Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Productie, kristallisatie en structuur bepalen van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn nieuwe therapieën nodig om Clostridium difficile infecties te behandelen die een grote bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid. De C. difficile metalloprotease PPEP-1 is een doelwit voor toekomstige ontwikkeling van remmers om de virulentie van het pathogeen te verminderen. Om biofysische en structurele karakterisering uit te voeren, evenals het screenen van remmers, zullen grote hoeveelheden zuiver en actief eiwit nodig zijn. We hebben een protocol ontwikkeld voor efficiënte productie en zuivering van PPEP-1 door het gebruik van E. coli als expressiegastheer, waardoor voldoende hoeveelheden en zuiverheid van eiwit worden verkregen voor kristallisatie en structuurbepaling. Bovendien kunnen met behulp van microseeding, sterk onderling verweven kristallen van PPEP-1 worden gekweekt tot goed geordende kristallen die geschikt zijn voor röntgendiffractie-analyse. De methoden kunnen ook worden gebruikt om andere recombinante eiwitten te produceren en om de structuren van andere eiwitten te bestuderen die intergrown kristallen produceren.
Inleiding
Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties 1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe '' epidemie '' of '' hypervirulent '' stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa 2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven 3. De symptomen variëren van 4 tot dia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Klonen en Construct Ontwerp
- Kloon het codon-geoptimaliseerde sequentie (voor E. coli) van C. difficile PPEP-1 zonder het signaalpeptide [aminozuren 27-220, hierna genoemd recombinant PPEP-1 (rPPEP-1) 11] in de pET28a vector behulp NdeI en XhoI restrictieplaatsen (figuur 1) met een stopcodon bij het 3'-uiteinde (verkregen vector pET28a-NHis-rPPEP-1). Dit produceert een N-terminaal met 6XHis gemerkt eiwit (NHis-rPPEP-1) met een thrombine splitsingsplaats waardoor het verwijderen van het label tijdens de zuivering (Figuur 1). Het plasmide bevat een kanamycine resistentie c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
rPPEP-1 tot overexpressie wordt gebracht in verschillende E. coli-stammen, met de hoogste opbrengst in E. coli BL21 (DE3) Star (figuur 1C). Na de eerste NiNTA affiniteitschromatografiestap de 6xHis-tag met succes kan worden afgesplitst van de meeste eiwitten en in de tweede stap NiNTA onverteerde proteïne volledig worden gescheiden van trombine gedigereerde eiwit (figuur 1D). Op een S200 kolom 16/600 ongemerkte rPPEP-1 migreert als mono.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Röntgenkristallografie blijft de snelste en meest nauwkeurige manier vast driedimensionale omgeving-atomaire resolutie structuren van eiwitten 28. Het vereist echter de groei van geordende éénkristallen. Deze zijn vaak moeilijk te bereiken en de kristallijne toestand kunstmatig. Een vergelijking van eiwitstructuren bepaald met röntgenkristallografie met die bepaald met andere methoden, met name NMR, zich over het algemeen een goede overeenstemming. Bij PPEP-1, een NMR structuur onlangs gepubliceerd 29
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken het personeel bij de bundellijn X06DA bij de Zwitserse Light Source, Paul-Scherrer-Instituut, Villigen, Zwitserland voor ondersteuning tijdens het verzamelen van gegevens synchrotron. We zijn dankbaar voor Monika Gompert voor een uitstekende technische ondersteuning. Het project werd ondersteund door de Universiteit van Keulen en verlenen INST 216 / 682-1 FUGG van de Duitse Research Council. Een PhD beurs van de International Graduate School in Development Gezondheid en Ziekte aan CP wordt erkend. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen uit de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenko....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Genen / Vectors / celstammen | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin afsnijdbaar N-terminaal His-tag |
| E. coli stam BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H-deficiënt |
| Codon-geoptimaliseerd gen (voor E. coli) van PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | aangepast | aminozuren 27-220 |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Chemicaliën | |||
| Gistextract | ieder | ||
| Trypton | ieder | ||
| Antischuim B | Sigma-Aldrich | A5757 | water-silicone emulsie |
| Agar | ieder | ||
| Kanamycine | ieder | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | bufferkwaliteit |
| NaCl | ieder | bufferkwaliteit | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazool | AppliChem | A1073 | bufferkwaliteit |
| Thrombine | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammoniumfosfaat dibasicum | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | ieder | zuiverste kwaliteit | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Vloeibare stikstof | ieder | voor opslag en bevriezing van kristallen | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur (algemeen) | |||
| Schudende incubator | ieder | temperatuur van 20 °C - 37 °C | |
| Glaswerk | ieder | baffled Erlenmeyer kolven (50 ml - 2,8 L) | |
| Centrifuge voor grote kweekvolumes | ieder | centrifuge voor verwerking van volumes tot 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | of elke andere sonicator/cel-disruptor |
| Ultracentrifuge | ieder | centrifuge die snelheden tot 150.000 x g biedt | |
| NiNTA Superflow hars | Qiagen | ||
| Lege glazen Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | of elke andere lege glazen of plastic kolom |
| Grootte-uitsluitingschromatografie kolom HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatografie systeem Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | of elk ander chromatografie systeem |
| Dialyseslang Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialyseslang sluitingen | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltratie units (concentrators) 10.000 NWCO | ieder | ||
| UV-Vis spectrofotometer | ieder | ||
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur (kristallografie) | |||
| Laag volume pipet 0,1-10 µl | ieder | ||
| Positieve verplaatsing pipet Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Kristallisatie robot | ieder | ||
| 96-well kristallisatie platen TTP IQ met drie eiwit wells | TTP | 4150-05810 | of elke andere 96-well kristallisatie plaat |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commerciële kristallisatie screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commerciële kristallisatie screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon lussen) | Hampton Research | diverse | lus groottes 0,025 mm - 0,5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - Wit | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | ieder | ||
| Rechte microforcep | ieder | voor manipulatie van sealing tape. etc. | |
| Naald voor acupunctuur | ieder | bijv. uit een apotheek | |
| Stereo microscoop | ieder | voor inspectie van kristallisatie platen en kristal montage, vergroting tot 160X |
Referenties
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
