Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Samenvatting

De aanwezigheid van cyanobacteriëntoxines in zoetwaterreservoirs voor menselijke consumptie is een grote zorg voor waterbeheerautoriteiten. Om het risico van waterverontreiniging te evalueren, beschrijft dit artikel een protocol voor de detectie op locatie van cyanobacteriënstammen in vloeibare en vaste monsters door gebruik te maken van een antilichaam-microarray-chip.

Samenvatting

Opwarming van de aarde en eutrofiëring maak wat aquatische ecosystemen gedragen als echte bioreactoren die een snelle en massale cyanobacteriën groei leiden; Dit heeft relevante gezondheids- en economische gevolgen. Veel stammen zijn cyanobacterial toxine producenten en slechts weinig cellen nodig om onherstelbare schade aan het milieu veroorzaken. Daarom, water-body overheden en administraties vereisen snelle en efficiënte systemen voor vroegtijdige waarschuwing verstrekken van betrouwbare gegevens om hun preventieve of curatieve beslissingen te ondersteunen. Dit manuscript meldt een experimenteel protocol voor de in het veld detectie van toxine-producerende cyanobacteriën stammen met behulp van een antilichaam microarray chip met 17 antilichamen (ABS) met taxonomische resolutie (CYANOCHIP). Hier, een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) voor de gelijktijdige bewaking van 17 cyanobacteriën stammen vaak gevonden bloeien in zoetwater ecosystemen, sommigen van hen toxine producenten, beschreven. Een microarray met multiple identieke herhalingen (maximaal 24) van de CYANOCHIP werd op een objectglaasje gedrukt gelijktijdig eenzelfde aantal monsters getest. Vloeibare monsters kunnen worden getest, hetzij door directe incubatie met de antilichamen (Abs) of na celconcentratie door filtratie door een 1- tot 3-um filter. Vaste monsters, zoals sedimenten en gemalen rotsen, eerst gehomogeniseerd en gedispergeerd met een handbediende ultrasonicator per incubatiebuffer. Zij worden dan gefilterd (5-20 pm) waardoor het ruwe materiaal te verwijderen en het filtraat wordt geïncubeerd met Abs. Immuunreacties worden onthuld door een uiteindelijke incubatie met een mengsel van de 17 fluorescentie gelabelde Abs en worden gelezen door een draagbare fluorescentiedetector. Het hele proces duurt ongeveer 3 uur, het meeste overeenkomt met twee 1-uur incubatie perioden. De uitvoer is een beeld, waarbij heldere vlekken corresponderen met de positieve detectie van cyanobacteriën markers.

Inleiding

De detectie en monitoring van micro-organismen in complexe natuurlijke microbiële gemeenschappen zijn van cruciaal belang op vele gebieden, met inbegrip van medische biologie, ecologie van het milieu, en astrobiology. Cyanobacteriën zijn prokaryotische micro- organismen bekend om hun vermogen om bloemen (excessieve proliferatie) van cellen vormen in zoet water. Ze zijn alomtegenwoordig en vele soorten kunnen toxinen produceren, wat niet alleen een risico betekent voor de gezondheid, maar ook een ecologische impact. In dit verband is het essentieel om snelle en gevoelige methode voor de vroege detectie van cyanobacteriën en / of toxinen in grond en water te ontwikkelen. Voor dit doel is een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) is ontwikkeld als instrument voor waterbeheerders om hen te helpen bij het maken van beslissingen en, bijgevolg, bij de uitvoering van de juiste water management programma's.

Een breed scala aan methoden ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van cyaanobacterial cellen en cyanotoxines in grond en water, zoals optische microscopie, moleculaire biologie, en immunologische technieken. Deze methoden kunnen sterk variëren in de informatie die zij verstrekken. Microscopische technieken zijn gebaseerd op celmorfologie en de detectie van in vivo fluorescentie van cyanobacteriën pigmenten, zoals phycocyanin of chlorofyl a ^1. Hoewel ze zijn snelle en goedkope methoden voor real-time en frequente controle die informeren over de aard en het aantal cyanobacteriën aanwezig is in een monster, hebben ze geen informatie over de mogelijke toxiciteit geven. Bovendien vereisen zij een bepaald niveau van deskundigheid, aangezien het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten ^2. Om deze beperkingen te overwinnen, moet lichtmicroscopie worden begeleid door zowel biologische en biochemische screeningstesten en fysisch-chemische methoden voor de identificatie en kwantificatie van cyanotoxines.

-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), eiwit fosfaat remmingstesten (PPIA) en neurochemische bij muizen zijn voorbeelden van biochemische screeningsassays voor de detectie van cyanotoxines. Terwijl de eerste twee zijn snelle en gevoelige methoden zijn valse positieven beschreven bij het gebruik van ELISA en PPIA tests worden beperkt tot drie typen gifstoffen. De muis bioassay is een kwalitatieve techniek met een lage gevoeligheid en precisie, en speciale vergunningen en opleiding vereist. Bovendien is het geen informatie over de aard van de giftige stoffen die aanwezig zijn in een monster te geven. Cyanotoxines kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd andere analytische werkwijzen, zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), gaschromatografie (GC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), of matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF). Dit is echter alleen mogelijk als referentiestandaarden, die nodiged individuele toxine concentraties in complexe monsters te bepalen, zijn ^{3, 4.} Bovendien zijn deze werkwijzen zijn tijdrovend; vereisen dure apparatuur, voorraden en monster voorbereiding; en moeten worden uitgevoerd door ervaren en gespecialiseerde medewerkers.

Moleculair gebaseerde methoden zijn toegepast voor de komende decennia op te sporen, te identificeren en te kwantificeren cyanobacteriën en de bijbehorende cyanotoxines dankzij de sequentie-informatie gepubliceerd in het genoom databases (bv, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Onder deze werkwijzen zijn op basis van de polymerasekettingreactie (PCR), waarbij het ontwerp van primersets voor DNA amplificatie vereist en afhankelijk voorkennis van DNA-sequenties van verschillende soorten cyanobacteriën. Terwijl gen detectie, zoals de phycocyanin operon, leidt tot een nauwkeurige identificatie op genus niveau, sommige soorten of stammen zijn onopgemerkt metdeze methode. Echter, toxine-coderende genen, bijvoorbeeld die welke behoren tot de microcystine operon, vergemakkelijken de identificatie van toxines in monsters waar de producenten schaars ^5. Niettemin heeft de detectie van toxine markers door PCR niet noodzakelijkerwijs toxiciteit in het milieu. Bovendien is de set van primers ontwikkeld om het hele scala van soorten cyanobacteriën en toxine producenten aanwezig zijn in een monster te analyseren is nog onvolledig, en verder onderzoek moet worden gedaan om onbekende soorten te identificeren. Andere moleculaire technieken niet PCR-gebaseerde, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA microarrays.

In de laatste twee decennia heeft microarray technologie aan belang gewonnen op vele toepassingsgebieden, met name in het milieu monitoring. DNA microarrays mogelijk maken onderscheid tussen soorten en analyten ^{4, 6, 7} sup>, ^{8, 9, 10,} maar ze worden beschouwd als zeer omslachtig en tijdrovend taken die meerdere stappen (bijvoorbeeld microarray prestaties, DNA extractie, PCR amplificatie en hybridisatie) omvatten. Daarom minder tijdrovend assays op basis van antilichamen, zoals sandwich en competitieve immunologische microarrays, een essentieel en betrouwbare high-throughput werkwijze voor de detectie van meerdere analyten milieu ^{11, 12, 13} worden. Het vermogen van antilichamen om specifiek herkennen de doelverbindingen en kleine hoeveelheden analyten en eiwitten te detecteren, samen met de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen vrijwel alle stoffen, maak antilichaam microarrays een techniek om milieuredenen. Bovendien is de mogelijkheid van het bereiken meerdere analyses alsingle assay, met detectiegrenzen variërend van ppb tot ppm, is een van de belangrijkste voordelen van deze methode ^14.

Antilichamen gebaseerde biosensoren bleken gevoelige en snelle instrumenten voor de detectie van een breed scala van pathogenen en toxinen in milieucontrole ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} zijn. Terwijl DNA werkwijzen omvatten verschillende stappen, het op antilichaam gebaseerde microarrays vereisen slechts een kleine steekproef preparaat dat hoofdzakelijk gebaseerd is op een korte lysisstap in een geschikte buffer oplossing. Delehanty en ¹⁵ League Meeste meldde de gelijktijdige detectie van eiwitten en bacteriële analyten in complexe mengsels van een antilichaam sandwich immunoassay voor het opsporen van een eiwitconcentratie van een 4 ppbd 10 ⁴ cfu / ml cellen. Szkola et al. ²¹ is een voordelige en betrouwbare multiplex microarray voor de simultane detectie van proteotoxins en kleine toxines verbindingen die kunnen worden gebruikt als biologisch wapen ontwikkeld. Het gedetecteerde concentraties ricine toxine, met een detectiegrens van 3 ppb, in minder dan 20 minuten. Onlangs heeft de CYANOCHIP een antilichaam microarray-gebaseerde biosensor voor de in situ detectie van toxische en toxische cyanobacteriën beschreven ^22. Dit microarray maakt de identificatie van potentiële cyanobacteriënbloeien, meestal in waterige omgevingen die moeilijk microscopisch identificeren. De detectiegrens van de microarray is ¹⁰ februari - 10 maart cellen voor de meeste soorten, het draaien van deze biosensor in een kosteneffectief instrument voor de multiplex detectie en identificatie van cyanobacteriën, zelfs op het niveau van soorten. Al deze eigenschappen maken de AntiboDY microarray techniek, met name de methode die in dit werk, sneller en eenvoudiger methode dan de bovengenoemde technieken.

Dit werk toont twee voorbeelden van experimenten die een antilichaam microarray gebaseerde biosensor om de aanwezigheid van cyanobacteriën in bodem- en watermonsters te detecteren. Het is een eenvoudige en betrouwbare methode gebaseerd op een immunoassay format dat zeer kleine monsterhoeveelheden en zeer eenvoudige monstervoorbereiding vereist. De werkwijze vereist een korte tijd en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in het veld.

Protocol

1. Bereiding van immunogenen

1. Cyanobacterial groeien elke stam in het overeenkomstige kweekmedium onder in Tabel 1 beschreven omstandigheden.
   OPMERKING: groeimedium en kweekomstandigheden voor elke cyanobacteriën stam zijn weergegeven in tabel 1. Alle cyanobacteriële stammen, met uitzondering van K17, behoren tot de groep Antonio Quesada uit Autonoma University (Madrid, Spanje). Het antilichaam tegen Planktothrix rubescens werd gegenereerd uit een natuurlijke steekproef van de monospecifieke bloei van deze cyanobacterie van Vilasouto reservoir (Noord-Spanje).
2. Kwantificeren van het aantal cellen met een cel telkamer door optische microscopie ongeveer 10 ⁸ cellen / ml van een late exponentiële of stationaire groeifase verkrijgen.
3. Oogst cellen van 5 ml kweek door centrifugatie bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een 10-mL tube met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) tot ongeveer 10 ⁸ cellen te verkrijgen / ml.
5. Meng en lyseren de cellen van de suspensie door sonicatie gedurende 5 cycli, 30 s elk, met 30 tot 60-s pauze op ijs, een draagbare, handbediende ultrasone processor of door dompelen van de buis in het waterbad van cel disruptor op maximale amplitude (30 kHz).
6. Herhaal stap 1,3-1,5 voor elke stam van de cyanobacterie.
   LET OP: Sonicatie produceert cel verstoring en cellulaire inhoud release. Terwijl proteïnen en polysacchariden goede immunogenen specifieke moleculen, zoals lipiden en nucleïnezuren, kan een humorale immunogene respons zelf opwekken. Daarom moeten ze binden aan dragers, zoals polysacchariden of eiwitten, de moleculaire complexiteit verhogen. Bovendien, sonicatie brengt intracellulaire materiaal antilichaamproductie kan leiden.

2. Productie van polyklonale antilichamen

1. Bereid de eerste immunogen dosis door het mengen van 0,5 ml van het ultrasoon cellysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml compleet Freund's adjuvans. Leveren aan de exploitant van een dier faciliteit voor het polyklonale konijn antilichaam productie.
2. Bereid drie doses zoals eerder voor verder gebruik als geheugen verhoogt de antilichaamproductie proces mengen 0,5 ml van dezelfde homogenaat / lysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml onvolledig Freund's adjuvans. Geef ze aan het dier mogelijk om de antilichaamproductie kunnen voldoen.
3. Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 voor elke nieuwe antilichamen productieproces.
   LET OP: Normaal gesproken, de productie van antilichamen wordt toevertrouwd aan gespecialiseerde dier faciliteiten of bedrijven, omdat de juiste licenties en opleiding nodig zijn om te werken met dieren. Het bedrijf levert een relatieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) meting van de hoeveelheid antigeen-specifieke antilichamen aanwezig in het serummonster.

3. Antibody Purificatie

1. Zuiver het immunoglobuline G (IgG) fractie uit zowel de immuun- en pre-immuunserum in stap 2 verzameld door proteïne-A affiniteitschromatografie. Sommige commerciële zuivering kits, gebaseerd op de cartridge systemen goed werken; volg de instructies provider.
2. Wanneer de zuivering kit biedt geen ontzouting systeem wijzigt de buffer na de elutie van de gezuiverde antilichamen tegen PBS 0,1x, hetzij door dialyse of door centrifugale filterinrichtingen met een 100-kDa (of lager) membraan poriegrootte.
3. Bepaal de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm of met colorimetrische werkwijzen, zoals ²³ Bradford, Lowry ²⁴ of bicinchoninezuur (BCA) ^25.
   Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen waaronder aminegroepen in de elutiebuffer (bijvoorbeeld Tris buffers) omdat ze concurreren met het antilichaam voor binding aan vaste oppervlakken geactiveerd met epoxygroepen. na purification, is het belangrijk om de antilichaam activiteit met ELISA testen.

4. Fluorescentie antilichaam Labeling

1. Label de gezuiverde antilichamen verkregen gedeelte 3 met een fluorochroom (bijvoorbeeld een ver-rode fluorescerende kleurstof) door het oplossen van een commerciële flesje met kleurstof etikettering 1 mg eiwit in 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg 2 pi van de opgeloste kleurstof elk antilichaam preparaat bij een concentratie van 2 mg / ml in een uiteindelijk volume van 50 ul in 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 8,5).
2. Handhaaf de labelingsreacties onder voortdurend roeren gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur en 1200 rpm op een trilplaat.
3. Zuiver het gemerkte antilichamen door gelpermeatiechromatografie (bijvoorbeeld met behulp van een gel met een fractionering bereik tussen 1,5 en 30 kDa opgesloten in een kolom), na van de leveranciers.
4. Meet de absorptie bij 280 nm en bij 650 nm in eluaten en bereken het labeleng efficiëntie volgende leverancier aanbevelingen.
   OPMERKING: tot 50 x 50-pl-antilichaam labeling reacties kunnen worden uitgevoerd met een enkele flacon van de fluorescerende kleurstof voor het merken 1 mg eiwit. Het wordt aanbevolen om de buizen met aluminiumfolie of, als alternatief bedekken, ondoorzichtige 0,5 ml buizen om doofprocessen voorkomen na stap 4,3. IgG antilichamen wordt optimale labeling bereikt met 3-7 mol van de kleurstof per mol antilichaam.

5. CYANOCHIP Production

1. Antilichamen en controles in printoplossing
   1. Bereid 30 pi van elk gezuiverd antilichaam in printoplossing door het mengen van elk antilichaam bij 1 mg / mL in een commercieel 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20 (een niet-ionogeen detergens), allen als eindconcentraties.
      Opmerking: Als alternatief kan een antilichaam-oplossing 20% ​​glycerol, 1% (w / v) sucrose (of trehalose als conserveermiddel) en 0,01% (v / v) Tween 20 in carbonaatbuffer (pH 8,5) bevatten.
   2. Bereid 30 pi van de printoplossing als controles: (a) 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20, (b) proteïne-A gezuiverde pre-immune serum bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer 0,01% (v / v) Tween 20, en (c) runderserumalbumine (BSA) bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20.
   3. Bereid 30 pi van een fluorescent gemerkte gezuiverde pre-immune serum bij verschillende concentraties (bijvoorbeeld van 50 ug / ml tot 1 ug / ml) in 1x eiwit printing buffer met Tween 20, zoals in stap 5.1.1. Deze monsters zullen worden gebruikt als fluorescerende merkers kader en relatieve fluorescentie na kwantificatie spotten.
   4. Voeg 30 ul per putje van de printing oplossingen bereid in stappen 5.1.1, 5.1.2 en 5.1.3 van de hoogste kwaliteit 384-putjes voor microarray fabricage, zoals polypropyleen.
      OPMERKING: Eiwit printing buffer verhoogt de kwaliteit en stabiliteit van de antilichamen en Tween 20 homogeniseert spot morphology en bouwt eiwitkoppeling up. Het wordt aanbevolen de 384-well microplaat bij 4 ° C voor gebruik te houden. Bewaar bij -20 ° C voor langere tijd. Polypropyleen heeft een lage DNA, eiwitten, celextract, en kleine moleculen intrinsieke binding.
2. Antilichaam printen op een microscoopglaasje
   LET OP: Druk de antilichamen op geactiveerd microscoopglaasjes met behulp van verschillende array-platforms, zoals contact, split-naald, of non-contact apparaten, zoals piëzo-elektrische printers of "inkjet" technologieën. In dit werk is de CYANOCHIP routinematig gedrukt door contact met behulp van een robotsysteem (Arrayer) in staat spotten nL hoeveelheden van de antilichamen op de micrometer schaal.
   1. Stel de omgevingsomstandigheden van de drukkerij tot 20 ° C en 40-50% relatieve vochtigheid.
   2. Stel de schuif substraten (bv 75- x 25-mm-epoxy geactiveerde microscoop glasplaatjes) meerdere identieke antilichaam arra voerenys op elke dia.
   3. Spot elk gezuiverd antilichaam, met inbegrip van controles en de referentie-frame, in een drievoud vlekpatroon; onder deze omstandigheden, de vlekken 180-200 urn in diameter.
   4. Na het afdrukken verlaat de dia ten minste 30 minuten bij omgevingstemperatuur te laten drogen en bewaar ze bij 4 ° C; voor het werken in het veld, kan de dia worden getransporteerd en opgeslagen bij omgevingstemperatuur gedurende verscheidene maanden.
      OPMERKING: De CYANOCHIP wordt gedrukt in een drievoud plek microarray formaat met 3 x 8 identieke microarray per objectglaasje of 9 identieke arrays in een 1 x 9 microarray-formaat. Elke array grootte niet groter dan de reactiekamer afmetingen voor een 24-well pakking (gewoonlijk 7,5 x 6,5 mm in een 3 x 8 hybridisatiekamer) zijn.
   5. Voordat u de microarray milieu monsters te analyseren, gebruiken FSMI aan de werkende verwatering voor elk antilichaam in een titratie curve te bepalen. Voor elk antilichaam, een standaard concentratie van het overeenkomstige immunogen ⁽¹⁰ maart - 10 april cellen / ml) en seriële verdunningen van de fluorescerende antilichaam (tussen 1: 500 en 1: 32.000). De optimale antilichaamconcentratie overeen met 50% van de maximale signaalintensiteit verkregen in de titratiecurve. Ook moet de gevoeligheid en specificiteit voor elk antilichaam bepaald zoals beschreven in Blanco et al. ^22.

6. Voorbereiding van de Environmental Multianalyte Extracten voor de TL-Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)

1. Multianalyte uittreksel uit een vloeibaar monster
   1. Neem 1 - 100 ml van het vloeibare monster met een steriele injectiespuit (bijvoorbeeld water uit de kust van een waterreservoir); de hoeveelheid monster is sterk afhankelijk van de potentiële concentratie van het doelwit.
   2. Concentreer de cellen door het passeren van het watermonster door een 3 urn poriegrootte, 47 mm diameter polycarbonaatfilter; een celconcentratietussen ¹⁰ maart - 10 augustus cellen / ml is wenselijk positieve detectie, maar de werkelijke concentratie onbekend.
   3. Herstel de in het filter met 1 ml van een gemodificeerde Tris-gebufferde zoutoplossing Tween 20 versterkt buffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl en 0,1% Tween 20) biomassa door schrapen met een spatel in een 15-mL buis.
   4. Homogeniseren en te splitsen met behulp van een draagbare ultrasone processor, zoals beschreven in stap 1,5, of gewoon door en neer te pipetteren meerdere malen; Dit bereidt het monster voor analyse door de microarray.
2. Multianalyte uittreksel uit een vast monster
   1. Weeg tot 0,5 g van de vaste monster (bijvoorbeeld, rock, de bodem of sedimenten) in een 10-mL buis en optellen tot 2 ml TBSTRR.
   2. Ultrasone trillingen door onderdompeling van de sonicator probe in de buis, door dompelen van de buis in het waterbad van een krachtige sonicatorhoorn, of door een handbediende sonicator. Voer ten minste 5 x 30-scycli bij 30 kHz, stoppend voor 30 s terwijl op ijs.
   3. Filter zand, klei en andere grof materiaal te verwijderen met een 10 ml spuit gekoppeld met een diameter 10 tot 12 mm, 5- tot 20-um poriegrootte nylon filterhouder. Schuif de monsterhouder door de filter in een 1,5 ml buis. Als het filter verzadigde vetzuren, schudden de suspensie in de injectiespuit en breng het naar een nieuwe; Dit bereidt het filtraat materiaal van de immunoassay (stap 7).
      OPMERKING: De buffercapaciteit van TBSTRR afhankelijk van het type monster. Het is belangrijk om de immunoassay onmiddellijk na de bereiding van het milieu extract dragen naar het effect van enzymatische afbraak van de analyten voorkomen. Alternatief voeg proteaseremmers in het milieu extract en bevriezen bij -80 ° C tot de volgende stap.

7. Fluorescerende Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)

1. Het blokkeren van de CYANOCHIP
   OPMERKING: Vlak voor het gebruik, de behandeling van de pEDRUKT glijdt alle vrije epoxygroepen op het schuifblok en de overmaat van niet-covalent gebonden antilichamen te verwijderen.
   1. Dompel de microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) met 5% (w / v) BSA oplossing op een schoon oppervlak (bijvoorbeeld petrischaal of een 50 ml buis) onder zacht roeren van een tuimelschakelaar platform 5 min. Als alternatief, leg de glijbaan naar beneden op een 100- tot 200-ul druppel van de bovenstaande oplossing met de microarray plekken waarvoor zij staat. Verlof voor 3-5 min en dan verder.
   2. pick voorzichtig op de dia met behulp van plastic getipt pincet; proberen te raken microarray zones te vermijden. Elimineer de overtollige vloeistof door zachtjes kloppen de glijbaan op een papieren handdoek. Ondergedompeld in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) met 2% (w / v) BSA oplossing gedurende 30 minuten onder zacht roeren van een rocker platform.
   3. Droog de slede door het uitvoeren van een korte centrifugatie (200-300 g gedurende 1 minuut) met een commercieel microcentrifuge aangepast voor microscoopglaasjes. Als alternatief, droog de dia door zacht ont kloppeno een papieren handdoek.
2. Incubatie van de multianalyte monsterextract met de microarray
   1. Stel de schuif in een commerciële microarray hybridisatie cassette met 24 putten voor meerdere microarrays; volg de instructies provider.
   2. Na preparaat en cassette montage pipet tot 50 pl van het monster of extract een verdunning in TBSTRR in elk putje van de cassette.
   3. Herhaal stap 7.2.2 voor elk monster te analyseren.
   4. Als een blanco controle Pipetteer 50 ul buffer TBSTRR in ten minste twee afzonderlijke putjes van de cassette.
   5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder mengen door pipetteren elke 15 minuten of door het verlaten onder mild schudden. Alternatief incubeer gedurende 12 uur bij 4 ° C.
      OPMERKING: Gebruik andere incubatie pakkingen als functie van de microarray patroon. De tijd en temperatuur van de incubatie in stap 7.2.5 empirische parameters die gewoonlijk afhankelijk zijn van de affiniteit en binding kimet be- trekking van elke gekoppelde antigeen-antilichaam.
3. het wassen
   1. Verwijder de monsters door de invoering van de cassette naar beneden en voorzichtig kloppen op een schone, absorberend papier.
   2. Was de putjes door het toevoegen van 150 pi van TBSTRR een ieder, en verwijderen van de buffer, zoals hierboven.
   3. Herhaal stap 7.3.2 drie keer.
4. Incubatie met fluorescerende detector antilichamen
   1. Voeg 50 ul van een mengsel dat het antilichaam 17 tegen cyanobacteriën-stam antilichamen, elk gelabeld met het fluorochroom in TBSTRR met 1% (w / v) BSA. Bepaal de concentratie van elk fluorescerend antilichaam in het mengsel (0,7-2 ug / ml) door het uitvoeren titratie experimenten van elk antigeen / antilichaam pair ^22.
   2. Incubeer gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur, zoals beschreven in stap 7.2.5, of 12 uur bij 4 ° C.
5. Uitwassen van de fluorescerende antilichamen </ Strong>
   1. Verwijder de ongebonden fluorescente antilichamen, zoals in stap 7,3.
   2. Demonteer de cassette en dompel de dia in 0.1x PBS (bijvoorbeeld in een 50-mL buis) voor een snelle spoelen.
   3. Droog de dia als in stap 7.1.3.

8. Scannen op Fluorescentie

1. Scan de glijbaan voor fluorescentie op emissiemaximum fluorescentiepiek voor ver-rode fluorescerende kleurstof in een scanner voor fluorescentie. Haal een paar beelden van de microarrays bij verschillende scanning parameters, in het algemeen door het verlagen van de laser gain-waarde.
   LET OP: Vermijd verzadigde vlekken (> 65.000 fluorescentie tellingen) -ze zijn uit de schaal en kunnen kwantificeren fouten te introduceren.

9. Beeldverwerking en data-analyse

1. Gebruik een commerciële software voor het analyseren en kwantificeren; De software levert metingen van de fluorescentie-intensiteit (FI, mediaan of gemiddelde van alle pixels van een enkele spot) voor each spot van de hele microarray. Trek de lokale achtergrond rond de spots: FI = FI _spot - FI _{lokale achtergrond.}
2. Sla de FI data en open ze met behulp van een spreadsheet-programma.
3. Gebruik de waarden verkregen voor de lege arrays als de negatieve controle om de valse positieven te identificeren en te verwijderen. Pas de volgende vergelijking om de FI voor elk antilichaam spot te berekenen: FI = (FI _monster - FI _blanco), waarbij FI _monster = FI _spot - FI _{lokale achtergrond} in de microarrays uitgevoerd met monsterextracten en FI _blank = FI _spot - FI _{lokale achtergrond} in het lege microarrays.
4. Breng een extra uitschakeldrempel van 2- tot 3-maal de gemiddelde van de FI van de gehele microarray om de kans op valse positieven te minimaliseren; Dit is met name relevant voor slechte kwaliteit microarray beelden en een lage signaal-ruis verhoudingen.
5. Maak percelen en / of het uitvoeren van verdere analyse als dat nodig is.

Resultaten

Het beschrijft een multiplex immunoassay voor gelijktijdige identificatie van de meest relevante zoetwater cyanobacteriën soorten (Tabel 1) met de CYANOCHIP antilichaam microarray. De microarray kan een 3 x 8 microarray-formaat gedrukt op microscoopglaasjes zijn. Elke microarray bestaat uit een reeks 17 antilichamen gedrukt een drievoud vlekpatroon hun overeenkomstige pre-immune antistoffen en BSA als negatieve controles. De microarrays ook een fluorescerende frame met e...

Discussie

Hier wordt een multiplex fluorescerende sandwich immunoassay met de CYANOCHIP, een 17-antilichaam microarray voor de detectie en identificatie van een breed scala van cyanobacteriën genera, beschreven ^22. Deze blauwalgen vormen de meest voorkomende bodemdieren en plankton genera in zoetwaterhabitats, sommigen van hen zijn toxine producenten. Onlangs heeft de fluorescentie immunoassay format gebruikt om micro-organismen en / of bioanalytes identificeren milieutoepassingen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	Voor de bereiding van immunogenen
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		Voor de bereiding van immunogenen
Fosfaat bufferoplossing met zout (PBS) pH 7.4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM kaliumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasoon processor UP50H	Hielscher		Voor de bereiding van immunogenen
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Voor booster injecties
Proteïne A antilichaam zuiveringskit	Sigma-Aldrich	PURE1A	Voor isolatie van IgG
Centrifugale filterapparaten MWCO<100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	Voor isolatie van IgG
Dialyse slangen, benzoyleerd	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Voor isolatie van IgG
Illustra Microspin G-50 kolommen	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Voor isolatie van IgG
Bradford reagens	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Om de antilichaamconcentratie te meten
MicroBCA proteïne assay kit	Thermo Scientific	23235	Om de antilichaamconcentratie te meten
Proteïne arraying buffer 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Print buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS met 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Nie-ionisch detergent
Rund serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Controle  voor printen; blokkeermiddel
384-wells microplaat	Genetix	X6004	Voor antilichaam printen
Robot arrayer voor meerdere slides	MicroGrid II TAS arrayer van Digilab		Voor antilichaam printen
Epoxy substraat glas slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solide ondersteuning voor antilichaam printen
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochroom
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochroom oplosmiddel
Heidolph Titramax vibrerende platform shaker	Fisher Scientific		Voor antilichaam labelen
Illustra Microspin G-50 kolommen	Healthcare	27-5330-01	Voor zuivering van gelabelde antilichamen
Safe seal bruine 0.5 mL buisjes	Sarstedt	72,704,001	Voor opslag van gelabelde antilichamen
Nanodrop 1000 spectrofotometer	Thermo Scientific		Om antilichaamconcentratie en labelefficiëntie te meten
3 µm poriegrootte polycarbonaat 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	Om cellen te concentreren
1 M Trizma hydrochloride oplossing pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	Voor TBSTRR voorbereiding; om slides te blokkeren
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S7653	Voor TBSTRR voorbereiding
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	Voor omgevingsextract voorbereiding
10 - 12 mm filterhouders	Millipore	SX0001300	Voor omgevingsextract voorbereiding
Protease remmercocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Voor omgevingsextract opslag
1 M Trizma hydrochloride oplossing pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	Om slides te blokkeren
Heidolph Duomax 1030 schommelplatform shaker	VWR		Om slides te blokkeren; voor incubatieprocessen
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	Om slides te drogen
Multi-Well microarray hybridisatie cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette voor 24 tests per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner voor fluorescentie
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software voor beeldanalyse en kwantificering