Een fotothermische angulaire lichtverstrooiingssensor (PT-AS) maakt de snelle en chemische-vrije hemoglobine-analyse van nanoliter-schaal bloedmonsters mogelijk. Hier worden details van de PT-AS-opstelling en een meetprotocol voor de hemoglobineconcentratie in bloed gegeven. Representatieve resultaten voor anemische bloedmonsters worden ook gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een snelle en chemische-vrij hemoglobine Assay met Fotothermisch Angular Light Scattering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fotothermische hoek lichtverstrooiing (PT-AS) is een nieuwe optische werkwijze voor het meten van de hemoglobineconcentratie ([Hb]) bloedmonsters. Op grond van de intrinsieke fotothermische respons hemoglobinemolecules de sensor maakt hoge gevoeligheid, chemicaliën meting van [Hb]. [Hb] detectievermogen met een maximum van 0,12 g / dl in het bereik van 0,35-17,9 g / dl eerder aangetoond. De werkwijze kan gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van goedkope elektronische inrichtingen zoals een laser pointer en een webcam. Het gebruik van een micro-capillair bloed als houder maakt ook de hemoglobine test met een nanoliter-schaal bloedvolume en lage bedrijfskosten. Hier, gedetailleerde instructies voor de PT-AS optische opstelling en signaalverwerking procedures worden gepresenteerd. Testprotocollen en representatieve resultaten voor bloedmonsters bij anemische toestand ([Hb] = 5,3, 7,5 en 9,9 g / dl) zijn ook aanwezig en de metingen worden vergeleken met die froma hematologie analyzer. De eenvoud in uitvoering en de werking moet zijn brede adoptie in klinische laboratoria en instellingen met beperkte middelen mogelijk te maken.
Inleiding
Een bloedonderzoek wordt gewoonlijk uitgevoerd om de algemene gezondheid te evalueren en biomarkers in verband met bepaalde ziekten detecteren. Bijvoorbeeld, de cholesterolconcentratie in het bloed is een maat voor hyperlipidemie, die nauw verwant aan hart- en vaatziekten en pancreatitis. De inhoud van de bloedglucose moet regelmatig worden gemeten, omdat de glucose-niveau wordt geassocieerd met complicaties, zoals diabetische ketoacidose en hyperglycemische hyperosmolar syndroom. Ernstige ziekten zoals malaria, humaan immunodeficiëntie virus en verworven immunodeficiëntie-syndroom gediagnosticeerd door bloedonderzoeken en kwantificering van bloedbestanddelen zoals erytrocyten, trombocyten en leukocyten maakt screening van alvleesklier- en nierziekten.
Hemoglobine (Hb), een kritische component van het bloed, maakt ongeveer 96% van erytrocyten en transporteert zuurstof menselijke organen. Belangrijke wijziging van zijn massa concentratie ([Hb]) mag mij aangeventabolic veranderingen, hepatobiliaire ziekte en neurologische, cardiovasculaire en endocrinologische aandoeningen 1. [Hb] is dan ook routinematig gemeten in bloedtesten. In het bijzonder, anemische patiënten, dialysepatiënten, en zwangere vrouwen wordt ten zeerste aanbevolen [Hb] de monitor als een belangrijke taak 2.
Diverse [Hb] detectiemethoden zijn derhalve ontwikkeld. De hemoglobine cyanide werkwijze worden één van de meest gebruikte technieken voor [Hb] kwantificering, telt kaliumcyanide (KCN) aan de lipide dubbellaag van erytrocyten 3 vernietigen. De cyanide hemoglobine geproduceerd door de chemische vertoont hoge absorptie rond 540 nm; vandaar [Hb] metingen worden via colorimetrische analyse. Deze methode wordt algemeen gebruikt vanwege zijn eenvoud, maar de gebruikte chemicaliën (bijv KCN en dimethyllaurylamine oxide) zijn toxisch voor mens en milieu. De hematocriet systeem meet de volumeverhouding van rode bloedcellen in vergelijking met het totale volume bloedUme door middel van centrifugale scheiding; maar het vereist een relatief grote bloedvolume (50-100 pl) 4. Spectrofotometrie methoden maatregel [Hb] precies zonder enige chemicaliën, maar metingen bij verschillende golflengten en een groot bloedvolume nodig 5,6. Zo hebben verschillende optische meetmethoden [Hb] voorgesteld inclusief detectiemethoden basis van lichtverstrooiing, maar hun meetnauwkeurigheden sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van het theoretische model bloed.
Om deze beperkingen te overwinnen, hebben [Hb] detectiemethoden gebaseerd op de fotothermische (PT) effect van Hb recentelijk voorgesteld 7. Hb, die hoofdzakelijk bestaat uit ijzeroxiden, absorbeert licht bij 532 nm en zet de lichtenergie in warmte 8-10. Deze temperatuurverhoging PT kan optisch worden gedetecteerd door het meten van een verandering in de brekingsindex (RI) van bloedmonsters. Yim et al. loondienst spectrale-domein optische coherentie reflectometry de PT optische weglengte verandering in een met bloed bevattende kamer 11 te meten. Hoewel de methode kunnen chemicaliën en directe [Hb] meten, kan het gebruik van een spectrometer en een interferometrische rangschikking zijn miniaturisatie belemmerd. We hebben onlangs een alternatief [Hb] detectiemethode, genoemd fotothermische hoek lichtverstrooiing (PT-AS) sensor, die meer geschikt is voor miniaturisering inrichting 12. De PT-AS sensor maakt gebruik van de hoge gevoeligheid van de RI-back verstrooiing interferometrie (BSI) naar PT veranderingen in de RI van een bloedmonster in een capillair te meten. BSI zijn gebruikt voor het meten van verschillende oplossingen RI 13-15 en biochemische interacties in vrije oplossing 16 controleren. De PT-AS sensor maakt gebruik van soortgelijke optische opstelling als bij BSI, maar combineert fotothermische excitatie setup om PT toename van de RI in bloedstalen te meten. Werkingsprincipes van de BSI en de PT-sensoren worden in detail elders 12,15. PT-AS sensor toonde hoge gevoeligheid [Hb] meten over een breed detectiebereik (0,35-17,9 g / dl) en kan werken met monstervolumes <100 nl. Geen preconditionering van bloedmonster wordt vereist, en de meettijd is slechts ~ 5 sec. Hier, de experimentele opstelling en een gedetailleerde meting protocol beschreven. Representatieve PT-AS resultaten worden gebruikt bloedmonsters van anemische patiënten en de resultaten worden vergeleken met die van een hematologie-analyse om de correctheid van de PT-AS sensor beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten met bloedmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante wet- en institutionele richtlijnen. De monsters werden de overgebleven bloedmonsters die werden overgenomen en verwerkt in de klinische tests bij de instelling.
1. PT-AS Optical Setup
NB: Men kan een lege micro-capillair te gebruiken voor een eerste PT-AS setup.
- Monteer een lege micro-capillaire buis met inwendige en uitwendige diameters van 200 urn en 330 respectievelijk en een lengte van meer dan ~ 5 cm op een capillair armatuur. In de handel verkrijgbare vezel armaturen kan worden gebruikt als de buis armatuur.
- Stevig verankeren van een 650 nm laser pointer, dwz sonde lichtbron, om het capillair te verlichten. De testbundel moet groter zijn dan de capillaire buis. Plaats een scherm (bijvoorbeeld wit papier) achter het capillair aan een hoekige periodiek patroon te observeren.
- Voor de detectie deel, verwijder alle lenzen in een webcam aan de scatt direct vast te leggenering patroon. Plaats de webcam achter de capillaire buis onder een hoek van 25-35 ° ten opzichte van de probe bundelrichting. Waarborgen dat de hoekige periodiek patroon door het capillaire buisje kan worden gemeten met de detector (figuur 1). Neem de hoekige periodiek patroon in het midden van de beeldsensor wanneer de beeldsensor goed geplaatst.
- Plaats een 532-nm PT excitatie lichtbron om het capillair te verlichten. Plaats de PT lichtbron onder elke hoek zolang de PT excitatielicht overlapt testbundel op het capillair en is de detector niet direct bereikt. PT excitatie van bloedmonsters met behulp van hoge optische vermogen typisch verbetert de PT-AS gevoeligheid, omdat het leidt tot een grotere verandering in de RI.
- Gebruik de hoogste optische kracht van de gebruikte PT excitatie lichtbron. Daarnaast is ervoor te zorgen dat de PT excitatielicht overlapt de sonde licht op het capillair. Gebruik een bundel grootte van de PT excitatielichtten minste het dubbele van de sonde licht de gehele sondevolume verwarmen.
- Plaats een lange-pass filter voor de detector de 532-nm licht af en meet alleen de 650 nm sonde licht.
- Installeer een optische chopper in het pad van de PT excitatielicht voor het verlichten van de capillaire buis. De optische chopper wordt gebruikt om de PT excitatie lichtintensiteit te moduleren.
2. Blood Monstervoorbereiding
- Teken 6 ml vers volbloed bij anemische toestand in ethyleendiaminetetraazijnzuur bloedafname buizen en meng de monsters ook. Geen andere behandeling vereist.
- Meet de bloedmonsters met behulp van de PT-AS sensor binnen 24 uur van winning tot stolling te voorkomen.
3. PT-AS Meet- Protocollen
- Plaats een micro-capillaire buis met een bloedmonster te meten. Vul het capillaire buis met het bloed door capillaire werking door het plaatsen van de buis in het bloed envoldoende. De minimum monstervolume vereist is voor de meting wordt bepaald door de binnendiameter van het capillair en de probe bundelgrootte.
- Gebruik van een buis met een inwendige diameter van 200 urn. De testbundel grootte was 2 mm in de representatieve resultaten, wat suggereert dat de meting kan worden uitgevoerd met een monstervolume van> 63 nl.
- Monteer de capillaire buis op de aangewezen positie in de armatuur.
- Schakel de 650 nm sonde laser om de bloed-loaded micro-capillair verlichten. De hoekige periodiek patroon moet worden waargenomen met de webcam.
- Schakel de 532-nm excitatie PT laser om de buis te verlichten.
- Voer het optische chopper de intensiteit van het excitatielicht PT moduleren van 2 Hz.
LET OP: De reden voor de keuze van de bedrijfsomstandigheden wordt beschreven in beraad en Kim et al. 12.- Monteer een chopper wiel in de motorkop montage van de optische choppersysteem.
- Zet de helikopter schakelkast, en gebruik de draaiknop in de console om de modulatie frequentie in te stellen.
- Voer de helikopter met behulp van de draaiknop.
- Noteer de fluctuerende verstrooiing patroon via de webcam gedurende 5 sec in MPEG-4 (mp4) formaat.
4. Signal Processing
OPMERKING: PT-AS signaalverwerking werd uitgevoerd met een laboratorium ontwikkelde MATLAB code.
- Laad het videobestand om de beelden te extraheren. Voor elke afbeelding [zie figuur 2 (a) een representatieve afbeelding], verkrijgen de gemiddelde verstrooiing patroon door het berekenen van het gemiddelde van de pixelwaarden langs de verticale richting [Figuur 2 (b, c)].
- Evalueer de Fourier transformatie van de gemiddelde verstrooiing patroon, en bereken de fase bij de piek ruimtelijke frequentie. Voer deze handelingen voor alle frames van de opgenomen beelden.
- Met behulp van de fase waarden verkregen van alle beelden, plot de tijdelijke fasefluctuatie [Figuur 2 (d)]. Merk op dat de fase schommelt de PT modulatiefrequentie. Neem de Fourier transformatie van de fase fluctuatie in het tijdsdomein en het verkrijgen van de grootte van de modulatiefrequentie. Dit signaal wordt aangeduid als de PT-signaal AS [Figuur 2 (e)].
- Meet de concentratie [Hb] van een bloedmonster door het omzetten van de PT-AS signaal in de corresponderende [Hb] met de kalibratiecurve die verkregen Protocol 5.
5. PT-AS Calibration
- Bereid bloedmonsters heeft [Hb] waarden die uniform zijn verdeeld in het detectiebereik van de PT-AS sensor (bijvoorbeeld 0-18 g / dl).
- Vóór kalibratie kwantificeren [Hb] waarden van de monsters met behulp van een referentie hematologie analyzer. Meet de PT-AS signalen van de monsters.
- Ontlenen kalibratiecurve betreffende [Hb] de PT-AS signaal door het uitvoeren van een lineaire kleinste kwadraten, [Hb] = A [PT-AS Signaal] + B, de Experimental resultaten. Voor de in tabel 1 bedrijfsomstandigheden, de verhouding tussen [Hb] en de PT-AS signaal bleek te zijn [Hb] = 5,13 [PT-signaal AS] - 0,09. Gebruik MATLAB-code om de lineaire fit te voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een hemoglobine werd uitgevoerd met de PT-AS sensor en de metingen werden vergeleken met die van een hematologie-analyse. Het experiment werd uitgevoerd met een PT excitatielicht intensiteit van 1,4 W / cm2, PT modulatie frequentie van 2 Hz, en meettijd van 5 sec. Tabel 1 vat de experimentele omstandigheden. De bundel groottes van de sonde en PT excitatielicht waren 5,5 en 2 mm, respectievelijk. De webcam opgenomen beelden in een frame rate van 30 fps. Voor me...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De PT-AS sensor vertegenwoordigt een volledig optisch werkwijze kan directe [Hb] meten van onbewerkte bloedmonsters. De methode kwantificeert [Hb] in het bloed met behulp van de intrinsieke PT reactie van hemoglobine moleculen in erytrocyten. Onder verlichting door 532-nm licht, Hb moleculen absorberen het licht energie en warmte produceren. De resulterende temperatuurstijging verandert de RI van het bloedmonster. De hoge RI gevoeligheid van BSI werd benut om deze verandering RI in het bloed te meten. Eerder hebben we a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er wordt geen belangenconflict verklaard.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de onderzoeksprogramma's van de National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 en NRF-2015R1A5A1037668).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 650 nm laser pointer | LASMAC | LED-1 | Probe light |
| Hollow round glass capillaries | VitroCom | CV2033 | Bloedmonstercontainer |
| Webcam | Logitech | C525 | CMOS optische sensor |
| Optical chopper system | Thorlabs | MC2000-EC | Optische chopper |
| Plastic long-pass filter | Edmund Optics | #43-942 | Om 532-nm PT excitatielicht te verwerpen |
| Fiber clamp | Thorlabs | SM1F1-250 | Capillairbuisbevestiging |
| EDTA coated blood sampling tube | Greiner Bio-One | VACUETTE 454217 | Bloedmonstername & anticoagulatie |
| Hematology analyzer | Siemens AG | ADVIA 2120i | Referentie hematologie analyzer |
Referenties
- Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter. Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).
- Rosenblit, J., et al. Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting. Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).
- Van Kampen, E., Zijlstra, W. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).
- Billett, H. H. Hemoglobin and hematocrit. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).
- Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy. Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).
- Zwart, A., et al. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives. Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).
- Kwak, B. S., et al. Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group. Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).
- Lapotko, D., Lukianova, E. Laser-induced micro-bubbles in cells. International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).
- Lapotko, D. O. Laser-induced bubbles in living cells. Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).
- Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. yR., Shnip, A., Zharov, V. P. Photothermal time-resolved imaging of living cells. Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).
- Yim, J., et al. Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes. Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).
- Kim, U., et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering. Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).
- Sørensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes. Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108(2006).
- Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).
- Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter. Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).
- Bornhop, D. J., et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry. science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).
- Yang, X., et al. Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings. Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).
- Zhu, H., et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone. Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).
- Pogačnik, L., Franko, M. Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor. Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
