Method Article

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van C. difficile PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

DOI:

10.3791/55022

⸱

December 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties 1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe '' epidemie '' of '' hypervirulent '' stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa 2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven 3. De symptomen variëren van 4 tot dia....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonen en Construct Ontwerp

  1. Kloon het codon-geoptimaliseerde sequentie (voor E. coli) van C. difficile PPEP-1 zonder het signaalpeptide [aminozuren 27-220, hierna genoemd recombinant PPEP-1 (rPPEP-1) 11] in de pET28a vector behulp NdeI en XhoI restrictieplaatsen (figuur 1) met een stopcodon bij het 3'-uiteinde (verkregen vector pET28a-NHis-rPPEP-1). Dit produceert een N-terminaal met 6XHis gemerkt eiwit (NHis-rPPEP-1) met een thrombine splitsingsplaats waardoor het verwijderen van het label tijdens de zuivering (Figuur 1). Het plasmide bevat een kanamycine resistentie c....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rPPEP-1 tot overexpressie wordt gebracht in verschillende E. coli-stammen, met de hoogste opbrengst in E. coli BL21 (DE3) Star (figuur 1C). Na de eerste NiNTA affiniteitschromatografiestap de 6xHis-tag met succes kan worden afgesplitst van de meeste eiwitten en in de tweede stap NiNTA onverteerde proteïne volledig worden gescheiden van trombine gedigereerde eiwit (figuur 1D). Op een S200 kolom 16/600 ongemerkte rPPEP-1 migreert als mono.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Röntgenkristallografie blijft de snelste en meest nauwkeurige manier vast driedimensionale omgeving-atomaire resolutie structuren van eiwitten 28. Het vereist echter de groei van geordende éénkristallen. Deze zijn vaak moeilijk te bereiken en de kristallijne toestand kunstmatig. Een vergelijking van eiwitstructuren bepaald met röntgenkristallografie met die bepaald met andere methoden, met name NMR, zich over het algemeen een goede overeenstemming. Bij PPEP-1, een NMR structuur onlangs gepubliceerd 29

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het personeel bij de bundellijn X06DA bij de Zwitserse Light Source, Paul-Scherrer-Instituut, Villigen, Zwitserland voor ondersteuning tijdens het verzamelen van gegevens synchrotron. We zijn dankbaar voor Monika Gompert voor een uitstekende technische ondersteuning. Het project werd ondersteund door de Universiteit van Keulen en verlenen INST 216 / 682-1 FUGG van de Duitse Research Council. Een PhD beurs van de International Graduate School in Development Gezondheid en Ziekte aan CP wordt erkend. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen uit de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Genes / Vectors / cell strains
pET28a vectorMerck-Millipore69864Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003RNase H deficient
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300)Geneart (Thermo Fisher Scientific)customamino acids 27-220
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Yeast extractany
Tryptoneany
Antifoam BSigma-AldrichA5757aqueous-silicone emulsion
Agarany
Kanamycinany
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087Buffer grade
NaClanyBuffer grade
DNaseIAppliChemA3778
ImidazoleAppliChemA1073Buffer grade
ThrombinSigma-AldrichT4648
Ammonium phosphate dibasicSigma-Aldrich215996
Glycerol 100%anypurest grade
SucroseSigma-Aldrich84097
Liquid nitrogenanyfor storage and cryocooling of crystals
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment (general)
Shaking incubatoranyproviding temperatures of 20 °C - 37 °C
Glasswareanybaffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)
Centrifuge for large culture volumesanycentrifuge for processing volumes up to 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500or any other sonicator / cell disruptor
Ultracentrifugeanycentrifuge providing speeds up to 150,000 x g
NiNTA Superflow resinQiagen
Empty Glass Econo-ColumnBio-Rad7371007or any other empty glass or plastic column
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
Chromatography system Äkta PurifierGE Healthcare28406264or any other chromatography system
Dialysis tubing Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
Dialysis tubing closuresSpectrum Labs132738
Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCOany
UV-Vis spectrophotometerany
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment (crystallography)
Low volume pipette 0.1-10 µlany
Positive displacement pipette Microman M10GilsonF148501
Crystallization robotany
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wellsTTP4150-05810or any other 96-well crystallization plate 
24-well CombiClover Junior PlateJena BioscienceEB-CJR
Crystal Clear Sealing TapeHampton ResearchHR3-511
Siliconized Glass Cover SlidesHampton ResearchHR3-225
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, CrystalHampton Researchdiverse
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++Jena Biosciencediverse
JBS Beads-for-SeedsJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT (nylon loops)Hampton Researchdiverseloop sizes 0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCap VialHampton ResearchHR4-904
Cryogenic Foam Dewar 800 mlHampton ResearchHR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2 LHampton ResearchHR4-675
Vial Clamp, StraightHampton ResearchHR4-670
CrystalWand Magnetic, StraightHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 Vial HolderHampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane Color Coder - WhiteHampton ResearchHR4-713
Scalpelany
Straight microforcepanyfor manipulation of sealing tape. etc.
Acupuncture needleanye.g. from a pharmacy
Stereo microscopeanyfor inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epid....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C difficile PPEP 1Protein CrystallizationMicroseeding TechniqueX ray DiffractionZinc SAD MethodRecombinant Protein ProductionCrystal Structure DeterminationAmmonium Phosphate ConditionsTris Buffer pHNylon Loop Mounting

Related Articles