Methodenartikel

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 februari 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier een isolatiemethode om humane endocervicale intra-epitheliale lymfocyten te verkrijgen voor de analyse van intra-epitheliale gamma delta T-cellen. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de zuivering van endocervicale gamma delta T-cellen door middel van magnetische kralen of door celsortering.

Samenvatting

Het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) mucosale afweersysteem dient als eerste verdedigingslinie. Betere kennis van de genitale slijmvliezen is daarom van essentieel belang voor het begrijpen van pathogeniciteit van verschillende ziekteverwekkers, waaronder HIV. Gamma'sdelta (GD) T-cellen zijn het prototype van onconventionele T cellen en vormen een relatief kleine subgroep van T-cellen gedefinieerd door hun expressie van heterodimere T-celreceptoren (TCR's) uit gamma- en delta ketens. Dit onderscheidt hen van de klassieke en nog beter bekend CD4 + helper T-cellen en CD8 + cytotoxische T-cellen die worden gedefinieerd door alfa-beta TCRs. GD T-cellen hebben vaak weefselspecifieke lokalisatie en verrijkt in epitheel. GD T-cellen orkestreren immuunresponsen bij ontsteking, tumor surveillance, infectieziekten en auto-immuniteit.

Hier presenteren we een methode reproduceerbaar isoleren en analyseren menselijke endocervicale intraepitheliale GD T-lymfocyten. we have gebruikt endocervicaal Cytobrush monsters van vrouwen die deelnemen aan de Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS). Kennis over GD T cellen interacties tijdens omstandigheden waarin er een belediging voor de vaginale mucosale kan worden toegepast op elk klinisch onderzoek waarbij mucosale kwetsbaarheid is gericht, inclusief de ontwikkeling van vaginale microbicides.In Bovendien kennis mucosale GD T celresponsen heeft toepassingspotentieel GD T-cellen gebaseerde immuuntherapie bij de behandeling van infectieziekten.

Inleiding

We ontwikkelden methode waarbij endocervicale borstel monsters intraepithelial GD T-cellen te evalueren. De endocervicaal kanaal is bekleed met een enkele laag van cilinderepitheel. Intra-epitheliale lymfocyten vertegenwoordigen frontlinie lymfocyten die woonachtig zijn binnen de epitheellaag die snel immuunreacties kunnen initiëren op het ontmoeten van pathogene micro-organismen 7, 8. Inzicht in de immunologische gebeurtenissen van endocervicale intra-epitheliale compartiment is belangrijk voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor infecties, waaronder HIV.

De methode kan worden toegepast vers verzameld menselijk endocervicale monsters en ingevroren endocervicale cellen de rol van intra-epitheliale GD T-cellen bij vrouwen met HIV-infectie of het risico loopt HIV-infectie verder te onderzoeken. Het belangrijkste doel van dit protocol is om nieuwe immunologische gebeurtenissen ontdekken in endocervicaal intraepithelial compartiment en evaluate GD T-cel responsen als een marker van mucosale kwetsbaarheid bij vrouwen met HIV-infectie.

De aanzienlijke lacunes in de kennis rond FGT immuniteit zijn deels te wijten aan de moeilijkheid in het succesvol verzamelen en verwerken van mucosale monsters. Bovendien is de complexe heterogeniteit van mucosale immune cellen en hun onderlinge verbondenheid met elkaar, zijn belangrijke uitdagingen voor klinisch relevante identificeren die de toestand en het vermogen van het immuunsysteem weerspiegelen. We ontwikkelden een methode om zeer gezuiverd intraepithelial GD T-cellen die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp sterk gemultiplexeerde, eencellig technologieën die kritiek zijn voor het identificeren van de onderliggende mechanismen van FRT immuniteit kan verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studieactiviteiten vond plaats aan de Universiteit van Miami HIV Research Unit, in samenwerking met de Miami Women's HIV Interagency Study (WIHS) en de Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universiteit van Miami Miller School of Medicine) goedkeuring werd voorafgaand verkregen de aanwerving en de beoordeling of studie gerelateerde procedures.

1. Endocervicale Brush Monsternemingsprocedure

LET OP: De deelnemers onderging een vaginaal onderzoek uitgevoerd door getrainde MD of gynaecoloog en het verzamelen van intra-epitheliale lymfocyten werden onder speculum onderzoek uitgevoerd door het invoegen van Cytobrush.

  1. deelnemer kenmerken
    1. Recruit vrouwen deelnemers die de leeftijd 18-45 jaar, seksueel actief, niet zwanger en niet op contraceptieve medicatie of met een spiraaltje.
    2. Voordat vaginaal onderzoek, hebben de deelnemers onderworpen aan een 10 ml bloed trekken in het groentop heparine vacutainers voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isolement. om te dienen als controle voor endocervicale intraepithelial analyse 9.
  2. Collectie van de endocervical monsters
    1. Plaats een steriele speculum van de juiste maat in de vagina zonder smering. Gebruik een warm water om het inbrengen van het speculum en steriel gaasje om het slijm schoon te vergemakkelijken. De positie van het speculum maakt het zichtbaar maken van de os en ectocervix.
    2. Steek endocervicale kwast in het endocervicale kanaal totdat alleen de haren die het dichtst bij de kant zichtbaar zijn. Draai de borstel met de klok mee voor de 360 ​​°. Breng de borstel in een 15 ml buis met 5 ml IMDM medium.
    3. Onmiddellijk na collectie, plaatst u de buis met Cytobrush op ijs. Om een ​​hoge levensvatbaarheid van verzamelde intra-epitheliale cellen te verkrijgen, leveren de Cytobrush naar het lab en proces binnen 1 uur.

2. Endocervicale Cytobrush Sample Processing

  1. Vortex buis met endocervical Cytobrush toepassing van 4 korte (10 sec) slagen.
  2. Centrifugeer de buis gemaakt met cytobrush, gedurende 10 min bij 250 x g.
  3. Verwijder voorzichtig de cytobrush van de buis (niet de pellet op de bodem van de buis te verstoren) en voeg 1 ml IMDM medium en plaats de buis op ijs.
  4. Plaats de cytobrush op 100 mm cel zeef bovenop de 50 ml buis.
  5. Was de cytobrush met 20 ml IMDM.
  6. Centrifugebuis gedurende 10 min bij 250 x g.
  7. Decanteer het supernatant en gepelleteerde cellen opnieuw te suspenderen in 1 ml IMDM en combineren met de reeds geresuspendeerd pellet in 2,3 beschreven.
  8. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celtelinrichting 10 of de telling van de cellen met behulp van hemocytometer door het combineren van 10 pi van de celsuspensie met 10 pi van trypan blauw kleurstof. Voorzichtig pipet op en neer tien keer om de cellen te mengen en kleurstof. Load 10 pivan het mengsel in de opening van een van de twee kamers hemocytometer. Tel alle cellen in het raster vijf gebieden. Houd een afzonderlijke telling van levensvatbare en niet-levensvatbare cellen. Bepaal de cellevensvatbaarheid met de volgende formule:% Levensvatbare cellen = Niet-levensvatbare cellen x 100 / totaal aantal cellen cellen.
    Bepaal de daaropvolgende celconcentratie per ml (en het totale aantal cellen) met de volgende berekeningen. Totale cellen per ml = totale cellen geteld x (verdunningsfactor / aantal getelde vierkant) x 10.000 cellen / ml.
  9. Freeze geïsoleerde endocervicale cellen via freezing medium dat 10% DMSO en 90% FBS.

3. Flowcytometrie

  1. Resuspendeer 1-3 x 10 5 endocervicale cellen in 100 pi FACS-buffer (PBS dat 1% runderserumalbumine
  2. Voeg 1 ul / 10 6 LEVENDE / DEAD opgelapt Yellow Dead Cell Stain kit en antilichamen voor oppervlakte markers op de in tabel 1 beschreven concentraties.
  3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
  4. Voeg 1 ml FACS buffer en de cellen en centrifugebuizen gedurende 5 min bij 350 xg
  5. Re-schorten cel pellet in 300 ui 1% paraformaldehyde.
  6. Bereid compensatie controles gebruikt kralen en antilichamen voor kleuring door toevoeging van 100 pi FACS-buffer en één druppel van de kralen en dezelfde concentratie van de antilichamen die voor monster kleuring.
  7. Verwerven in lood kralen en monsters op een flowcytometer, uitgerust met een 405 nm, 488 nm en 635 nm lasers.

4. Endocervicale Gamma delta T Cell Isolation

  1. Magnetische kraal isolatie
    1. Resuspendeer endocervicale celpellet (≤10 7 totaal cellen), beschreven in 2,6, in 40 pl buffer in de TCR gamma'sdelta microbead kit waarnaar in de tabel van Materialen en Reagentia.
    2. Volg de kit instructies voor de twee-staps kleuring protocol: eerst, with anti-TCR gamma delta hapteen-antilichaam en ten tweede, met anti-hapten microbolletjes-FITC
    3. Na incubatie van 15 min bij 4-8 ° C, was de cellen door toevoeging van 1 ml buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min. Schenk de bovenstaande vloeistof door het omkeren van de buis, en tik droog met behulp van een stuk papier.
    4. Resuspendeer de celpellet in 500 ul buffer ontvangen en bereidt de magnetische kolom door deze in geschikte magnetische scheider volgens het protocol van de leverancier.
    5. Toepassen celsuspensie op de kolom en laat ongelabelde cellen die passeren en waskolom 3x met geschikte hoeveelheid buffer (500 ui). Voer wasstappen door toevoeging van buffer driemaal, telkens wanneer de kolom reservoir leeg. Verzamel totale uitstroom. Dit is de niet-gemerkte, negatieve celfractie
    6. Verwijder de kolom vormen de magnetische separator en pipet 1 ml buffer op de kolom en onmiddellijk spoelen fractie met magnetisch labeled cellen door stevig aanbrengen van de met de kolom geleverde plunjer.
      LET OP: Geïsoleerde gamma delta T-cel zijn al fluorescent gekleurd voor flow-cytometrische analyse sinds magnetisch gemerkte anti-hapteen microbolletjes geconjugeerd met fluorescerende kleurstof FITC.
  2. celsortering
    1. Voor celsortering, label endocervicale cellen met levensvatbaarheid matrijs en antilichaam paneel zoals beschreven in paragraaf 3.
    2. Opgericht elektronische poorten op de live, CD45 + CD3 + en gamma-delta-positieve cellen en het uitvoeren van celsortering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Onlangs hebben we geanalyseerd endocervicaal intraepithelial GD T-cellen en we waren de eerste om te rapporteren over het verlies van endocervicale gamma-delta T-cellen in HIV-geïnfecteerde vrouwen 9, 11. We beschrijven het protocol te isoleren en analyseren van de subset van endocervicale gamma delta T cellen. Zoals getoond in figuur 1, kan GD T cellen gemakkelijk worden gedetecteerd in het humane endocervicale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Evaluatie van de vrouwelijke geslachtsorganen lagere slijmvlies kwetsbaarheid is een essentieel onderdeel van de klinische onderzoeken naar het risico van HIV acquisitie en transmissie. Typisch FGT gevoeligheid voor HIV-infectie wordt geëvalueerd door het meten van oplosbare immunomodulatoren in genitale afscheidingen (cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden) 12, 13. Echter, deze biomarkers zijn slechts een indicatie van de vaginale ontsteking, worden b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben geen commerciële of andere vereniging die een belangenconflict kunnen opleveren (bijvoorbeeld farmaceutische aandelenbezit, consultancy, adviesdiensten bestuurslidmaatschap, relevante octrooien, of de financiering van onderzoek).

Dankbetuigingen

Wij danken de Miami WIHS studie deelnemers voor hun bereidheid om deel te nemen aan dit werk. De gegevens in dit manuscript werden verzameld door de Miami Women's Interagency HIV Study (WIHS). De inhoud van deze publicatie zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health (NIH) te vertegenwoordigen. Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS) [subsidie ​​nummer U01 AI103397], Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, National Institutes of Health [subsidie ​​nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen en het Nationaal Instituut voor Minority Health and Health verschillen, National Institute of Health [subsidie ​​nummer UL1TR000460 en 1KL2TR000461], en het National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [subsidie ​​nummer K23HD074489].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cytobrush Plus GT (CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium ThermoFisher Scientific12440061
Beckman Coulter geautomatiseerde celteller (The Vi-CELL Series Cell Viability AnalyzerBeckman Coulter496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D2650
FBS, Fetal Bovine SerumInvitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigma AldrichA-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit Life Technologies,L349S9
1% paraformaldehydeSigma Aldrich D6148
Fortessa flow cytometer Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)Life TechnologiesA10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit Milteny Miltenyi Biotec Inc.130-050-701
MS kolom103-042-201
MACS scheider4124

Referenties

  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endocervicaal borstelmonsterisolatie met magnetische beadsfluorescentie geactiveerde cel sorteringTCR gamma deltaCD45 positieve cellenCD3 positieve cellenexpressie van levensvatbaarheids kleurstofforward side scatterplot

Gerelateerde artikelen