Hoewel prolifererende polyploïde cellen noodzakelijk zijn om chromosomale instabiliteit van polyploïde cellen te analyseren, is het niet eenvoudig om dergelijke cellen te creëren vanuit niet-getransformeerde menselijke cellen. Het huidige rapport beschrijft relatief eenvoudige procedures om proliferatieve tetraploïde cellen te vestigen, vrij van een diploïde populatie, afkomstig van normale menselijke fibroblasten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels en hun chromosomale instabiliteit wordt beschouwd als verantwoordelijk voor carcinogenese in dergelijke weefsels. Hoewel prolifererende polyploïde cellen noodzakelijk zijn voor het analyseren van chromosomale instabiliteit van polyploïde cellen, is het creëren van dergelijke cellen uit niet-getransformeerde menselijke cellen vrij uitdagend. Inductie van tetraploïdie door chemische agentia resulteert meestal in een mix van diploïde en tetraploïde populaties, en de meeste studies maakten gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering of klonen door beperkte verdunning om tetraploïde van diploïde cellen te scheiden. Deze procedures zijn echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het huidige rapport beschrijft een relatief eenvoudig protocol om prolifererende tetraploïde cellen te induceren uit normale menselijke fibroblasten met minimale besmetting door diploïde cellen. In het kort bestaat het protocol uit de volgende stappen: het arresteren van cellen in mitose door demecolcine (DC), het verzamelen van mitotische cellen na afshakelen, het incuberen van verzamelde cellen met DC gedurende nog eens 3 dagen, en het incuberen van cellen in geneesmiddelvrij medium (Ze hervatten de proliferatie als tetraploïde cellen binnen enkele dagen). Afhankelijk van het celtype kan het verzamelen van mitotische cellen door afshakelen worden weggelaten. Dit protocol biedt een eenvoudige en haalbare methode om prolifererende tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten te etaleren. Tetraploïde cellen die met deze methode zijn opgezet, kunnen een nuttig model zijn voor het bestuderen van chromosoom-instabiliteit en het oncogeen potentieel van polyploïde menselijke cellen.
Inleiding
Polyploïdie waargenomen niet alleen in gespecialiseerde weefsels van zoogdieren maar ook in een verscheidenheid van pathologische aandoeningen, zoals kanker en degeneratieve ziekten. Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels, zoals de oesophagus of 1,2 squameuze intra-epitheliale laesies van de cervix 3,4 Barrett's en werden beschouwd als de bron van kwaadaardige aneuploïde cellen in deze weefsels 5 , 6. Ofschoon wordt voorgesteld omzetting van tetraploïde tot aneuploïde cellen een belangrijke gebeurtenis in de vroege stadia van tumorigenese kan zijn, worden de hierbij betrokken mechanisme niet volledig begrepen. Dit komt deels omdat er geen in vitro model beschikbaar is geweest, waar niet-getransformeerde polyploïde menselijke cellen kunnen voortplanten.
Sommige onderzoekers hebben veroorzaakt tetraploidy in niet-getransformeerde humane epitheelcellen door de generatie van binucleaire cellen door inhibiting cytokinese 7-9. Bij deze werkwijze echter onnodig diploïde cellen geëlimineerd worden door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 7,8 of kloneren door beperkende verdunning 9. Omdat deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren, eenvoudigere methoden voor het vaststellen getransformeerde tetraploïde cellen gewenst voor onderzoek op dit gebied.
In dit rapport beschrijven we een protocol om proliferatieve tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten of-telomerase onsterfelijk gemaakte humane fibroblasten vast te stellen door een relatief eenvoudige procedures. De procedures spil poison demecolcine (DC) aan diploïde cellen in mitose, en mitotische cellen door afschudden worden verder behandeld met DC verzameld arresteren. Diploïde mitotische cellen behandeld met DC voor langere tijd om te zetten in tetraploïde G1 cellen en deze cellen zich vermenigvuldigen als tetraploïde cellen na groeistop voor enkele dagen na verwijdering drug. Dit protocol biedteen efficiënte methode voor het maken van een bruikbaar model om de relatie tussen chromosomale instabiliteit en het oncogene potentieel van polyploïde menselijke cellen te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cultuur van de Cel
- Het verkrijgen van de cellen om tetraploidy induceren. Tot op heden is het bevestigd dat deze techniek kan worden toegepast op de humane fibroblast cellijnen TIG-1, BJ, IMR-90 en telomerase-geïmmortaliseerde TIG-1 (TIG-HT).
- Groeien cellen in minimaal essentieel medium met α wijziging of enig ander celkweekmedium geschikt voor het celtype te onderzoeken aangevuld met 10% (v / v) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) door incubatie in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Passage cellen elke 3 of 4 dagen niet subconfluente dichtheid overschrijden.
OPMERKING: populatieverdubbelingstijd level (PDL) wordt berekend telkens bij passage om celgroei en leeftijd evalueren. PDL kan worden berekend uit het aantal cellen gezaaid in een schaal (N1) en het aantal cellen geoogst bij de volgende passage (N2) met de volgende formule (X is de eerste PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. Inductie en Establishment van Tetraploïde Cellen uit diploïde fibroblasten
- Induceren tetraploidy zonder shake-off.
LET OP: Sommige mobiele stammen (bijv TIG-1) kan bijna volledig tetraploïde door continue behandeling worden met demecolcine (DC) als volgt.- Passage cellen in één of twee 100 mm schalen op de dag vóór de behandeling induceren tetraploidy. Meestal, voor te bereiden 5 x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen per schotel voor inductie van tetraploïde cellen.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen.
- Vervang DC-bevattend medium met drug-vrij medium en incubeer cellen in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Cellen meestal hervatten proliferatie binnen 1 week.
- Induceren tetraploidy met shake-off.
OPMERKING: De meeste cellen een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties als gevolg van de eenvoudige behandeling met DC hierboven (2.1) beschreven. Daarom enkele wijzigingen in de pROCEDURE te elimineren diploïde populatie nodig als volgt (figuur 1).- Passage cellen in meerdere T75 kolven op de dag vóór de behandeling te tetraploidy induceren. Meestal, voor te bereiden van ten minste 5 x 10 6 cellen (1 x 10 6 cellen per fles) voor de inductie van tetraploïde cellen.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 16-18 uur om cellen te arresteren in mitose. De tijd die nodig is om cellen in mitose arrestatie kan afhangen van doelcellen en worden bepaald door voorafgaande experimenten zoveel mitotische cellen te krijgen. Zo zou langzamer groeiende cellen worden behandeld met gelijkstroom gedurende langere tijd dan sneller groeiende cellen.
OPMERKING: als cellen behandeld te lang in deze stap, kunnen ze mitotische slippen ondergaan en zich aan de schotel oppervlak, waardoor het onmogelijk mitotische cellen door opschudding op te vangen in de volgende stap. - Verzamel DC-gearresteerd mitotische cellen door de shake-off methode, in which losjes aangehouden mitotische cellen worden verzameld door zacht schudden kolven en wassen met medium, gevolgd door centrifugeren (300 x g, 5 min). Tellen aantal cellen in geschikte omstandigheden in deze stap.
- Reseed verzameld mitotische cellen in 60 mm kweekschalen en behandelen cellen met 0,1 ug / ml DC gedurende nog 3 dagen. Zaad meer dan 1 x 10 6 mitotische cellen per schaal, omdat minder dan 10% van de cellen deze behandeling kan overleven.
- Vervang DC-bevattend medium met een drug-vrij medium en wacht tot cellen proliferatie, die meestal optreedt binnen 1 week te hervatten.
- Passage cellen vergelijkbaar met originele diploïde cellen.
3. Onderzoek van DNA Ploïdie
LET OP: Dit is een gevestigde procedure en een technische handleiding moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid.
- Harvest-cellen (5 x 05-01 oktober x 10 6) door incubatie van cellen met een oplossing conbevattende 0,05% trypsine en 0,02% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C en trypsine te neutraliseren door medium dat 10% FBS.
- Centrifugeer cellen in medium en wassen door resuspenderen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min).
- Bereid cellen voor DNA-analyse met één van de volgende twee methoden
- Werkwijze voor het analyseren van niet gefixeerde cellen 10
Opmerking: Deze methode kan worden uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare kit voor celcyclusanalyse. Monsters bereid met deze methode moeten onmiddellijk worden geanalyseerd, omdat de cellen niet in de procedure worden gefixeerd en gekleurd kernen zal beschadigd na verloop van tijd.- Was de cellen met 40 mM citraatbuffer met 250 mM sucrose. Vervolgens cellen te behandelen met 250 pl 0,1% (v / v) Nonidet P40 en 30 ug / ml trypsine in 200 ui 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 pl 0,5 ug / ml trypsine inwibitor en 0,1 ug / ml RNase A in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 ul van 0,4 mg / ml propidiumjodide (PI) in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur celkernen vlek.
- Werkwijze voor de analyse van gefixeerde cellen
- Fix cellen met 80% ethanol door het suspenderen van cellen in 1 ml PBS, het toevoegen van 4 ml 100% EtOH druppelsgewijs onder mengen de celsuspensie en laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Cellen in dit fixeermiddel kan meerdere weken bewaard bij -20 ° C.
- Was de cellen door ze te resuspenderen in 5 ml PBS, gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min). Behandel de cellen met 0,5 mg / ml RNase A en vlekken ze met 50 ug / ml propidiumjodide (PI) (475 pl 0,5 mg / ml RNase A en 25 ui 1 mg / ml PI) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Werkwijze voor het analyseren van niet gefixeerde cellen 10
- Analyseer DNA-gehalte van thij cellen met behulp van een flowcytometer met een 488 nm laser en rode kanaal emissie-filter (lange pass> 610 nm). Analyseren van een referentiemonster bereid uit echte diploïde cellen tegelijk te ploïdie van de doelcellen te beoordelen.
- Alternatief voeg fluorescentie standaard kralen om de fluorescentie-intensiteit verhouding van diploïde cellen versus de korrels beoordelen. Gebruik de 'pulse hoogte versus pulsbreedte' optie van de flowcytometer om onderscheid te maken tussen enkele tetraploïde cellen en massa's van diploïde cellen 11.
4. Onderzoek van chromosoom Telt en Karyotype Analyse
LET OP: Dit zijn allemaal gevestigde procedures en een technische handleiding of protocollen van de fabrikant moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met 0,1 ug / ml DC 4 uur om cellen te arresteren in metafase.
- Bereid chromosoom slides.
- Oogst cellen (tenminste 5 x 10 5 cellen) door behandeling met trypsine en op te schorten in medium met FBS.
- Centrifugeer cellen in medium (300 xg, 5 min) en behandel met hypotone oplossing (5 ml 0,075 M KCl) bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Fix en te schorten cellen in fixatief Carnoy's (methanol: azijnzuur = 3: 1).
- Cellen uitgespreid op een glasplaatje druppelsgewijs een klein volume (25-35 pi) van celsuspensie. Aanvullende stappen zoals blootstelling aan hete stoom kan nodig zijn chromosoom verbeteren verspreiden.
- Stain cellen voor chromosoom tellingen of karyotype analyse of multicolor fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH).
- Chromosoom telt.
- Stain cellen met 5% Giemsa-oplossing (of 5 ug / ml PI bevattende 0,5 mg / ml RNase A fluorescentiemicroscopie) gedurende 15 - 20 min.
- Digitaal fotograferen ten minste 50 metafase.
- Tellen aantal chromosomen per cel met behulp van een beeldanalyse Software na handmatige scheiding van het aanraken en overlappende chromosomen met behulp van een foto-editing software. Hoewel chromosoom nummer handmatig kan worden gescoord, wordt geautomatiseerd scoren aanbevolen.
- karyotype analyse
LET OP: Deze analyse moet worden uitgevoerd door een vakman of een professioneel bedrijf.- Stain cellen volgens een standaard G-banding techniek 12.
- Analyseer chromosomen standaard karyograms 12 te maken.
- mFISH
OPMERKING: Deze stap is optioneel en moet worden uitgevoerd indien nodig.- Vlek cellen met behulp multicolor FISH probes voor menselijke chromosomen volgens het protocol van de 13 fabrikant.
- Analyseer chromosomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte filters en software voor mFISH analyse 13.
- Chromosoom telt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In onze ervaring, kunnen TIG-1-cellen bijna volledig tetraploïde worden gemaakt door eenvoudige continue behandeling met 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen (Figuur 2A). Daarentegen andere fibroblast stammen, zoals BJ of IMR-90 en TIG-HT cellen, werd een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties na dezelfde behandeling, en isolatie van mitotische cellen door de schok uit staat moet in de loop DC behandeling (gewoonlijk 16-18 uur na de start van de behandeling) (figu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een groot probleem bij inductie van tetraploidy uit diploïde cellen door chemische middelen, door cytokinese remmers of spindel remmers, is dat cellen vaak een mengsel van diploïde en tetraploïde bevolkingen en tetraploïde cellen moeten worden gescheiden van diploïde cellen. De meest voorkomende methoden voor het isoleren van een tetraploïde bevolking vrij van diploïde cellen gebruiken FACS of het klonen door beperkende verdunning. Echter, deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren. In dit rapport...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.
Dankbetuigingen
Wij bedanken Mevrouw Matsumoto voor de technische assistentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | Voor onderzoek van DNA-ploïdie door flowcytometrie |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Gespecialiseerde filterset en software voor mFISH-analyse zijn noodzakelijk |
| Isis imaging system met mFISH software | MetaSystems | Gespecialiseerde sondekit is noodzakelijk |
Referenties
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
