Productie, kristallisatie en structuur bepalen van C. difficile PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Summary

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Abstract

Er zijn nieuwe therapieën nodig om Clostridium difficile infecties te behandelen die een grote bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid. De C. difficile metalloprotease PPEP-1 is een doelwit voor toekomstige ontwikkeling van remmers om de virulentie van het pathogeen te verminderen. Om biofysische en structurele karakterisering uit te voeren, evenals het screenen van remmers, zullen grote hoeveelheden zuiver en actief eiwit nodig zijn. We hebben een protocol ontwikkeld voor efficiënte productie en zuivering van PPEP-1 door het gebruik van E. coli als expressiegastheer, waardoor voldoende hoeveelheden en zuiverheid van eiwit worden verkregen voor kristallisatie en structuurbepaling. Bovendien kunnen met behulp van microseeding, sterk onderling verweven kristallen van PPEP-1 worden gekweekt tot goed geordende kristallen die geschikt zijn voor röntgendiffractie-analyse. De methoden kunnen ook worden gebruikt om andere recombinante eiwitten te produceren en om de structuren van andere eiwitten te bestuderen die intergrown kristallen produceren.

Introduction

Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties ^1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe '' epidemie '' of '' hypervirulent '' stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa ^2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven ^3. De symptomen variëren van ⁴ tot diarree pseudomembraneuze colitis ⁵ en de vaak fatale toxisch megacolon ^6.

Behandeling van CDAD is moeilijk als de virulente stammen zijn multiresistente en de herhaling is hoog ^7. Momenteel therapie omvat antibiotica metronidazol, fidaxomicine of vancomycine, of repetititief terugkerende gevallen fecale microbiota transplantatie. Nieuwe therapeutische strategieën zijn dringend nodig ^8. Er is enige vooruitgang is geboekt als het therapeutische monoklonaal antilichaam Bezlotoxumab, gericht op C. difficile toxine B ^9, heeft onlangs met succes geslaagd voor fase III klinische studies en is ingediend voor goedkeuring bij de FDA en EMA. Daarnaast worden nieuwe antibiotica getest momenteel in verschillende stadia van klinische proeven ^10.

Om een ​​effectieve behandeling van nieuwe therapeutische doelen moeten worden geïdentificeerd ontwikkelen. De recent ontdekte C. difficile protease proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) is een dergelijk veelbelovend doelwit, het gebrek aan PPEP-1 in een knock-out stam vermindert virulentie van C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 is een uitgescheiden metalloprotease ^12,13 splitsen twee C. difficile adhesinen hun C-terminus ¹³ waardoor aldus de hechtende bacteria van de menselijke darm epitheel. Daarom wordt betrokken bij het handhaven van het evenwicht tussen de vastzittende en beweeglijke fenotype van C. difficile. Om selectieve remmers te ontwikkelen tegen PPEP-1 en te begrijpen hoe het haar substraten erkent intieme kennis van de driedimensionale structuur is onontbeerlijk. We hebben loste het eerste kristalstructuur van PPEP-1 alleen en in complex met een substraat peptide ^14. PPEP-1 is de eerste bekende protease dat selectief splitst peptidebindingen tussen twee prolineresten ^15. Het bindt het substraat in een dubbelblinde wijze geknikte en stabiliseert via langere alifatisch-aromatische netwerk van residuen in de S-lus die de protease actieve plaats ¹⁴ omvat. Dit substraat bindingsmodus uniek is PPEP-1 en niet in menselijke proteasen date. Dit maakt het een veelbelovende drug target, en off-target effecten van remmers zeer onwaarschijnlijk.

Het ontwikkelen en het scherm selectieve PPEP-1 inwibitors in de toekomst een grote hoeveelheid zuiver en monodisperse PPEP-1 eiwit nodig. Teneinde voorts de wijze van binding van eerste remmers, co-kristalstructuren met PPEP-1 te bepalen zullen bepalen. In onze handen PPEP-1 produceert voortdurend vergroeide kristallen. Aldus hebben we een optimalisatieprocedure enkelvoudige diffractie kwaliteit kristallen van PPEP-1 kunnen produceren. In dit protocol beschrijven we in detail de productie, zuivering, kristallisatie en structuur oplossing van PPEP-1 ^14. We maken gebruik van intracellulaire expressie in Escherichia coli van een PPEP-1 variant ontbreekt de secretie signaalsequentie, affiniteitschromatografie en size exclusion chromatografie met het verwijderen van de zuivering tag, gevolgd door microseeding ¹⁶ in een optimalisatie scherm en structuurbepaling via zink single-golflengte afwijkende dispersie (zink-SAD) ^17. Dit protocol kan worden aangepast voor productie en structuurbepaling van andere eiwitten (bv </ Em> metalloproteasen), en in het bijzonder voor de productie van eiwitten vergroeide kristallen. Op verzoek, plasmide-DNA van het construct (pET28a-NHis-rPPEP-1) en diffractie gegevens kunnen worden verstrekt voor educatieve doeleinden.

Protocol

1. Klonen en Construct Ontwerp

1. Kloon het codon-geoptimaliseerde sequentie (voor E. coli) van C. difficile PPEP-1 zonder het signaalpeptide [aminozuren 27-220, hierna genoemd recombinant PPEP-1 (rPPEP-1) ^11] in de pET28a vector behulp NdeI en XhoI restrictieplaatsen (figuur 1) met een stopcodon bij het 3'-uiteinde (verkregen vector pET28a-NHis-rPPEP-1). Dit produceert een N-terminaal met 6XHis gemerkt eiwit (NHis-rPPEP-1) met een thrombine splitsingsplaats waardoor het verwijderen van het label tijdens de zuivering (Figuur 1). Het plasmide bevat een kanamycine resistentie cassette voor selectie. De primers die voor klonering worden elders ¹⁴ beschreven.

Figuur 1: Schematische weergave van construct pET28a-NHis-rPPEP-1 en SDS-PAGE analyse van Expression en alle zuiveringsstappen. (A) Vector kaart van NHis-rPPEP-1 gekloond in pET28a vector met behulp van NdeI / XhoI gemaakt met PlasMapper. (B) Schematische weergave van de NHis-rPPEP-1 construct (bovenste paneel) en het uiteindelijke construct na trombine-splitsing van de 6xHis-tag met de daardoor ontstane GSHM-sequentie aan de N-terminus (onderste paneel). SDS-PAGE analyse (C) van de expressie in BL21 (DE3) ster bij 37 ° C gedurende 4 uur en (D) van monsters van alle zuiveringsstappen (M: molecuulgewicht merker). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Expressie en zuivering van rPPEP-1

1. Expressie van NHis-rPPEP-1
   1. Make-up en autoclaaf LB (lysogenie bouillon) medium (10 g / l trypton, 5 g / l gistextract, 10 g / l NaCl, adjust op pH 7,5 met NaOH). Aangevuld met kanamycine sulfaat (50 ug / ml), direct voor gebruik (LB / Kan gemiddeld).
   2. Wordt geënt in een 200 ml 's nachts de cultuur van vers getransformeerd E. coli in LB / Kan medium. Kweek gedurende de nacht bij 37 ° C onder schudden bij 220 rpm.
   3. Op de volgende ochtend, controleer dan de OD ₆₀₀ (optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm) van het 's nachts cultuur. Inoculeer twee 2.8 L verbijsterd kolven met 1 L LB / Kan medium elk met de nachtelijke cultuur een OD ₆₀₀ van 0,1. Aangevuld met drie druppels waterige siliconenemulsie om overmatige schuimvorming te voorkomen. Kweek cellen bij 37 ° C onder schudden bij 180 rpm tot de _OD600 0,6 bereikt.
   4. Neem een pre-inductie monster voor SDS-PAGE analyse (equivalent van 1 ml van een kweek bij OD ₆₀₀ = 1); Voeg IPTG tot 0,5 mM eindconcentratie expressie van NHis-rPPEP-1 te induceren. Blijven groeien bij 37 ° C / 180 rpm gedurende 4 uur.
   5. Bepaal de OD ₆₀₀ in een 10x dilutie en neem een oogst monster (equivalent van 1 ml uit een cultuur bij OD ₆₀₀ = 1).
   6. Verzamel cellen door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Om overblijvende LB medium hersuspenderen celpellets van 1 liter kweek verwijderd in 40 ml TBS-buffer (Tris-gebufferde zoutoplossing: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl) en overbrengen naar een 50 ml centrifugebuis. Verzamel cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 10.000 xg en 4 ° C en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Analyseer expressie (totaal lysaten en oplosbare fracties) via SDS-PAGE ^18.
2. Zuivering van niet-gecodeerde rPPEP-1
   1. Neem 50 pi monsters van elke zuiveringsstap voor SDS-PAGE-analyse. Resuspendeer de celpellet van 1 liter cultuur in TBS-buffer, aangevuld met 10 ug / ml DNasel. Gebruik 5 ml TBS / DNaseI per gram cellen.
      1. Lyse van de cellen door sonicatie op ijs / water met behulp van 30% amplitude gedurende 15 min (2 sec pulsen met 2 seconden pauze). Verwijder puin door centrifugation gedurende 10 min bij 10.000 xg en 4 ° C en overdracht supernatant een ultracentrifuge buis. Heldere lysaat in een ultracentrifuge gedurende 30 min bij 165.000 xg en 4 ° C.
   2. Werken bij 4-6 ° C. Met behulp van een peristaltische pomp of chromatografiesysteem equilibreren 2 ml nikkel-nitrilotriazijnzuur (NiNTA) hars in een glazen kolom met TBS-buffer, aangevuld met 10 mM imidazol pH 7,5. U kunt ook gebruik maken van de zwaartekracht flow.
      1. Stel de geklaard lysaat met 1 M imidazol pH 7,5 tot een eindconcentratie van 10 mM. Breng het lysaat op de kolom en was stapsgewijze met TBS-buffer, aangevuld met 10 mM en 30 mM imidazool, respectievelijk, totdat de UV-absorptie bij 280 nm de basislijn bereikte.
      2. Elueer het eiwit met TBS-buffer plus 250 mM imidazool. Re-equilibreren de kolom TBS dat was aangevuld met 10 mM imidazool en bewaar overnacht.
   3. Bepaal de eiwitconcentratie hetzij bij 280 nm met behulp van de extinctie coefficiënt van 25.900 ^{M-1 cm-1} of enige andere methode (bijv Bradford methode ^19). Voeg 2 eenheden trombine per mg eiwit en dialyseer de eiwitoplossing gedurende de nacht bij 4 ° C tegen een 50x volume TBS (50x van de NiNTA elutievolume).
      LET OP: Neem de juiste leeg voor de bepaling van eiwitconcentratie, zoals imidazool sterk absorbeert bij 280 nm.
   4. Passeer de eiwit oplossing over het evenwicht gebracht NiNTA hars om niet-geknipte eiwit te verwijderen. Breng vervolgens hetzelfde volume TBS dat was aangevuld met 10 mM imidazol aan de kolom om alle gesplitste eiwit herstellen. Om de kolom te reinigen, elueren alle resterende eiwitten met 250 mM imidazool. Analyseren monsters via SDS-PAGE (figuur 1).
   5. Concentreer de eiwitoplossing tot 4 ml in 10 min intervallen 4000 xg en 4 ° C onder toepassing van een centrifugale ultrafiltratie-eenheid. Meng de concentratie eiwit na elk interval precipitatie en aggregatie voorkomen. Bij deze stap af en toely sommige precipitatie wordt waargenomen voor rPPEP-1 ondanks de mengprocedure.
      1. Breng het geconcentreerde eiwit aan een vooraf geëquilibreerd size exclusion chromatografie kolom (in TBS buffer) bij 4-6 ° C. Elueer de kolom met TBS-buffer, 1 ml fracties te verzamelen en onder 5 gl per seconde aandeel SDS-PAGE-analyse. rPPEP-1 elueert in een enkele piek die overeenkomt met een monomeer (figuur 2). Soms een kleinere piek bij grotere molecuulgewicht waargenomen (fronting piek), die overeenkomt met een dimeer van het eiwit. De opbrengst moet ongeveer 50 mg zuiver eiwit per liter cultuur. Analyseer alle monsters via SDS-PAGE ¹⁸ (figuur 2).

Figuur 2: Representatieve size exclusion chromatografie en SDS-PAGE analyse van rPPEP-1. Size exclusion chromatogram (A280; absorptie bij 280 nm) van gezuiverd niet-gecodeerde rPPEP-1 met een (16/600) kolom in Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl bij 6 ° C. Gebaseerd op het elutievolume, rPPEP-1 migreert zoals verwacht voor een 22 kDa eiwit, wat suggereert dat het overwegend monomeer. Zelden een minder fronting piek blijkt dat correspondeert met een dimeer. (Inzet) SDS-PAGE analyse van fracties uit de chromatografie met gelpermeatie (M; molecuulgewichtsmerker). Elke tweede fractie wordt toegepast. De zwakke banden onder de belangrijkste rPPEP-1 band komen overeen met af en toe voorkomende kleine onzuiverheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Kristallisatie en Crystal Optimization Met behulp van Microseeding

OPMERKING: rPPEP-1 kristalliseert aan aandoeningen die voortdurend produceren zeer vergroeide kristallen niet geschikt voor X-stralen analyse (Figuur 3). Daarom is een optimalisatie strategie (figuur 4) is ontwikkeld om een hoge kwaliteit kristallen (figuur 5) te verkrijgen.

1. Eerste screening van rPPEP-1 met behulp van commerciële screens
   OPMERKING: Voer de kristallisatie proeven in de vergadering daling formaat met behulp van standaard in de handel verkrijgbare schermen en een kristallisatie robot.
   1. Concentreer het gezuiverde eiwit tot 12 mg / ml met behulp van een centrifugale ultrafiltratie-inrichting 5 minuten intervallen 4000 xg en 4 ° C. Meng de concentratie eiwit na elk interval precipitatie en aggregatie voorkomen. Bepaal de eiwitconcentratie hetzij bij 280 nm met behulp van de extinctiecoëfficiënt van 25.900 ^{M-1 cm-1} of enige andere methode (bijv Bradford-methode). Equilibreren het eiwit tot 20 ° C. Ruimen alle deeltjes en stof door centrifugatie gedurende 10 min bij 16.000 xg en 20 ° C.
   2. Ofwel maken al gebruik van voorgevulde kristallisatie platen seAled en bewaard bij 4 ° C of vul het reservoir putjes van de platen met 70 pl per kristallisatie aandoening. Equilibreren alle kristallisatie platen tot 20 ° C. Werk snel, omdat de kleine volumes snel uitdrogen. Gebruik een bevochtigingskamer rond het dok van de robot, indien mogelijk.
      OPMERKING: Gebruik de volgende schermen als een standaard procedure: SaltRx, Index, PEG / Ion, Crystal, Wizard, PACT ++, JCSG ++.
   3. Het opzetten van het scherm door pipetteren eiwit en reservoir in subwells 2-4. Drop volume is 300 nl en de verhoudingen (eiwit: reservoir) zijn 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) en 100: 200 (subwell 4) (in NL). Onmiddellijk sluit de plaat en plaats in een kamer bij 20 ° C.
   4. Inspecteer trays direct na het set-up, en dan te inspecteren elke dag tijdens de eerste week, gevolgd door wekelijkse inspectie.
2. Co-kristallisatie van rPPEP-1 met liganden
   1. Voor co-kristallisatie van substraat peptide-complexen rPPEP-1 mix rPPEP-1bij 24 mg / ml in een 1: 1 verhouding (v / v) met een 7-voudige molaire overmaat peptide oplossing (Ac-EVNPPVPD-NH ₂₎ gelyofiliseerd poeder opgelost in TBS buffer), waarbij een eindconcentratie van 12 geeft mg / ml r-PPEP-1 eiwit en een 7-voudige molaire overmaat peptide dan PPEP-1. Incubeer gedurende 30 minuten bij 20 ° C en opruimen alle deeltjes en stof door centrifugatie gedurende 10 min bij 16.000 xg en 20 ° C. Ga verder met behulp van de kristallisatie microseeding procedure als beschreven voor de ongebonden r-PPEP-1 eiwit.

Figuur 3: Vertegenwoordiger van kristallen van de eerste schermen. Vergroeide kristallen uit rPPEP-1 bij 12 mg / ml gekweekt in staat. (A) Crystal screen I / 38 (1,4 M natriumcitraat tribasisch uitdrogen, 0,1 M HEPES natrium pH 7,5; 200 nl: 100 nl). (B) SaltRx screen / 52 (2,4 M ammoniumfosfaat dibASIC, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) en (C) (200 nl: 100 nl). (D) SaltRx Zeef / 96 (60% v / v Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propaan pH 7,0; 200 nl 100 nl). De Schaal bar = 0,2 mm. Volumeverhoudingen zijn altijd eiwit: reservoir. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Optimalisatie procedure rPPEP-1 kristallisatie. Initial kristallen uit rPPEP-1 bij 12 mg / ml van lage kwaliteit diffractie en met meerdere roosters (vergroeide) werden overgenomen in een 24-conditie optimalisatie scherm. Opnieuw waren slechts vergroeide kristallen waargenomen in omstandigheden die 2,55 M ammoniumfosfaat dibasisch. Een uitgangsmateriaal werd bereid uit een enkele vergroeide kristal en verdund 1: 1000 in dezelfde Condition (microseeding). Een volume van 0,5 ul van de verdunde uitgangsmateriaal werd toegevoegd aan de resterende duidelijke dalingen en enkele kristallen groeide in bijna alle omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Crystal optimalisatie met behulp van microseeding
   OPMERKING: Highly vergroeide kristallen van rPPEP-1 verschijnen na twee dagen in een toestand die 2,4 M dibasisch ammoniumfosfaat, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (SaltRx scherm staat E4 alledrie subwells) (figuur 3). Een optimalisatie procedure gebruikt een raster scherm rond de beginvoorwaarde combinatie met microseeding werd aangebracht (figuur 4).
   1. Bereid een raster (afbeelding 4) omvat 24 voorwaarden 1,8-2,55 M ammonium dibasisch (in stappen van 0,15 M) en 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (in stappen van 0,5 pH-eenheden) van appropriaten voorraad oplossingen (4 M ammonium fosfaat en 1 M Tris buffers).
      OPMERKING: Gebruik de Make Tray applet (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) aan de volumes en het pipetteren regeling te berekenen tot 2 ml van elke aandoening die het mogelijk maakt om 10 optimalisatie schermen uit te voeren te verkrijgen. De 4 M ammoniumfosfaat voorraadoplossing moeilijk te bereiden. Verwarm de oplossing onder roeren om volledig op te lossen het poeder in water.
   2. Pipetteer 200 ul van elk raster schermoplossing in de putjes van een 24-wells plaat en equilibreren bij 20 ° C.
   3. Handmatig instellen van de kristallisatie plaat. De daling volume 3 pl en de verhoudingen (eiwit: reservoir) is 2: 1, 1,5: 1,5 en 1: 2 (in pl). Hier, gebruik dan een positieve verplaatsing pipet om luchtbel vorming te voorkomen. Onmiddellijk sluit de plaat en plaats in een kamer bij 20 ° C. Vermijd luchtbel vorming.
      NB: Na 1-4 dagen sterk vergroeide kristallen verschijnen in de vier voorwaarden met 2,55 M ammonium phosphate tweebasisch en 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (figuur 4). Geen kristallen gevormd in de overige 20 voorwaarden ammoniumfosfaat concentraties beneden 2,55 M. De microseeding procedure wordt gebruikt om eenkristallen van rPPEP-1 te verkrijgen onder deze omstandigheden.
   4. Bereid een microseed voorraad door oogsten één vergroeide kristallen van één van de twee gevallen met 2,55 M ammoniumfosfaat dibasisch en 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 of 8,5. De kristallen kunnen op het kunststof oppervlak worden bevestigd. Zorgvuldige vervorming van de omliggende kunststof met een acupunctuurnaald helpt om de kristallen los.
      1. Breng 50 pl van de respectievelijke moederloog in een 1,5 ml buis met een kleine hoogglans glasparels (beads-voor-zaden). Met behulp van een gemonteerde nylon lus overdracht van de kristallen in 1 pl van de moederloog geplaatst op een glazen deksel slide.
      2. Breng de vloeistof die de kristallen in de buis en vortex met hoge snelheid gedurende 30 seconden. Maak een 1:1000 verdunning van het uitgangsmateriaal in een nieuwe 1,5 ml buis die hetzelfde vers bereide toestand en vortex goed gedurende 5 seconden.
         LET OP: De Zaden van de voorraden kan worden opgeslagen bij -80 ° C voor later gebruik.
   5. Verwijder de afdichting van de plaat die de 20 omstandigheden met duidelijke dalingen en pipet 0,5 ul van het uitgangsmateriaal (1: 1000 verdunning) in de putten. Seal de plaat en plaats in een kamer bij 20 ° C. Single kristallen van hoge kwaliteit diffractie verschijnen in 2-7 dagen (Figuur 5).

Figuur 5: Representatieve kristallen uit optimalisatie scherm. Eenkristallen van rPPEP-1 bij 12 mg / ml geënt met 1: 1000-verdunning uitgangsmateriaal gekweekt onder de volgende omstandigheden: (A) 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 ul: 1,5 pl; (B) 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 pl: 1 pl; (C) 2,25 M ammoniumfosfaat dibasisch, 0,1 M Tris pH 8; 2 pl: 1 pl; (D) 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris pH 8; 1 pi: 2 pl. (E) gemonteerd kristal in 0,1-0,2 um nylon lus, gekweekt in 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris pH 8 (2 pi: 1 pl) en cryo-beschermd in 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris pH 8, 20% glycerol. De Schaal bar = 0,2 mm (AD). Volume rantsoen zijn altijd eiwit: reservoir. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Crystal Montage en Data Collection

OPMERKING: Voor het verkrijgen van de beste kwaliteit van diffractie gegevens kristallen moet op het hoogtepunt van hun kwaliteit en grootte worden gemonteerd. Kristallen kunnen worden opgeslagen in vloeibare stikstof totdat zij ARe onderworpen aan röntgendiffractie-analyse bij 100 K. Daarom moet de aandoening waaraan zij afkomstig aangepast aan cryo-omstandigheden. rPPEP-1 kristallen cryo-beschermd door toevoeging van ofwel 20% glycerol en 30% sucrose (vervanging van water in de toestand van het cryo-beschermende) zijn.

1. Crystal montage
   OPMERKING: Alle crystal manipulatie stappen moeten worden uitgevoerd onder de stereomicroscoop.
   1. De optimale grootte van nylon lus voor de maximale lengte van het gekozen kristallen. De typische langste as van rPPEP-1 kristallen ongeveer 100-200 urn (figuur 5). Bereid een cover glijbaan en de juiste cryo-aandoening (bijvoorbeeld 2,1 M ammonium dibasisch, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glycerol).
      1. Vul het schuim dewars met vloeibare stikstof, laadt de flacon klem met een flacon en pre-afkoelen in de vloeibare stikstof gevulde 800 ml schuim Dewar. Plaats een cryo huls en een cryo riet houder gemarkeerd met een geschikte identifierin vloeibare stikstof gevulde 2 L schuim Dewar. Laad de magnetische wand met een gemonteerde nylon lus.
         LET OP: Draag beschermende kleding (eyeshield / bril, handschoenen) bij het werken met vloeibare stikstof. Warme voorwerpen ondergedompeld in vloeibare stikstof kan lekkages veroorzaken.
   2. Opengesneden de afdichtingstape met een scherp scalpel en verwijder het met de tang. Pipetteer 1 pl van de cryo-toestand op de cover slide (of als alternatief in een lege put op dezelfde plaat) en verwijder het kristal uit de druppel voor de visserij met de gemonteerde nylon lus (figuur 5). Bijgevoegde kristallen kan eenvoudig worden losgemaakt van de grond door het vervormen van de omringende kunststof met een acupunctuur naald.
      1. Snel het kristal te dragen aan de daling van cryo-toestand en laat het equilibreren gedurende 1 seconde. Vis de kristallen zo snel mogelijk en duik-vries in vloeibare stikstof.
      2. Wanneer de vloeibare stikstof rond de gemonteerde loop stopt met koken, plaats de lus in de flacon.Plaats de flacon op de cryo stokhouder en wanneer geladen met 6 flesjes plaats een cryo huls rond de houder. Bewaar de kristallen in een tank gevuld met vloeibare stikstof tot gebruik.
2. Het verzamelen van gegevens
   LET OP: Het verzamelen van gegevens kan bij het huis diffractometer worden uitgevoerd, indien beschikbaar, of op een synchrotron bundellijn. Voor rPPEP-1 gegevens werden verzameld op de bundellijn X06DA van de Zwitserse Light Source, Paul-Scherrer-Instituut, Villigen, Zwitserland met een hybride foton tellen detector. De oorspronkelijke gegevens en alle bestanden die worden gebruikt in de structuur bepaling kan worden geleverd op aanvraag.
   1. Stel de golflengte van de bundel 1,282 A (9667 keV), die de karakteristieke röntgenstraal absorptierand energie (piek) van het element zink. rPPEP-1 is een metalloprotease dat een enkel zink per molecuul in de actieve plaats bevat.
   2. Gegevens verzamelen bij 100 K in de inverse straalmodus in 10 ° wiggen met een totaal van 270 ° in elke direction. De belichtingstijd bedraagt ​​0,1 sec met 0,1 ° rotatie per beeld. Zet de transmissie naar 14% (0,14).
   3. Een natief hoge resolutie dataset uit een tweede kristal afkomstig van dezelfde kristallisatie staat laat het instellen van de golflengte van de bundel 1,00 A (12.398 keV). Gegevens verzamelen bij 100 K. De belichtingstijd is 0,1 sec met 0,1 ° rotatie per beeld. Zet de transmissie tot 70% (0,7).

5. Structuur Bepaling via Zinc-SAD

Opmerking: Om de structuur van rPPEP-1 te bepalen via zink-SAD aantal fundamentele kristallografische kennis nodig en softwarepakketten XDS ^20, Phenix ²¹ en het programma Coot ^22. Voor de visualisatie van structuren van het programma PyMOL ²³ of Chimera ²⁴ nodig is. Gegevens verzameld bij de golflengte die overeenkomt met de piek van de absorptie rand van het element zink worden gebruikt voor één golflengte abnormale dispersie (SAD) ²⁵ tot fase-informatie die kan worden uitgebreid voor alle eiwitten atomen te verkrijgen.

1. gegevensverwerking
   1. Verwerk de twee datasets piek (gewone en inverse) met de software XDS (alternatief iMosflm of HKL3000) in ruimtegroep P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (ruimtegroep 19) scheiden mates Friedel's (afwijkende gegevens). De eenheidscelparameters moet rond a, b, c (A) = 43,17, 71,68, 117,70 en α = β = γ (°) = 90. Dit geeft twee HKL-bestanden (reflectie-bestanden).
   2. Controleer het bestand CORRECT.LP. Gebruik data van de resolutie waarin het CC _1/2 ten minste 50%. Schaal beide datasets / reflectie-bestanden (HKL-bestanden) met behulp van XSCALE elkaar. Controleer het bestand XSCALE.LP. Controleer hoe ver het abnormaal signaal verlengt (SigAno) en let op de resolutie met een afwijkende correlatie (anomal Corr) van ongeveer 30%, dat is 2 A in het geval van de hier gebruikte verzameld om 1,67 Å data. Dit is deresolutie cut-off voor de afwijkende signaal gebruikt in Phenix Autosol.
   3. Het converteren (schaal) HKL-bestand in een formaat CCP4 reflectie bestand (naam, bijvoorbeeld peak_anom.mtz) XDSCONV gebruik maken van een R _vrije deel van 5% en het houden van de afwijkende gegevens (FRIEDEL'S_LAW = FALSE). Controleer de MTZ-bestand voor de samenhang met het programma mtzdmp het inspecteren van de eenheidscel parameters, de ruimte-groep en het bestaan van de R _vrije deelverzameling (label FreeRflag) en de afwijkende gegevens (labels DANO / SIGDANO). Bereid ook een extra mtz-bestand XDSCONV zonder extractie van afwijkende gegevens (FRIEDEL'S_LAW = TRUE genoemd, bijvoorbeeld peak_native.mtz) voor verfijning later.
2. Onderbouw-oplossing (fase bepaling)
   1. Run Phenix Autosol met behulp van de reflectie bestand peak_anom.mtz. Selecteer SAD / MAD piek als type data en kies 2 zink sites (zoals er twee moleculen per asymmetrische eenheid). Kies voor de meer precieze experimentale waarden voor de f '/ f' 'parameters (bepaald in een fluorescentie-scan bij de bundellijn) of theotetical waarden f' = -8,245 en f '' = 3,887. Tevens laad het FASTA bestand met de aminozuursequentie van het gekristalliseerde eiwit.
   2. Stel de resolutie limiet aan de resolutie met een afwijkende correlatie (anomal Corr) van ongeveer 30% (bepaald in 5.1.2), in dit geval 2 Å en selecteer de optie "autobuild model". Met de fasen van de twee zink sites waarmee Phenix HySS (deel van de Phenix AUTOSOL pipeline) de fasen van de intacte eiwitten kunnen worden afgeleid en het model gebouwd (door Phenix RESOLVE) in de elektronendichtheid. Het beste model heet "overall_best.pdb".
3. Modelbouw, verfijning en validatie
   1. Selecteer de optie "autobuild model" de meeste rPPEP-1 model automatisch bouwen. Inspecteer de elektronendichtheid op 1,0 σ contour niveau met de program Coot (Figuur 6). Het moet bindweefsel en rond de atomen van het model. Idealiter ook een aantal watermoleculen worden ingebouwd in het model (met een resolutie beter dan 2,5 Å). Bulk water (ruimte tussen de moleculen) mag geen dichtheid bevatten.
   2. Controleren of het gehele model volledig is (alle aminozuren ingebouwd in de elektronendichtheid). Zo niet, dan bouwen ze handmatig met behulp van de tools die door Coot. Verfijnen van de structuur door het uitvoeren van iteratieve rondes van Phenix verfijnen met 5 verfijning rondes elk met behulp van het overall_best.pdb model bestand, het peak_native.mtz reflectie bestand en de FASTA volgorde file; en handmatige model gebouw in Meerkoet.
   3. Valideer de kwaliteit van het structurele model van de desbetreffende hulpmiddelen in koet.

Figuur 6: Experimentele elektronendichtheid kaart en model van rPPEP-1 na dePhenix Autosol lopen. Elektronendichtheid in het blauw aan een contour niveau van 1,0 σ weergegeven in het programma Meerkoet. In deze eerste kaart van de elektronendichtheid is mooi opgelost en het model te bouwen in de elektronendichtheid. De zoom in toont de residuen His142 en Glu189, evenals een watermolecuul. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Structuur vastberadenheid om met hoge resolutie via Molecular Replacement

LET OP: Om een ​​hoge-resolutie structurele informatie over rPPEP-1 een native dataset te verkrijgen wordt verzameld. Dan een vervangingsprocedure moleculaire met de software Phaser ^26,27 (binnen de Phenix softwarepakket) gebruikt met de structuur bepaald via zink-SAD als model. Deze procedure kan ook later worden gebruikt bij het oplossen van structuren van rPPEP-1 complex met kleine moleculen.

1. Een kristalstructuur met een hogere resolutie verkregen (in dit geval tot 1,4 A) verwerkt de natieve dataset met de software XDS (alternatief iMosflm of HKL3000) in ruimtegroep P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (ruimtegroep 19). De eenheidscelparameters moet rond a, b, c (A) = 43,17, 71,77, 117,80 en α = β = γ (°) = 90. Dit geeft een HKL-bestanden (reflectie bestand).
2. Controleer het bestand CORRECT.LP. Gebruik data van de resolutie waarin het CC _1/2 ten minste 50%. Zetten de HKL-bestand in een formaat CCP4 reflectie bestand (naam, bijvoorbeeld native.mtz) XDSCONV gebruik maken van een R _vrije deel van 5%. Controleer de MTZ-bestand voor de samenhang met het programma mtzdmp het inspecteren van de eenheidscel parameters, de ruimte-groep en het bestaan van de R _vrije deelverzameling (label FreeRflag).
3. Bereid de VOB-bestand met het model van overall_best.pdb eerder bepaald en verwijder alle watermoleculen en alle liganden (dwz. zink atoom). Tevens laad het FASTA bestand met de aminozuursequentie van het gekristalliseerde eiwit. Run Phaser in Phenix met behulp van de reflectie bestand native.mtz. Zoeken naar twee moleculen per asymmetrische eenheid.
4. Na een succesvolle structuur oplossing (TFZ-score groter dan 8; hier 10.2) inspecteren van het model (genaamd native_phaser.1.pdb) en de kaart van de elektronendichtheid in Meerkoet. Bouwen en verfijnen van de structuur door het uitvoeren van iteratieve rondes van Phenix verfijnen met 5 verfijning rondes elk met behulp van het native_phaser.1.pdb model bestand, het native.mtz reflectie bestand en de FASTA volgorde file; en handmatige model gebouw in Meerkoet.
5. Valideer de kwaliteit van het structurele model van de desbetreffende hulpmiddelen in koet.

Results

rPPEP-1 tot overexpressie wordt gebracht in verschillende E. coli-stammen, met de hoogste opbrengst in E. coli BL21 (DE3) Star (figuur 1C). Na de eerste NiNTA affiniteitschromatografiestap de 6xHis-tag met succes kan worden afgesplitst van de meeste eiwitten en in de tweede stap NiNTA onverteerde proteïne volledig worden gescheiden van trombine gedigereerde eiwit (figuur 1D). Op een S200 kolom 16/600 ongemerkte rPPEP-1 migreert als mono...

Discussion

Röntgenkristallografie blijft de snelste en meest nauwkeurige manier vast driedimensionale omgeving-atomaire resolutie structuren van eiwitten ^28. Het vereist echter de groei van geordende éénkristallen. Deze zijn vaak moeilijk te bereiken en de kristallijne toestand kunstmatig. Een vergelijking van eiwitstructuren bepaald met röntgenkristallografie met die bepaald met andere methoden, met name NMR, zich over het algemeen een goede overeenstemming. Bij PPEP-1, een NMR structuur onlangs gepubliceerd ²⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genen / Vectors / celstammen
pET28a vector	Merck-Millipore	69864	Thrombin afsnijdbaar N-terminaal His-tag
E. coli stam BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H-deficiënt
Codon-geoptimaliseerd gen (voor E. coli) van PPEP-1 (CD630_28300)	Geneart (Thermo Fisher Scientific)	aangepast	aminozuren 27-220
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicaliën
Gistextract	ieder
Trypton	ieder
Antischuim B	Sigma-Aldrich	A5757	water-silicone emulsie
Agar	ieder
Kanamycine	ieder
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	bufferkwaliteit
NaCl	ieder		bufferkwaliteit
DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazool	AppliChem	A1073	bufferkwaliteit
Thrombine	Sigma-Aldrich	T4648
Ammoniumfosfaat dibasicum	Sigma-Aldrich	215996
Glycerol 100%	ieder		zuiverste kwaliteit
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
Vloeibare stikstof	ieder		voor opslag en bevriezing van kristallen
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur (algemeen)
Schudende incubator	ieder		temperatuur van 20 °C - 37 °C
Glaswerk	ieder		baffled Erlenmeyer kolven (50 ml - 2,8 L)
Centrifuge voor grote kweekvolumes	ieder		centrifuge voor verwerking van volumes tot 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	of elke andere sonicator/cel-disruptor
Ultracentrifuge	ieder		centrifuge die snelheden tot 150.000 x g biedt
NiNTA Superflow hars	Qiagen
Lege glazen Econo-Column	Bio-Rad	7371007	of elke andere lege glazen of plastic kolom
Grootte-uitsluitingschromatografie kolom HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
Chromatografie systeem Äkta Purifier	GE Healthcare	28406264	of elk ander chromatografie systeem
Dialyseslang Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
Dialyseslang sluitingen	Spectrum Labs	132738
Ultrafiltratie units (concentrators) 10.000 NWCO	ieder
UV-Vis spectrofotometer	ieder
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur (kristallografie)
Laag volume pipet 0,1-10 µl	ieder
Positieve verplaatsing pipet Microman M10	Gilson	F148501
Kristallisatie robot	ieder
96-well kristallisatie platen TTP IQ met drie eiwit wells	TTP	4150-05810	of elke andere 96-well kristallisatie plaat
24-well CombiClover Junior Plate	Jena Bioscience	EB-CJR
Crystal Clear Sealing Tape	Hampton Research	HR3-511
Siliconized Glass Cover Slides	Hampton Research	HR3-225
Commerciële kristallisatie screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal	Hampton Research	diverse
Commerciële kristallisatie screens: Wizard, PACT++, JCSG++	Jena Bioscience	diverse
JBS Beads-for-Seeds	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (nylon lussen)	Hampton Research	diverse	lus groottes 0,025 mm - 0,5 mm
CrystalCap Vial	Hampton Research	HR4-904
Cryogenic Foam Dewar 800 ml	Hampton Research	HR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
Vial Clamp, Straight	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand Magnetic, Straight	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 Vial Holder	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane Color Coder - Wit	Hampton Research	HR4-713
Scalpel	ieder
Rechte microforcep	ieder		voor manipulatie van sealing tape. etc.
Naald voor acupunctuur	ieder		bijv. uit een apotheek
Stereo microscoop	ieder		voor inspectie van kristallisatie platen en kristal montage, vergroting tot 160X