Methodenartikel

Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren

19.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

2 januari 2017

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

In dit artikel

Samenvatting

De monocyt monolaag assay (MMA) is een in vitro assay dat geïsoleerde primaire monocyten gebruikt, verkregen uit perifeer vol bloed van zoogdieren, om Fcγ receptor (FcγR)-gemedieerde fagocytose te evalueren.

Samenvatting

Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld voor het voorspellen van transfusie-uitkomsten van serologisch incompatibel bloed, is de monolaagmonocyte assay (MMA) een zeer veelzijdige in vitro test die kan worden aangepast om verschillende aspecten van antilichaam- en Fcγ receptor (FcγR)-gemedieerde fagocytose te onderzoeken in zowel onderzoeks- als klinische omgevingen. De test maakt gebruik van adherante monocyten uit perifere bloedmononucleaire cellen geïsoleerd uit kippebloed van zoogdieren. MMA is beschreven voor gebruik in zowel humane als muis onderzoek. Deze monocyten drukken FcγRs uit (bijv., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB en FcγRIIIA) die betrokken zijn bij immuunresponsen. De MMA benut het mechanisme van FcγR-gemedieerde interacties, met name fagocytose, waarbij antilichaam-gesensibiliseerde rode bloedcellen (RBCs) adhereren aan en/of FcγRs activeren en vervolgens worden fagocyteerd door de monocyten. In vivo voeren voornamelijk weefselmacrofagen die in de milt en lever worden aangetroffen, FcγR-gemedieerde fagocytose van antilichaam-opsoniseerde RBCs uit, wat extravasculaire hemolyse veroorzaakt. Door het niveau van fagocytose te evalueren met behulp van de MMA, kunnen verschillende aspecten van het in vivo FcγR-gemedieerde proces worden onderzocht. Enkele toepassingen van de MMA omvatten het voorspellen van de klinische relevantie van allo- of autoantilichamen in een transfusiesetting, het beoordelen van kandidaat-geneesmiddelen die fagocytose bevorderen of remmen, en het combineren van de test met fluorescente microscopie of traditionele Western immunoblotting om de downstream-signaleringseffecten van FcγR-engagerende geneesmiddelen of antilichamen te onderzoeken. Enkele beperkingen zijn de arbeidsintensiteit van deze techniek, die een volledige dag duurt van begin tot eind, en de vereiste goedkeuring van onderzoeksethiek om met zoogdierenbloed te werken. Echter, met ijver en adequate training, kunnen de MMA-resultaten binnen een 24-uurs omlooptijd worden verkregen.

Inleiding

De monocyte monolaag assay (MMA) is een in vitro test oorspronkelijk ontwikkeld om de resultaten van bloedtransfusies beter te voorspellen bij patiënten met auto- of allo-antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's)1-5. Door het effect van anti-RBC antilichamen in het mediëren van Fcγ-receptor (FcγR)-gemedieerde fagocytose te beoordelen met behulp van deze in vitro test, is het mogelijk om het klinische resultaat in vivo te voorspellen. Inderdaad, de MMA is met succes gebruikt om immuunvernietiging van antilichaam-gebonden RBC's te voorkomen, ondanks de transfusie van serologisch onverenigbaar bloed5. De typische pre-transfusie procedure voor compatibiliteitstesten, ook wel crossmatching genoemd, omvat serologische methoden die het typen van het bloed van de patiënt voor ABO- en Rh-antigenen omvatten en het screenen op de aanwezigheid van anti-RBC antilichamen bij de patiënt6. Bloed dat is afgestemd op ABO/Rh wordt geselecteerd, en als er antilichamen aanwezig zijn, wordt geprobeerd deze te identificeren, zodat bloed voor transfusie verder kan worden geselecteerd om deze antigenen te vermijden. Een ideaal crossmatch resultaat treedt op wanneer al het donorbloed serologisch compatibel is met het bloed van de patiënt, wat het risico op post-transfusie hemolyse vermindert7. Dit systeem is echter ontoereikend voor de kleine groep patiënten die geallo-immuniseerd zijn geraakt na herhaalde transfusie of zwangerschap. Deze patiënten produceren allo-antilichamen tegen specifieke RBC-antigenen. Sommige produceren antilichamen tegen antigenen van zeer hoge frequentie in de algemene populatie, en worden daarom steeds moeilijker om te crossmatchen8,9. Om de complexiteit te verhogen, zijn niet alle allo-antilichamen klinisch significant; met andere woorden, de binding van een allo-antilichaam aan RBC's gedetecteerd door een serologietest resulteert niet noodzakelijk in hemolyse wanneer antigeen-positief, onverenigbaar bloed wordt getransfundeerd. De MMA is oorspronkelijk ontwikkeld om de potentiële klinische betekenis van serologisch onverenigbaar bloed in een transfusie omgeving te beoordelen1-5.

Aangezien extravasculaire hemolyse van antilichaam-gebonden RBC's bekend is als gemedieerd door het mononucleair fagocyt systeem, worden primaire monocyten/macrofagen gebruikt bij de ontwikkeling van diagnostische tests. De eerste test om de interactie van monocyten, RBC's en antilichamen te bestuderen werd gepubliceerd in 1975, maar de sub-optimale omstandigheden die werden gebruikt leidden alleen tot roosvorming (de binding van RBC's aan de periferie van de monocyt), en er werd geen fagocytose waargenomen10. Er werden aanzienlijke aanpassingen aan de test gemaakt door verschillende groepen, wat leidde tot een test waarbij het niveau van fagocytose van allo-antilichaam-gebonden RBC's kon worden gecorreleerd met het klinische resultaat van hemolyse1-5. Recentelijk zijn de optimale bewaarcondities van klinische monsters en verdere optimalisatie van testomstandigheden onderzocht om de bruikbaarheid van een klinische MMA crossmatch met behulp van autologe patiëntmonsters te verbeteren11.

Naast de MMA zijn drie andere diagnostische technieken gebruikt om transfusieresultaten te voorspellen: de 51Cr release test, de roostest en de chemiluminescentie test (CLT). In de 51Cr release test wordt de patiënt geïnjecteerd met 51Cr-gelabelde donor RBC's, en de halfwaardetijd van de gelabelde RBC's wordt gemonitord en is voorspellend voor post-transfusie overleving of opruiming12,13. Omdat deze methode radioactieve materialen gebruikt, wordt deze zelden meer uitgevoerd. De roostest omvat het mengen en incuberen van monocyten met RBC's en het kwantificeren van het niveau van roosvorming (zonder fagocytose)14. De klinische betekenis van antilichamen in vivo omvat actieve fagocytose door macrofagen die in de milt en/of de lever worden aangetroffen; daarom biedt deze methode geen relevante weergave van fagocytose. De CLT gebruikt luminol om de oxidatieve burst tijdens monocytfagocytose van RBC te monitoren, aangezien luminol blauw fluoresceert wanneer het geoxideerd wordt in de fagosoom15. Deze methode is goed, maar besmetting door neutrofielen kan de uitlezing verwarren. Er zijn parallelle vergelijkingen gemaakt om de gevoeligheid, praktische bruikbaarheid en reproduceerbaarheid van de vier beschikbare methoden te evalueren, en zowel de CLT als MMA werden superieur geacht16. De CLT is echter voornamelijk gebruikt bij het beoordelen van hemolytische ziekte van de foetus en pasgeborene (HDFN), en de optimale pH van 8,0 van de test zou het niveau van fagocytose kunnen compromitteren11.

Naast zijn diagnostische en klinische bruikbaarheid, is de MMA aangepast voor andere onderzoeksdoeleinden. Inderdaad kan de MMA niet alleen dienen als een functionele test om discrepanties tussen serologie en biologie aan te pakken, het is ook gebruikt om retrospectief de oorzaak van hemolyse na intraveneuze immunoglobuline (IVIG) therapie te onderzoeken17. Het is ook gebruikt om de structuur-functie van chemische remmers van FcγR-gemedieerde fagocytose te onderzoeken18-20 en om de downstream signalering van FcγR-gemedieerde fagocytose te bestuderen21. In ons laboratorium ontwikkelen we, naast het gebruik van een menselijke MMA, een muis MMA met behulp van primaire muis perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) en autologe RBC's. De rationale is om antilichamen te screenen die FcγR-gemedieerde fagocytose kunnen induceren als een tussenstap bij de ontwikkeling van een in vivo auto-immuun hemolytische anemie (AIHA) muismodel (ongeplubliceerde gegevens). De verschillende aanpassingen zijn gericht op verschillende aspecten van de IgG-antilichaam en FcγR-interactie die fagocytose induceren.

Protocol

Het verkrijgen van goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters door de ethische raad van bestuur / institutionele review board, en het verkrijgen van ondertekend toestemming van alle menselijke donoren. De MMA kan ook worden uitgevoerd met PBMC muis op dezelfde wijze als de menselijke test na gebruik dierenethiek goedkeuring. De MMA maakt gebruik van aseptische weefselkweek technieken.

OPMERKING: Zie figuur 1.

LET OP: Hoewel we raden het gebruik van een level 2 biocontainment kabinet tijdens de test om aseptische techniek te behouden, als de methode is slechts een "short-term" cultuur-methode, is er niet echt genoeg tijd voor bacteriën om de test besmetten. Daarom, als een niveau 2 biocontainment kast niet bestaat, dan kopen alleen voor deze test, het assay kan worden uitgevoerd buiten een biocontainment kast, op een open bank. Het gebruik van een 37 ° C incubator met 5% CO 2 echter geen optie en moet worden gebruikt vooreen optimaal resultaat.

1. perifere mononucleaire Cell Isolation

  1. Verkrijgen van menselijk geheel bloed van een gezonde donor of een patiënt via venapunctie met behulp van vacutainers met zuur-citraat-dextrose (ACD) antistollingsmiddel (geel-top buizen).
    OPMERKING: Volbloed kunnen worden opgeslagen in ACD bij kamertemperatuur (18-22 ° C) gedurende 36 uur alvorens de volgende stap 11. Gewoonlijk 1-2 10 ml vacutainer buisjes volbloed voldoende voor de test.
  2. Verdun het geheel bloed 1: 1 v / v in warm compleet RPMI-medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 20 mM HEPES en 0,01 mg / ml gentamicine).
  3. Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) uit het verdunde volbloed met behulp dichtheidsgradiënt centrifugatie, zoals aanbevolen door de fabrikant (zie lijst van materialen). Laag het verdunde bloed langzaam via dichtheidsgradiënt (verwarmd tot kamertemperatuur, 18-22 ° C).
    OPMERKING: Beperk de hoeveelheid mixing van de interface voor de optimale scheiding van het bloed door voorzichtig lagen bloed mengsel druppelsgewijze of met behulp van een pipet.
    1. Laat het bloed mengsel langzaam laag over de bovenkant van de dichtheidsgradiënt door het plaatsen van de pipet tip nabij de dichtheidsgradiënt en doordat het bloed mengsel afstromen van de buis langzaam.
    2. Afhankelijk van de schaal van experiment laag 10 ml bloed mengsel boven 3 ml dichtheidsgradiënt (in een 15 ml buis) of laag 35 ml bloed mengsel bovenop 15 ml dichtheidsgradiënt (in een 50-mL buis). Kenmerkend 10 ml volbloed levert 10 miljoen PBMC, met enkele donor tot donor variatie.
      Opmerking: Het is zeer belangrijk dat er geen menging van het bloed mengsel met de dichtheidsgradiënt. Het bloed mengsel moet laag over de dichtheidsgradiënt en langzaam omhoog totdat al het bloed bovenop de dichtheidsgradiënt.
    3. Centrifugeer de gelaagde mengsel bij 700 g gedurende 30 min zonder remmen. de centrifuged mengsel moet scheiden in 5 lagen (van boven naar beneden): plasma, buffy coat (met PBMCs), dichtheidsgradiënt materiaal, granulocyten, en RBC.
    4. Verwijder de meeste plasma en nauwkeurig ophalen van de inhoud bufferlaag (PBMC) in een nieuwe 15 ml buis met behulp van een Pasteur pipet en een zuigingsbol.
      Opmerking: Het verwijderen van de buffy coat-laag effectief gedaan door te zuigen aan de Pasteur pipet tijdens het uitvoeren van een draaiende beweging rond de buitenkant van de laag, met de punt van de pipet tegen de buis.
  4. Was de geïsoleerde PBMC drie keer pH 7,3 fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugeren bij 350 g gedurende 10 min (vol remmen) tussen wasbeurten. Reconstitueer de PBMC pellet in volledig RPMI medium. Afhankelijk van de grootte van de pellet, 3-7 ml medium volstaat.
  5. Tel de PBMC met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Tellen alleen die cellen die niet zijn gekleurd door de trypan blauw. Reconstitute de PBMC's tot 1.750.000 cellen / ml in volledig RPMI medium.
  6. Seed 400 pi (700.000 cellen) in elk putje van een 8-kamer glijbaan. Incubeer de dia in een 37 ° C, volledig bevochtigde weefselcultuur incubator (aangevuld met 5% CO2) gedurende 1 uur om de monocyten / macrofagen te houden.

2. Pre-behandeling van Gekleefd Monocyten

LET OP: Deze stap is alleen nodig als op zoek naar manieren om de fagocytose remmen of te verbeteren.

  1. Pre-treat gehandeld monocyten met enige drug (s) of de verbinding (en) van belang. Reconstitueer het geneesmiddel (en) of ander testmateriaal om de gewenste concentratie met behulp volledig RPMI medium.
    Opmerking: Zo wordt 200 ug / ml IVIG doorgaans gebruikt om een ​​95-100% remming van fagocytose verkregen bij gebruik humane monocyten.
  2. Aspireren en gooi de supernatant die alle niet-hechtende cellen van de 8-kamer slide na de 1-uur incubatie (na stap 1,6). Vervang het met 400pl van een geneesmiddel of een andere behandeling en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    1. Bij het opzuigen en het vervangen van oplossingen in de 8-kamer glijbaan, zorg ervoor dat de stroom van de vloeistoffen te controleren, zodat zwak gehandeld cellen niet optillen. Ook werken met slechts 2-3 lege putjes tegelijk voorkomen en drogen van de putjes.
      LET OP: Typisch wordt elke behandeling uitgevoerd in technische drievoud.

3. opsonisatie van R2 R2 Red Blood Cells

OPMERKING: De R 2 R 2 hier gebruikt worden verkregen uit de bloedinzamelingscentrum (Canadese Blood Services), maar ze zijn ook commercieel verkrijgbaar. Opsonized R 2 R 2 RBC's worden gebruikt als een positieve controle voor FcyR-gemedieerde fagocytose. Naïve R 2 R 2 moeten tot 1 maand bewaard in Alsever's oplossing (verlengen houdbaarheid) bij 4 ° C. Alsever De oplossing wordt bereid in-house en samengesteld uit 0,8% W / v trinatriumcitraat (dihydraat), 1,9% w / v glucose, 0,42% w / v natriumchloride en 0,05% w / v citroenzuur (monohydraat). Als R 2 R 2 cellen niet beschikbaar zijn, andere Rh-fenotype cellen, zoals R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, R of R 2, kan worden gebruikt.

  1. Wash R 2 R 2 (CDE / CDE) rode bloedcellen in PBS totaal driemaal met gebruikmaking van centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk.
    Opmerking: Het aantal RBC's nodig afhankelijk van de experimentele groot en terug berekend. Was altijd een overmaat RBCs, aangezien RBC bouwen na elke wasbeurt door lysis of tijdens het verwijderen van supernatant. Bijvoorbeeld, in een experiment met 5 behandelingen en 2 controles, uitgevoerd in triplo technische, er in totaal 21 putjes. 21 putjes met 400 ul / putje van 1,25% RBC mengsel blijkt dat 105 pi gepakte, opsonized RBC nodig. 200 pi van RBC moet aanvankelijk worden gewassen en 150 & #181; L moeten worden opsonized om ervoor te zorgen dat er een voldoende hoeveelheid rode bloedcellen voor de fagocytose stap.
  2. Opsoniseren het gewassen R 2 R 2 pellet met 1: 1 v / v polyklonale anti-D antilichamen uit humaan serum en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met periodiek mengen.
    OPMERKING: Indien polyklonale anti-D-antilichamen beschikbaar zijn, is het mogelijk om monoklonale anti-D antilichamen, die commercieel verkrijgbaar zijn, of anti-D dat gewoonlijk wordt gebruikt voor Rh immuun profylaxe, die kunnen worden verkregen bij bloedbanken of transfusie gebruiken diensten. Optimalisatie tests moeten worden uitgevoerd in het begin, bij het opzetten van de test, en wanneer wordt overgeschakeld veel-un getitreerd polyklonale antilichamen of over te schakelen naar een monoklonaal antilichaam. Dit is de optimale concentratie of het volume van anti-D vereist voor antiglobulinetest (IAT) gevolge van tussen 3+ en 4+ en fagocytose gevolg van tussen 70-90 gefagocyteerde erytrocyten per 100 monocyten geteld identificeren.
  3. Was de opsoniserend R 2 R 2 in totaal drie keer in PBS middels centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Succesvolle opsonisatie van R 2 R 2 kan worden bevestigd door het uitvoeren van een indirecte IAT. Kort samengevat worden secundaire polyklonaal anti-humane antilichamen toegevoegd aan primaire opsoniserende antilichamen binden aan RBC oppervlakken, en het versterkte signaal in de vorm van hemagglutinatie worden waargenomen. Een gedetailleerd fabrikant protocol is te vinden in de aanvullende materialen bestand.
  4. Reconstitueer het gewassen R 2 R 2 pellet tot 1,25% v / v behulp volledig RPMI medium.
    OPMERKING: Excess geopsoniseerde R 2 R 2 kunnen voor tot een week opgeslagen in oplossing Alsever bij 4 ° C.

4. Fc Receptor-gemedieerde fagocytose

  1. Zuig het geneesmiddel of medium supernatant van de 8-kamer glijbaan en voeg 400 ul van 1,25% v / v R 2 R 2 mengsel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  2. achteruiter 2 uur incubatie, verwijder de kamers met behulp van adapters van de fabrikant. Dep het overtollige R2 R2 op een papieren handdoek. Zorg ervoor dat de dia niet uitdroogt.
  3. Vul een 100 ml bekerglas met PBS. Onderdompelen en was de schuif door langzaam de slede heen en weer (ongeveer 30-40 slagen) het merendeel van de niet-gefagocyteerd R 2 R 2 verwijderen.
  4. Verwijder de dia uit de PBS. Dep het overtollige PBS met behulp van een papieren handdoek of een tissue en air-droog de glijbaan.
  5. Bevestig de lucht gedroogd slide in 100% methanol gedurende 45 s. Dan, air-droog de vaste glijbaan.
    OPMERKING: slides kunnen worden gefixeerd met een andere methode die meer geschikt voor stroomafwaartse kleuring, zoals de Grünwald-Giemsa-kleuring 21 of Wright-Giemsa-kleuring 22.
  6. Monteer de dia met behulp van een in-house gemaakt Elvanol montage medium (of een ander in de handel verkrijgbaar montage gemiddeld) en voeg dekglaasjes.
    OPMERKING: Elvanol fixeermiddel bestaat uit 15% w / v polyvinyl alcohol hars en 30% v / v glycerol in PBS. Het mengsel wordt verhit totdat de hars is opgelost en de glycerine is homogeen gemengd. Deze kan worden vervangen door andere commercieel verkrijgbare fixeermiddel.
  7. Laat de mount nacht drogen voordat kwantificering.

5. Kwantificering van fagocytose

  1. Met behulp van een fasecontrastmicroscoop en een 40X objectief handmatig de hoeveelheid fagocytische gebeurtenissen gekwantificeerd door het tellen van minimaal 200 monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 binnen deze monocyten. Laat een teller in elke hand gelijktijdig het aantal monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 kwantificeren.
  2. Verkrijgen van de gemiddelde fagocytose index van het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 te delen door het aantal monocyten en vermenigvuldigen met 100. Express de gegevens als de gemiddelde (gemiddelde fagocytische index) ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM).

Resultaten

Door de cruciale stappen in figuur 1 en de hierboven beschreven procedure, kan de MMA reproduceerbaar uitgevoerd. IVIG werd als voorbeeld voor de remming van fagocytose in figuur 2. IVIG is bekend te binden en blokkeren de Fc receptoren, waardoor de stroomafwaartse resultaat van fagocytose remmen. Door het titreren van de hoeveelheid IVIG toegepast, wordt een dosisafhankelijke remming waargenomen, waarbij concentraties boven 200 pg / ml resulteerde in bijna 100% remming en concentraties lager dan 0,5 ug / ml remden helemaal (figuur 2A). Wanneer de fagocytische indices getransformeerd en genormaliseerd op R 2 R 2 positieve controle als 0% remming, een inhibitie kromme met een IC50 van 3 ug / ml kan worden vastgesteld (Figuur 2B).

Naast het uitvoeren van de test consequent, quantificatie van de test kan soms moeilijk zijn. Figuur 3 is een verzameling van fase-contrast microscopie beelden van verschillende MMA slides. Met microscopie ervaring kan men een monocyt van een verontreinigende RBC (figuur 3D), of een vacuole van een gefagocyteerde RBC (figuur 3B) onderscheiden. Dichte clusters van cellen en / of vuil moeten tijdens kwantificering (Figuren 3E en F) worden vermeden. Ook moet men vermijden van overmatig opsoniserende R 2 R 2 RBC, die tot verhoogde fagocytose de monocyt interieur overcrowds en interfereert met nauwkeurige kwantificering (Figuur 3C).

figure-results-1
Figuur 1. Schematische weergave van het MMA. Een stap-voor-stap afbeelding van de cruciale stappen in het MMA: isoleren PBMC uit volbloed, voeden de aangehechte monocytes met geopsoniseerde R 2 R 2, en wassen van de kamer schuift. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Intraveneuze IgG (IVIG) remt in vitro fagocytose met het MMA. IVIG is bekend fagocytose remmen en wordt gebruikt als een remming controle in het menselijk MMA. (A) Titratie van IVIG op een dosis-afhankelijke remming van fagocytose in vergelijking met de onbehandelde R 2 R 2 controle. De resultaten tonen het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van n = 3 experimenten. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Student t-test: ** P≤0.01 en *** p ≤ 0,001. (B) Remming curve van IVIG met een IC 50 of 3 ug / ml (stippellijn). De resultaten tonen gegevens genormaliseerd met onbehandelde R 2 R 2 (0% remming); gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Fase-contrast microscopie beelden van het monster dia's onder 40x vergroting. (A) De perfecte slede waarin de monocyten gefagocyteerd 1-2 R 2 R 2 gemiddeld (zwarte pijlen met een onderscheidende halogloed), met zeer weinig contaminerende, un-gefagocyteerde R 2 R 2 op de achtergrond (witte pijlen). (B) Zoals in deze dia, monocyten soms vergrote vacuolen (witte pijlen), die sterk op gefagocyteerde R 2 R 2 kan zijn. (C </ strong>) Wanneer R2 R2 zijn geweest over-opsonized, meer dan 4-5 gefagocyteerd R2 R2 per monocyten (zwarte pijlen) maken nauwkeurig tellen moeilijk, omdat de R2 R2 zijn druk in de monocyten en duidelijke cel grenzen niet kunnen worden onderscheiden. (D) Onvoldoende wassen van de dia leidt tot overvloedige R2 R2 contaminatie (witte pijlen), die verward gehandeld RBC zou kunnen zijn. (E) Soms, monocyten en verontreinigende RBC's kunnen clusters. Clusters geven ook bacteriële besmetting, moet worden voorkomen. (F) Monocyten kunnen grotere aggregaten, die in te kwantificeren vermeden vormen. Het gebruik van willekeurige selectie van de velden te bekijken, paneel A is wat wordt meestal waargenomen als de MMA goed is uitgevoerd. Schaal bar is 20 micrometer. Klik hier alsjeblieftvoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

MMA is een bewerkelijke techniek die expertise in zowel weefselkweek microscopie vereist. Er zijn een aantal kritische stappen om succes te garanderen: 1) generatie van de monocyten monolaag; 2) opsonisatie van de rode bloedcellen, en 3) manuele kwantificeren. De monocyt monolaag niet sterk hechten aan de kamer dia, zodat fysiologische pH moet gedurende de test 11 worden gehandhaafd en een voldoende aantal PBMCs worden gezaaid. Krachtig pipetteren, waarbij de aangehechte cellen kunnen verstoren, worden vermeden. Een benadering is altijd verwijderen en oplossingen toevoegen van dezelfde hoek van de kamer en dat de beweging langzaam en gestaag. Ook tijdens de laatste wasstap om het overtollige RBC's te verwijderen, de beweging moet langzaam en gestaag zijn. Hierdoor minimale verstoring van de monolaag terwijl het merendeel van de niet-gefagocyteerd RBC's te verwijderen. Onvoldoende wassen zal leiden tot een hoge achtergrond van verontreinigende RBC, die handmatig qua maaktntification moeilijk. Ten tweede moet de R 2 R 2 RBCs voldoende opsonized gemiddeld fagocytische index van 80-120 voor fagocytose controle te verkrijgen. Deze fagocytische gewenste bereik een evenwicht tussen gemak tellen (bijvoorbeeld monocyten meer dan 5 fagocytose RBC's zijn moeilijk nauwkeurig kwantificeren) en behouden van een voldoende hoeveelheid fagocytose voor statistische analyse. De mate van opsonisatie kan worden bevestigd door een IAT, en een lees- tussen 3+ tot 4+ nodig is. R 2 R 2 RBC's worden verwijderd wanneer er teveel lysis tijdens het wassen, wanneer het supernatans wordt donkerrood, of wanneer een significante afname van fagocytose waargenomen in experimenten vanwege de veroudering van de cellen opgeslagen. Ten slotte kan handmatig kwantificering met de microscoop lastig zijn, vooral bij het vergelijken van tellingen tussen laboratoriumpersoneel en tussen experimenten. Bij de behandeling van hetzelfde gebied op elk putje, of gewoon door het tellen van meer cellenEen consistentere telling kan worden verkregen. Side-by-side volgen en een ervaren technicus en het gebruik van een aangewezen aantal training slides aanbevolen.

Een belangrijke kritiek van de MMA is de subjectiviteit van de handleiding kwantificering stap. Echter, met een adequate opleiding, consistentie kan worden verkregen in de verschillende loketten. Een andere beperking is de intrinsieke donor tot donor verschillen in monocyten fagocytische capaciteiten en R 2 R 2 oppervlakteantigeen expressieniveaus, die een gegevensbron variatie bij de behandeling van menselijke monsters.

Andere alternatieve technieken beschikbaar voor de behandeling van FcyR-gemedieerde fagocytose. De meeste commerciële kits gebruiken fluorescerende uitgang fagocytose controleren (bijvoorbeeld bioparticles, pH-gevoelige fluorescentie-eiwit, of IgG-gemerkte fluorescerende latex bolletjes). Het gebruik van fluorescente productie aanbiedt objectiever kwantificeren, maar men moet ook conSider de beschikbaarheid, kosten en training van het gebruik van een fluorescentiemicroscoop of een flowcytometer, evenals de daaruit voortvloeiende afhankelijkheid van commercieel verkrijgbare kits.

Tenslotte kan deze test worden aangepast afhankelijk van de vraagstelling. Bijvoorbeeld bij het testen van remming van fagocytose, monocyten kan ofwel worden voorbehandeld of co-geïncubeerd met zowel middelen en geopsoniseerde RBCs (dwz een competitie assay). De stroomafwaartse signalering van antilichamen van verschillende subtypes, chimere antilichamen of recombinante constructen kunnen worden getest. Met recente vooruitgang in de ontwikkeling van een universeel antigeen-null bloed 24 kan de MMA in eerste schermen van deze antigeen-null RBCs met diverse antilichamen worden gebruikt om te beoordelen of er inderdaad een verminderde werkzaamheid bij triggering fagocytose.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Canadian Blood Services voor een Graduate Fellowship Program Award aan T.N.T. Dit onderzoek kreeg financiële steun van het Centre for Innovation van Canadian Blood Services, gefinancierd door de federale overheid (Health Canada) en de provinciale en territoriale ministeries van gezondheid. De opvattingen hierin weerspiegelen niet de opvattingen van de federale, provinciale of territoriale overheden in Canada.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acid citrate dextrose (ACD) vacutainersBDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
Fetaal bovien serumMulticell 080150
GentamicineGibco15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
Fosfaat gebufferde zoutoplossingSigmaD8537
8-kamer slidesLab-Tek-ll154534
R2R2 (cDE/cDE) rode bloedcellenCanadian Blood ServicesCommercieel verkrijgbaar (bijv., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyklonaal anti-D uit humaan serumGamma BiologicsDIN 02247724Kan worden vervangen door commercieel verkrijgbaar monoklonaal anti-D of Rh-immunoglobuline
100% methanolCaledon6700-1-42
PolyvinylalcoholharsSigmaP8136Kan worden vervangen door commercieel verkrijgbare montage
UltraPure glycerineInvitrogen15514-011
DekglasjesVWR48366 067
Novaclone anti-IgGImmucorgamma5461023Optioneel voor IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)

Referenties

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Herprints en machtigingen

Tags

Fc-receptorfagocytoseantilichaam-gemedieerde fagocytoseperifere mononucleaire bloedcellenopsonisatie van rode bloedcellenfasecontrastmicroscopiefluorescentiemicroscopieWestern immunoblottinginhibitie door intravenieuze immunoglobulinentransfusiemedijnsanalyse
Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.