Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

20.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 december 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

Samenvatting

Regulatorische T-cellen (Tregs) zijn een integraal onderdeel van perifere tolerantie, ze onderdrukken immuunreacties tegen eigen structuren en voorkomen zo auto-immuunziekten. Klinische benaderingen om Tregs adoptief over te dragen, of om Tregs te verminderen bij kanker, zijn aan de gang met veelbelovende eerste resultaten.

Omdat het aantal natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) zeer beperkt is, kan het voordelig zijn om bepaalde Treg-kenmerken te bestuderen met behulp van in vitro geïnduceerde Tregs (iTregs). Tot nu toe is de beste, hoewel niet absoluut specifieke, eiwitmarker om Tregs te onderscheiden de transcriptiefactor FOXP3. Ondanks het belang van Tregs, inclusief niet-overbodige rollen van perifer geïnduceerde Tregs, zijn de protocollen om iTregs te genereren momenteel controversieel, vooral voor menselijke cellen. Dit protocol beschrijft daarom de in vitro differentiatie van humane CD4+FOXP3+ iTregs uit humane naïeve T-cellen met behulp van een reeks Treg-inducerende factoren (TGF-β plus IL-2 alleen, of hun combinatie met retinoïnezuur, rapamycine of butyraat) parallel. Het beschrijft ook de fenotypische karakterisering van deze cellen door middel van flowcytometrie en qRT-PCR.

Deze protocollen resulteren in reproduceerbare expressie van FOXP3 en andere Treg-kenmerkende genen en maken het mogelijk om algemene FOXP3-regulatiemechanismen te bestuderen, evenals protocolspecifieke effecten om de impact van bepaalde factoren te bepalen. iTregs kunnen worden gebruikt om verschillende fenotypische aspecten en moleculaire mechanismen van Treg-inductie te bestuderen. Gedetailleerde moleculaire studies worden vergemakkelijkt door relatief grote aantallen cellen die kunnen worden verkregen.

Een beperking voor de toepassing van iTregs is de relatieve instabiliteit van FOXP3-expressie in deze cellen in vergelijking met nTregs. iTregs die door deze protocollen worden gegenereerd, kunnen ook worden gebruikt voor functionele assays zoals het bestuderen van hun onderdrukkende functie, waarbij iTregs geïnduceerd door TGF-β plus retinoïnezuur en rapamycine superieure onderdrukkende activiteit vertonen. De onderdrukkende capaciteit van iTregs kan echter verschillen van nTregs en het gebruik van geschikte controles is cruciaal.

Inleiding

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulerende T-cellen (Tregs) onderdrukken andere immuuncellen en zijn kritische mediatoren van perifere tolerantie voorkomen autoimmuniteit en overmatige ontsteking 1. Het belang van Tregs wordt geïllustreerd door de menselijke ziekte immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathie X-gebonden syndroom (IPEX), waarbij verlies van Tregs door mutaties in het `master' Treg transcriptiefactor forkhead box P3 (FOXP3) leidt tot ernstige systemische auto-immuunziekte, dodelijke op jonge leeftijd. Echter, Tregs fungeren als een tweesnijdend zwaard in het immuunsysteem als ze ook kunnen belemmeren anti-tumor immuniteit in bepaalde instellingen 2. Therapeutische manipulatie van Treg aantal en de functie is dan ook om tal van klinisch onderzoek onderworpen. Bij kanker kunnen depletie van Tregs gewenst zijn en enig succes van klinische benaderingen bevordert verder onderzoek 3. In auto-immuun- en ontstekingsziekten, in aanvulling op therapeutische werking van Tregs in several muis ziektemodellen, recent als eerste in-man proeven van adoptieve Treg overdracht te voorkomen graft versus -host ziekte (GvHD) 4-7 en de veiligheid in de behandeling van type 1 diabetes 8 beoordelen toonde veelbelovende resultaten.

Natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) omvatten-thymus afgeleide tTregs en perifeer veroorzaakte pTregs, met niet-redundante essentiële functies voor het behoud van de gezondheid van 9-11. Echter, nTreg aantallen zijn beperkt, het stimuleren van de complementaire aanpak van het induceren van Tregs (iTregs) in vitro van naïeve T-cel voorlopers 12. Still stabiliteit van iTregs, waarschijnlijk door een gebrek aan demethylering in de zogenoemde Treg-gedemethyleerde specifieke regio (TSDR) in FOXP3 gen locus 13, een punt van zorg en verschillende studies geven aan dat in vivo geïnduceerde Tregs stabieler 14.

Tot op heden, FOXP3 blijft de beste eiwit mArker voor Tregs, maar het is niet absoluut specifiek omdat conventionele menselijke CD4 + CD25 T-cellen die tijdelijk gemiddeld niveau van expressie FOXP3 bij activering 15,16. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van de regulering van FOXP3 meningsuiting, nog veel te ontdekken met betrekking tot de inductie, de stabiliteit en de functie van FOXP3 name in menselijke cellen. Ondanks verschillen nTregs in vitro geïnduceerde FOXP3 + CD4 + T-cellen kunnen worden gebruikt als een modelsysteem voor de moleculaire mechanismen van FOXP3 inductie bestuderen en als uitgangspunt voor protocollen in de toekomst die het mogelijk maken voor het genereren van iTregs die meer lijken op in zijn ontwikkeling vivo gegenereerd Tregs, die van toepassing zijn voor adoptieve overdracht strategieën in de toekomst zou kunnen zijn.

Noch `goud standard' protocol menselijke iTregs induceren en huidige protocollen werden ontwikkeld volgens nabootsen Treg-inducerende omstandigheden in vivo: interleukine 2 (IL-2) En transformerende groeifactor β (TGF-β) signalering cruciaal voor FOXP3 inductie in vivo 17, en all-trans retinoïnezuur (ATRA) - die in vivo wordt geproduceerd door de darm geassocieerde dendritische cellen - wordt vaak gebruikt om FOXP3 inductie verbeteren in vitro 18-21. We hebben extra personeel Treg-inducerende protocollen gebruikt butyraat 22, een darmflora afkomstige korte keten vetzuur dat recentelijk werd aangetoond dat murine Treg inductie 23,24 vergroten ontwikkeld. We hebben ook onlangs een nieuw protocol voor het genereren van iTregs met superieure onderdrukkende functie in vitro met behulp van een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine 22, waarbij de laatste een klinisch goedgekeurd zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmer) waarvan bekend is dat te bevorderen FOXP3 onderhoud tijdens de menselijke Treg expansie 25,26.

Deze methode beschrijft de reproduceerbaarvitro genereren van humane CD4 + FOXP3 + iTregs met een aantal verschillende omstandigheden, en de latere fenotypering van flowcytometrie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) protocol-specifieke expressiepatronen van FOXP3 en andere Treg handtekening moleculen openbaren zoals CD25, CTLA-4, EOS, en onderdrukking van IFN-γ en SATB1 expressie 22. De gegenereerde celpopulaties kan worden gebruikt voor functionele bepalingen inzake onderdrukkende activiteit of voor moleculaire studies, ofwel betreffende algemene FOXP3 regulators of effecten specifiek voor bepaalde verbindingen zoals butyraat of rapamycine bestuderen. Verder inzicht in de moleculaire mechanismen die Treg differentiatie is zeer relevant voor toekomstige therapeutische benaderingen in auto-immuniteit of kanker om specifiek te richten moleculen betrokken bij Treg generatie en functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) werden vers geïsoleerd uit geanonimiseerde gezonde donor buffy coats gekocht van de Karolinska University Hospital, Zweden. Ethische vergunning voor de experimenten werd verkregen van de Regionale Ethische Review Board in Stockholm (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Zweden (erkenningsnummer: 2013 / 1458-31 / 1).

1. T Cell Isolatie uit perifeer bloed

  1. PBMC Isolation
    1. Pre-lay 15 ml dichtheid centrifugeren medium (zoals Ficoll) oplossing in 50 ml buizen (5 tubes per buffy coat). Voorverwarmen tot kamertemperatuur.
    2. Vullen buffy coat met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (kamertemperatuur) tot 180 ml. Als vers bloed wordt gebruikt, verdund bloed met een gelijk volume PBS.
    3. Tilt buis naar de kant en langzaam overlay dichtheid centrifugeren medium met ~ 35 ml verdund bloed per buis. Voeg het bloed zeer voorzichtig, zonder vermenging van de dichtheid centrifugatie medium fase en bloed laag.
    4. Centrifugeer 20 min bij 1150 xg bij kamertemperatuur zonder rem. Bedien de centrifuge zonder rem en zo mogelijk met een lage tot gemiddelde versnelling voor het mengen van de lagen te voorkomen.
    5. Haal de witte ring die PBMCs tussen de dichtheid centrifugeren medium en de plasma-fase. Transfer naar een nieuwe 50 ml buis (1 keer met 5 ml pipet en 2 keer met 2 ml kunststof-Pasteur pipet). Neem zo min mogelijk plasma en dichtheidscentrifugatie medium. Laat de rode erytrocyten pellet niet aanraken.
    6. Wash PBMCs. Splits de PBMCs in 50 ml buisjes (4 buizen per buffy coat). Vul elk 50 ml met PBS.
    7. Centrifuge 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder en gooi supernatant, zwembad de cellen in 1 tube met 10 ml RPMI / 10% foetaal kalfsserum (FCS), medium en goed mengen. Als cel klonten aanwezig zijn, stam cellen door een 40 um cel zeef.
    9. Transfer cellen in T175 celkweek kolf voor adherent cellen. Spoel buizen met 40 ml medium en combineer met cellen (50 ml totaal). Indien nodig, verwijder dan een portie voor flowcytometrie-analyse (zie stap 1.4). Gewoonlijk CD4 + T-cellen bevatten ongeveer 30-40% van de cellen in de lymfocyt gate en naïeve T cellen omvatten ongeveer 30 tot 60% van CD4 + T-cellen afhankelijk van de donor.
    10. Incubeer cellen tot kolf gedurende 45 tot 90 minuten bij 37 ° C / 5% CO2. Deze stap zal monocyten uitputten door plastic therapietrouw. Het is niet verplicht, maar zal het percentage T cel opbrengst per hoeveelheid van PBMCs in de volgende stappen te verhogen.
    11. Resuspendeer cellen (in 50 ml medium in de kolf) en spoel cellaag op de bodem van de kolf zorgvuldig. Verdeel cellen eveneens in twee 50 ml buisjes (de vorige buizen kunnen worden hergebruikt voor dezelfde donor). Spoel kolf met 50 ml vers RPMI / 10% FCS medium, en breng even in dezelfde 2 buizen.
      LET OP: PBMCs kan 's nachts worden bewaard bij 4 ° C met buizen tot opde zijkant of idealiter direct gebruikt voor T cel isolatie.
  2. nTreg Isolation door magnetische-geactiveerde Cell Sorting
    1. Bereid isolatie buffer: 0,5% (w / v) humaan serum albumine en 2 mM EDTA in PBS. Altijd buffer bij 4 ° C. Als alternatief voor humaan albumine, runderalbumine gebruiken.
    2. Resuspendeer en tel PBMCs met een automatische of handmatige celgetalmeter in de aanwezigheid van trypan blauw (tellen niet mee kleine plaatjes). Als cel klonten worden waargenomen, stam cellen door een 40 um cel zeef.
    3. Centrifugeer PBMC bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    4. Resuspendeer cellen (met 1 ml pipet) in 90 pl isolatiebuffer per 10 7 PBMCs een enkele celsuspensie te verkrijgen. Houd cellen in de oorspronkelijke 50 ml buizen (2 tubes per buffy coat).
    5. Voeg 2 ul CD25 parels per 10 7 cellen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    6. Vul met PBS tot 30 ml. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 46; C.
    7. Bereid LS kolommen (2 per buffy coat): in evenwicht met 3 ml isolatie buffer, en gooi doorstromen. Buizen kunnen worden hergebruikt voor verdere kolommen spoelen.
    8. Resuspendeer cellen in 3 ml isolatiebuffer per buis (met 1 ml pipet). Overdracht cellen kolom LS, en laat stroom door in verse 15 ml buizen.
    9. Spoel de 50 ml buizen met 2 ml isolatiebuffer elk. Overdracht spoelbuffer de kolommen.
    10. Waskolom met 2 x 3 ml isolatiebuffer elk. Wacht altijd tot de kolom gestopt druipen, voor het toevoegen van nieuwe vloeistof. WINKEL stromen door bij 4 ° C voor latere stappen.
    11. Kolom verwijderen uit magneet. Elueer 2x met 3 ml isolatie buffer per kolom in 15 ml buis.
      Opmerking: Het eluaat van 2 kolommen per donor te combineren. Laat de kolom niet onderdompelen in de vloeistof.
    12. Bereid en evenwicht nieuwe LS kolommen (1 kolom per buffy coat). Breng het eluaat van 1.2.11 aan de kolom. Doorstroom kan worden weggegooid. Na eluaat heeft passed door de kolom, spoel buis en waskolom met 3 x 3 ml isolatiebuffer.
      LET OP: De tweede kolom is cruciaal nodig om de zuiverheid te verhogen.
    13. Kolom verwijderen uit magneet. Elueer CD25 ++ "nTregs" 2x met 3 ml isolatie buffer.
    14. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant volledig.
    15. Was de cellen met 15 ml T celkweekmedium, centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant volledig.
    16. Resuspendeer cellen in 0,5 ml T celkweekmedium aangevuld met 100 IU / ml IL-2, elk. Overdracht cellen om 24-well plaat. Spoelen buis met 0,5 ml medium (+ 100 IE / ml IL-2) en te combineren in 24-wells plaat.
    17. Count nTregs (als in stap 1.2.2). De opbrengst is meestal ongeveer 1-4 x 10 6 Tregs per buffy coat. Pas dichtheid van Tregs 1-2 x 10 6 cellen / ml met T celkweekmedium + 100 IE / ml IL-2.
    18. Incubeer Tregs bij 37 ° C / 5% CO 2 tot gebruik.
  3. Naïeve CD4 + T-cellen Isolatie van magnetische-geactiveerde celsortering
    LET OP: Neem stromen door vanaf stap 1.2.8-1.2.10 om verder te gaan met een mobiele isolement. Als alternatief, als er geen nTregs geïsoleerd werden, gaat rechtstreeks uit PBMCs.
    1. Combineer 2 tubes per donateur van Treg-verarmd PBMC in 50 ml buis. Vul met PBS tot 50 ml bij kamertemperatuur.
    2. Centrifugeer PBMC bij 200 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder en gooi supernatant. Resuspendeer cellen in 50 ml PBS.
    3. Herhaal stap 1.3.2 tweemaal.
      OPMERKING: De PBS wast zijn cruciaal voor het verwijderen van bloedplaatjes, die niet worden verwijderd met de volgende negatieve isolatiekit. Bloedplaatjes blijven in de supernatant bij deze lage-snelheid centrifugatie. Bloedplaatjes uitputting kan worden gecontroleerd in de afzonderlijke stappen op een microscopisch dia. De stappen worden uitgevoerd met PBS en centrifugeren bij kamertemperatuur.
    4. PBMC resuspendeer in 50 ml PBS. Tellen cellen als in stap 1.2.2.
    5. Centrifugeer PBMC bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 40 ui Isolation buffer (4 ° C) per 10 7 cellen.
    6. Voeg 10 ul van naïeve CD4 + T-cel biotine-Antibody Cocktail II per 10 7 cellen.
    7. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    8. Was de cellen door toevoeging van 40 ml PBS (4 ° C) en centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 80 ul isolatie buffer per 10 7 cellen.
    9. Voeg 20 ul van anti-biotine microbolletjes per 10 7 cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    10. Vul aan tot 50 ml met koude PBS en centrifugeer 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    11. Bereid LS kolom (in evenwicht met 3 ml isolatie buffer). Om kolom overbelasting te voorkomen, gebruikt u een kolom voor maximaal 250 x 10 6 PBMCs, of minder als PBMCs bevatten veel rode bloedcellen.
    12. Verwijder supernatant en resuspendeer cells in 3 ml isolatiebuffer. Overdracht cellen LS kolom. Verzamelen stroom door, waarbij de naïeve CD4 + T-cellen bevat, in 15 ml buizen.
    13. Spoel buis met 2 ml isolatiebuffer. Over te dragen aan de kolom.
    14. Waskolom met 3 x 3 ml isolatiebuffer. Wacht altijd tot de kolom stopt druipen, voor het toevoegen van nieuwe vloeistof.
    15. Neem de doorstroom (naïeve CD4 + T-cellen) en centrifugeer 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Kolommen kunnen worden weggegooid.
    16. Verwijder supernatant volledig. Was de cellen met 15 ml medium, centrifuge 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur geroerd en volledig verwijderen supernatant.
      OPMERKING: Isolatie buffer EDTA, waarin calciumionen cheleert en belemmert bijgevolg T-celactivering. Voordat een stimulatie assays, verwijder de isolatie buffer volledig en was cellen tweemaal met 15 ml medium.
    17. Resuspendeer cellen in T cel kweekmedium 2-3 x 10 6 cellen per ml. Rest cellen in geschikte kolf or ruim nacht in de incubator. Als cellen direct worden gebruikt voor de stimulatie assays, nog een keer met medium was ze.
  4. Purity Controle kleuring
    1. Neem ~ 50.000 cellen (Tnaïve; nTreg; PBMCs) per stuk, in 20 pl.
      LET OP: Als zowel Tnaïve en nTreg panel worden gekleurd, neem 2 monsters per stuk.
    2. Bereid 2x geconcentreerde premix antilichaam (in PBS) afhankelijk van het instrument, bijvoorbeeld: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Voor Treg panel, vervang CD45RO-PE met CD25-PE, 01:10.
      OPMERKING: Alleen bepaalde CD25 antilichamen die verschillende epitopen dan de CD25-microkorrels herkennen, kunnen worden gebruikt om nTregs geïsoleerd met CD25 microkralen vlekken.
    3. Voeg 20 ul antilichaam premix 20 pi cellen. Ook bereiden enkele kleuringen voor elke fluorochroom (met behulp van een monster dat positieve cellen, bijvoorbeeld PBMCs) en een ongekleurde monster, voor flowcytometrie settings en compensatie.
    4. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    5. Vul elk monster met 200 pi PBS en centrifugeer 450 xg gedurende 5-10 min.
    6. Neem cellen fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) buffer (= isolatiebuffer zonder EDTA) en geanalyseerd door flowcytometrie. De zuiverheid van naïeve CD4 + T-cellen is gewoonlijk> 95% (zie figuur 2).

2. Treg Inductie Cultuur

  1. Voorbereiding van de Stimulatie Media en Plates
    1. Bereiden en voorverwarmen T celcultuurmedium: serumvrij hematopoietische medium aangevuld met 2 mM L-alanyl-L-glutamine.
    2. Bereid cytokine, stimulatie antilichaam en samengestelde voorraad concentraties.
      1. Bereid IL-2 stock oplossing: 400.000 IU / ml in steriel gefiltreerd (met zuurbestendig filter) 100 mM azijnzuur (167 ug / ml als activiteit van de gebruikte kavel is 2.400 IE per 1 ug; bevestig met de provider). Aliquot gesteriliseerde lage eiwitbinding 0,5 ml buizen afdichting met Parafilm, invriezen op droog ijs en bewaar bij -80 ° C voor langdurige opslag of -20 ° C maximaal 3 maanden.
      2. Bereid TGF-β1 voorraad-oplossing (10 ug flacon, carrier-vrij): Centrifuge TGF-β1 poeder (1000 xg 3 min), voeg 100 ul van 4 mM HCl (steriel gefiltreerd met zuurbestendig filter) om de balans op te bereiden met 100 ug / ml, volledig laten lossen; vortex. Aliquot 5 pi elk gesteriliseerd lage eiwitbinding 0,5 ml buizen afdichting met Parafilm, invriezen op droog ijs en bewaar bij -80 ° C maximaal 6 maanden.
      3. Bereid ATRA voorraadoplossing: Los poeder bij 20 mg / ml (66,6 mM) in DMSO. Bereid voorraadoplossing van 10 mM door verdere verdunning in DMSO en bewaar monsters, beschermd tegen licht, bij -80 ° C tot 1 jaar. ATRA is gevoelig voor licht, warmte en lucht.
      4. Bereid rapamycine voorraadoplossing: 1 mg / ml (1,11 mM) in DMSO, opslag in hoeveelheden bij -80 ° Ctot 1 jaar.
      5. Bereid natriumbutyraat voorraad oplossing: 0,908 M (0,1 mg / ml) voorraad in steriele ultra-pure H 2 O en steriel filter. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    3. Bereid 4x geconcentreerde voormengsels (50 gl per putje) in T-cel kweekmedium zoals in tabel 1.
    4. Op de vorige dag, laag platen met anti-CD3 antilichaam. Coat gewenste aantal putten uit 96 U-well plaat met 5 ug / ml anti-CD3 antilichaam in PBS, 65 ul / putje. Wikkel plaat met folie en incubeer overnacht bij 4 ° C.
      LET OP: Gebruik niet de marge putjes van platen met 96 putjes. Grotere putten worden gebruikt, maar U-vormige putjes vergemakkelijken gebruik van hetzelfde aantal cellen per gebied in experimenten. Als er meer cellen nodig, bundelen de vereiste hoeveelheid putjes na het kweken. Gewoonlijk na 4-6 dagen groei, 2 wells per monster voldoende voor flowcytometrieanalyse en RNA analyse.
      1. Op de dag van plating, kort voor plating, verwijdert anti-CD3 Oplossing uit putten. Vul putjes met 200 ui / putje PBS. Verwijderen PBS. Herhaal wassen met 200 ul / putje PBS. Verwijder PBS volledig en onmiddellijk te gebruiken platen.
    5. Bereid platen (gebruik geen marge putten):
      1. Voor elk putje, voeg 50 ul van 4x anti-CD28 / IL-2 voormengsel (behalve "gestimuleerde" cellen, voeg T celcultuurmedium), 50 ui 4x TGF-β1 premix (voor iTregs) of 50 gl T celkweek medium voor 'slechts stimulatie "mock control, 50 ui 4x ATRA, ATRA / rapamycine of butyraat premix (indien van toepassing) of middelgrote
      2. Vul alle lege putten, met inbegrip van de marge putten, met 200 pi PBS. Voorverwarmen platen bij 37 ° C / 5% CO2.
  2. Bereid naïeve T-cellen voor Plating
    1. Na rustende cellen, over te dragen aan 15 ml tube, spoel kolf / putten met voorverwarmd T cel kweekmedium en het zwembad aan de buis. Vulbuis tot 15 ml met T celkweekmedium.
    2. Centrifugeer cellen bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder medium en nemen cellen in verse, voorverwarmde T celkweekmedium tot een dichtheid van 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Aantal cellen volgens stap 1.2.2 en pas dichtheid indien nodig.
    4. cellen toe te voegen aan bereid stimulatie platen (zie 2.1), 50 pl cellen / putje (110,000-130,000 cellen / putje). Elk putje zou bevatten nu een totaal volume van 200 pl.
    5. Wikkel platen in aluminiumfolie om ATRA bescherming tegen licht; incuberen bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende gewenste tijdsperioden.
  3. Monitor Treg Inductie Cultuur
    1. Monitor Treg culturen door het licht microscopie (40x vergroting). Ongeveer dag 2-3 zullen kleine clusters van prolifererende cellen zichtbaar, die worden samengevoegd tot grotere clusters op latere tijdstippen worden. Culturen opgegroeid met rapamycine groeien over het algemeen minder. Zie ook figuur 3.
    2. Op gewenste tijdstippen, monsters te nemen voor RNA-extraction of flowcytometrie fenotypering (zie hieronder). Voor latere tijdstippen met celproliferatie, 1 goed elke voldoende is, anders neem 1 x 10 5 -1 x 10 6 cellen elk voor RNA en 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellen voor flowcytometrie.
  4. Het beoordelen van FOXP3 Stabiliteit
    1. Voor de stabiliteitscontrole van de iTreg fenotype als eerder beschreven 22,27, wast tweemaal met iTregs T celkweekmedium en cultuur iTregs verder T cel kweekmedium ofwel zonder of met anti-CD3 en anti-CD28 opnieuw stimuleren zoals beschreven in 2,1 en 2,2 . cytokines toevoegen, zoals 50 IU / ml IL-2, om hun invloed op FOXP3 stabiliteitsonderzoek.
    2. Op gewenste tijdstippen monsters voor RNA-extractie, flowcytometrie fenotypering (zie hieronder) en TSDR methylatie als beschreven 22,28.

3. Fenotypische analyse van iTregs door qRT-PCR

  1. Voorbereiding vansamples
    1. Op gewenste tijdstippen, neem 1 x 05-01 oktober x 10 6 cellen per monster voor RNA-extractie. Overdracht cellen aan een RNase-vrij 1,5 ml buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten.
    2. Indien nodig, verwijderen van supernatant en bevriezen enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) of een soortgelijke analyse. Volledig verwijderen resterende supernatant van cellen. Verrichten meteen RNA extractie of bevriezen celpellet op droog ijs en bewaar bij -20 ° C tot -80 ° C gedurende maximaal 2 weken.
    3. Extract RNA en uitvoeren qRT-PCR voor FOXP3 en een huishoud-gen (zoals RPL13A) volgens standaardprotocollen. Daarnaast meten expressie van andere Treg handtekening genen (bijvoorbeeld `Treg up' genen IL2RA, CTLA4, IKZF4 en` Treg down' genen IFNG, SATB1).

4. fenotypische analyse door flowcytometrie

LET OP: Dit protocol is geoptimaliseerd voor staining in 96U well plaat formaat met 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellen. Als er minder cellen per putje, beginnen met een aantal putten en pool zoals hieronder beschreven.

  1. Cel opnieuw stimuleren (optioneel)
    1. Indien kleuring voor intracellulaire cytokinen gewenst, pulse cellen met Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) / Ionomycine in aanwezigheid van een remmer van proteïne.
      Opmerking: Dit is niet van invloed FOXP3 expressie hierboven beschreven iTreg culturen, maar andere merkers kunnen veranderen - bijvoorbeeld wordt CD4 neerwaarts gereguleerd.
    2. Bereid 10x Brefeldine A / PMA / Ionomycin premix (20 ul per putje) in T-cel kweekmedium: Brefeldine Een voorraad oplossing 1: 100, Ionomycin (stock 5 ug / ul) 1: 1300, PMA (stock 12.35 ug / ul, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 van de pre-verdunde voorraad.
    3. 4 uur voor vlekken, voeg 20 ul Brefeldine A / PMA / Ionomycin 10x mix per putje tot het einde concentraties van 1 te verkrijgen: 1000 Brefeldine A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomycine, 10 ng / ml PMA.
    4. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C / 5% CO 2
  2. oppervlak kleuring
    LET OP: Het paneel hier voorgesteld, is een suggestie; andere panelen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de antigenen van interesse en instrument setup.
    1. Cool PBS op ijs. Bereid FACS buffer (PBS met 0,5% humaan serumalbumine, HSA) en koel op ijs. BSA of FBS kan worden gebruikt als alternatief voor HSA.
    2. Re-plaat cellen in kleuring plaat: Resuspendeer cellen met een pipet en overdracht van de cellen in een nieuw 96U well plaat, het verlaten van een goed vrij rond elk putje (om spillover in latere kleuring procedure te voorkomen). Als er minder dan gewenste cel getallen aanwezig zijn in de originele waterput, haalt een deel van de bovenstaande vloeistof vóór resuspensie en zwembad meerdere putten in een kleuring ook.
    3. Centrifugeer plaat 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant. Giet supernatant in de afvalbak, laat de plaat op zijn kopnaar beneden en onmiddellijk (zonder terug te draaien de plaat) tikt de plaat eenmaal op absorberend papier. Dan zet meteen weer de plaat. Vortex plaat om de cellen opnieuw in suspensie in de resterende vloeistof.
    5. Voeg 25 ul oppervlak vlekken premix (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 in FACS buffer) en resuspendeer.
      OPMERKING: Neem ook één kleuringen voor elk van de gebruikte fluorochromen met monsters die positieve cellen voor de respectievelijke antigeen; en beschikken over een ongekleurde monster. Deze zijn nodig voor het instrument compensatie setup. U kunt ook gebruik maken van compensatie kralen.
    6. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    7. Voeg 200 ul PBS, centrifugeren plaat 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    8. Herhaal stap 4.2.7 tweemaal.
  3. levensvatbaarheid kleuring
    LET OP: De levensvatbaarheid kleuring is onmisbaar, want na fixatie / permeabilisatie dode cellen kan niet voldoende worden uitgeslotenfsc / ssc en kunnen aanleiding geven tot niet-specifieke signalen. Een vastzetbaar levensvatbaarheid kleurstof worden gebruikt.
    1. Resuspendeer cellen in 130 ul levensvatbaarheid vlek premix (opgelapt levensvatbaarheid dye-eFlour780 1: 1400 in PBS) en onmiddellijk resuspendeer cellen met de multichannel pipet.
      OPMERKING: Neem ook een kleuring voor levensvatbaarheid kleurstof bevattende dode cellen, bijvoorbeeld niet-gestimuleerde T-cellen gekweekt gedurende verscheidene dagen of cellen te doden door warmte zoals de instructies van de fabrikant. Deze zullen nodig zijn voor een vergoeding.
    2. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    3. Centrifugeer plaat bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    4. Vul met 200 ul FACS buffer. Herhaal stap 4.3.3.
    5. Vul met 200 ul PBS. Herhaal stap 4.3.3.
  4. Intracellulaire kleuring met FOXP3 kleuring Buffer Set
    1. Voor elk putje, voor te bereiden: 150 ul Fix / Perm buffer (verdunnen Fix / Perm concentrate 1: 4 met verdunner); 850 ul 1x permeabilisatie buffer (verdunnen 10x permeabilisatie buffer 01:10 met ultra-pure H 2 O).
    2. Na het vortexen, resuspendeer cellen in 150 ul Fix / Perm buffer en onmiddellijk mengen met pipet. Het is belangrijk om direct mengen fixatie van celklompjes voorkomen.
      Let op: Fixatie buffer bevat paraformaldehyde en moeten worden behandeld en op de juiste wijze weggegooid.
    3. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    4. Voeg 100 ul koud PBS. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
      Opmerking: Van deze stap verder de centrifugeersnelheid verhoogd tot celverlies voorkomen. Na fixatie cellen onzichtbaar en voorzichtigheid is geboden bij supernatanten verwijderd zoals beschreven in 4.2.4 stap en onmiddellijk na het centrifugeren wordt afgewerkt celverlies minimaliseren.
    5. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
      LET OP: De kleuring kan worden gepauzeerd bij deze stap; indit geval was de cellen tweemaal met 200 gl PBS; neem vervolgens in 250 pl PBS en opgeslagen bij 4 ° C, beschermd tegen licht. De cellen kunnen worden bewaard gedurende enkele dagen, vervolgens verder met permeabilisatie. Echter optimale resultaten bereikt wanneer direct verder permeabilisatie.
    6. Na het vortexen, voeg 200 ul permeabilisatie buffer. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    7. Voeg 200 ul permeabilisatie buffer te mengen.
      LET OP: Hier kunnen samples worden opgesplitst in intracellulaire kleuring en isotype controle monster (weg te nemen de helft van elk monster). Als cel aantallen beperken, kan een samengevoegde isotype monster worden voorbereid (weg te nemen 10-20 ul van elk monster en het zwembad). Ook kunnen monsters worden genomen voor Fluorescentie-Minus-One (FMO) controles.
    8. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    9. Resuspendeer pellet in44 gl Permeabilisatie buffer plus 1 pl normaal muizenserum (voorgemengd) om onspecifieke binding te blokkeren.
      Opmerking: Dit geldt als antilichamen die in de volgende stap zijn murine isotype. Indien andere antilichamen, zoals verkregen uit ratten, worden gebruikt, de passende serum voor het blokkeren (bijvoorbeeld rat serum).
    10. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten in het donker.
    11. antilichamen toe te voegen:
      OPMERKING: Informeer het antilichaam concentraties voor de specifieke Lots. Indien niet in stap 4.2 met antilichamen tegen oppervlakteantigenen (bijvoorbeeld CD4) met de respectieve fluorochromen gedaan, ook één kleuringen voor elk van de gebruikte fluorochromen met monsters die positieve cellen voor compensatie bevatten.
      1. Voeg 15 ul antilichaam premix om monsters (met uitzondering van enkele kleuringen, onbevlekt monsters, isotype controle monsters en FMO controles): Mengvoeder per monster: 0,7 pl (0,35 pg) anti-Interferon gamma (IFN-γ) FITC (indien van toepassing na opnieuw stimuleren )2,3 pl (0,115 ug) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pl (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 gl PBS.
      2. Met controlemonsters isotype, voeg 15 ul isotype antilichaam premix, met dezelfde hoeveelheden antilichaam als de antilichamen die in 4.4.11.1: Premix per monster: 0,7 pl (0,35 ug) muis IgG1 K isotype controle FITC (indien van toepassing), 0,58 pl (0,115 ug) muizen IgG2a-isotype BV421, 0,5 pl (0,05 ug) muis IgG1 isotype controle APC K, 13,2 gl PBS.
      3. FMO controles antilichamen toevoegen in 4.4.11.1, vervangt één antilichaam elk met PBS.
    12. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
    13. Voeg 200 ul permeabilisatie buffer. Centrifuge, verwijder supernatant en vortex als in stap 4.4.8. Herhaal dit een keer.
    14. Resuspendeer cellen in koude FACS-buffer (volume afhankelijk van het gebruikte instrument) en verwerven, idealiter onmiddellijk op de flowcytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont een schema van de experimentele opstelling. Figuur 2 toont een representatief zuiverheid- kleuring voor magnetisch geïsoleerde naïeve CD4 + T-cellen en nTregs.

F IGUUR 3A toont de flowcytometrie gating strategie en Figuur 3B toont representatieve FOXP3 en CD25 flowcytometrie kleuringen op dag 6 van de cultuur onder de aangegeven iTreg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven protocol kan de robuuste inductie van menselijke CD4 + FOXP3 + iTregs van naïeve humane CD4 + T-cellen. Het omvat een nieuw protocol dat we onlangs beschreven met een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine, voor inductie van iTregs met superieure in vitro onderdrukkende functie 22. In vergelijking met andere gepubliceerde protocollen ander voordeel is de inductie van verschillende iTreg populaties parallel door verschillende protocollen, die de directe vergelijking van de e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Nina Nagel wordt dankbaar erkend voor technische assistentie tijdens de video-opnames en experimentele voorbereiding. We danken Eva-Maria Weiss voor hulp met het intracellulaire FOXP3-kleuringsprotocol en Elisabeth Suri-Payer en Nina Oberle voor het opzetten van het nTreg-isolatieprotocol. Matilda Eriksson en Peri Noori worden erkend voor laboratoriumbeheer.

Financiering: A.S. werd ondersteund door een Marie Curie Intra European Fellowship binnen het 7e Europese Communautaire Kaderprogramma, de Dr. Åke Olsson Stichting en KI-onderzoeksstichtingen; A.S. en J.T. werden ondersteund door een CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease)-subsidie, J.T. werd ondersteund door Vetenskapsrådet Geneeskunde en Gezondheid (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance en Stockholm County Council.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
All-trans retinoic acidSigma AldrichR2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7eBioscience17-4777-42
anti-human CD25 microbeadsMiltenyi Biotec130-092-983
anti-human CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified Biolegend302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified Biolegend317315
anti-human CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1BD Biosciences555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1BD Biosciences345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421BD Biosciences562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlugBD Biosciences555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis KitInvitrogen11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, heat inactivatedInvitrogen10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780  eBioscience65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00Let op: bevat paraformaldehyde. Kan ook worden gekocht in gecombineerde kit met antilichaam; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)Invitrogen35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit IIMiltenyi Biotec130-094-131
Human serum albumin 50 g/LBaxter1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-columnsMiltenyi Biotec130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μgeBioscience11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173BD Biosciences563464
Pasteur pipet plastic, individually packedSarstedt86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma AldrichP1585-1MG 
RapamycinEMD (Merck)553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CFR&D202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CFRnD240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931  
RPMI 1640 Medium Invitrogen72400-054 
Sodium butyrateSigma AldrichB5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolredLonza04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) Applied Biosystems4331182; assay ID: Hs01085834_m1Let op: bevat paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)Applied Biosystems4351370; assay ID: Hs04194366_g1  Let op: bevat paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mixApplied Biosystems4369514

Referenties

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152(2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474(2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90(2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Na ve CD4 T cellenTGF beta protocolflowcytometrie analyseqRT PCR analysemononucleaire cellen uit perifeer bloedisolatie met magnetische bolletjesFOXP3 expressieTreg differentiatiecelcultuur incubatie
In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.