generation van een gedetailleerde moleculaire opeenvolging van synaptische eiwit herschikkingen tijdens het leren en geheugenvorming een bepaald tijdsverloop van het proteomics profilering is vereist. Dit tijdsverloop kan onmiddellijk na of zelfs tijdens de eerste training en bestrijkt een fijnmazig tijdsbestek tot de prestaties van de dieren 'de asymptotische niveau van de leercurve bereikt na ca. 8-10 dagen van de opleiding (zie figuur 2 voor details).

De analyse van fosforylering wijzigingen van synaptische eiwitten vereist een bijzondere aandacht voor de geselecteerde termijnen tijdens FMTD leren. Enerzijds signaling cascades initiëren synaptisch eiwit herschikkingen bekend worden geactiveerd door proteïne fosforyleringen en dephosphorylations in zeer vroege stadia van diertraining verwacht. Aan de andere kant zijn er langdurige modificaties van meerdere gefosforyleerde synaptische eiwitten bekend die de connectiviteit en assemblage in de s regulerenynaptic architectuur ^{19, 20.} Die posttranslationele modificaties zijn zelfs op latere tijdstippen van het geheugen consolidatie verwacht.

Het complex datasets gegenereerd door deze proteomics workflow nodig bioinformatic verwerking te identificeren deelnemende moleculaire wegen en belangrijke moleculen. Meta-analyse laat significante oververtegenwoordigd pathways die een rol spelen bij leer- en geheugenprocessen spelen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M Empore Solid Phase Extraction- Filter	3M Bioanalytical Technologies	4245SD	7 mm/3 ml
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164564	100 µm x 2 cm, C18
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164569	75 µm x 25 cm, C18
Acetic acid	Carl Roth GmbH	3738.1
Acetonitrile (ACN)	Carl Roth GmbH	AE70.2
Acrylamide (30%)	AppliChem	A0951
Ammonium hydrogen carbonate	Fluka	9830
Ammonium hydroxide	Fluka	44273
Ammonium persulfate  (APS)	AppliChem	A2941
Biofuge pico	Heraeus GmbH	75003280
Blue R-250	SERVA Electrophoresis GmbH	17525
Bromophenol Blue	Pharmacia Biotech	17132901
C57BL/6J mice	Charles River
Cantharidin	Carl Roth GmbH	3322.1
Centrifuge tubes for MLS-50	Beckman Coulter	344057
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343776
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A1101
Eppendorf 5417R centrifuge	VWR	22636138
Eppendorf A-8-11 rotor	VWR	5407000317
Formic acid	Fluka	14265
GeneCodis	http://genecodis.cnb.csic.es/
Gephi	https://gephi.org/
Glycerol	AppliChem	A1123
Glycine	AppliChem	A1067
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Pierce /Thermo Scientific	78420
HEPES Buffer solution	PAA Laboratories GmbH	S11-001
Homogenization vessel 2 ml	Sartorius AG	854 2252
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
Laboratory drilling drive  K-ControlTLC 4957	Kaltenbach & Vogt GmbH	182997
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2	Thermo Scientific
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Scientific
Macs-mix tube rotator	Miltenyi Biotech	130-090-753
Magic Scan 4.71	UMAX
Methanol	Carl Roth GmbH	AE71.2
MLS-50 rotor	Beckman Coulter	367280
Optima MAX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	364300
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PEAKS 7.5	Bioinformatic Solutions
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma-Aldrich	P0044
PhosphoRS 3.1	IMP/IMBA/GMI
PhosSTOP	Roche	4906845001
Plunger/pestle made of PTFE	Sartorius AG	854 2651
PotterS homogenizer	Sartorius AG	853 3024
Protease Inhibitor complete mini	Roche	4693159001
Quantity One 4.5.1	BioRad
RapiGest	Waters	186002122
Shuttle box	Coulbourne Instruments
Sodium dodecylsulfate (SDS)	AppliChem	A1112
Sodium molybdate	Carl Roth GmbH	274.2
Sodium tartrate dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG	305
Soundproof chamber	Industrial Acoustics Company
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Thermomixer basic	CallMedia	111000
Titansphere TiO 5µm	GL Sciences Inc. Japan	502075000
TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343840
Trifluoro acetic acid  (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)	AppliChem	A1086
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Trypsin Gold	Promega	V5280
Ultimate 3000 Ultra HPLC	Dionex/Thermo Scientific
Ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	343776
Unijet II Refrigerated Aspirator	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
Urea	AppliChem	A1049
Water (high quality purifed)			Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C  Pyrogens: < 0.02 EU/ml                TOC: < 10 ppb
Xcalibur 3.0.63	Thermo Scientific
ZipTipC18 Pipette Tips	MILLIPORE	ZTC18S960