In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Samenvatting

Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.

Samenvatting

Micro-analytische technieken gebaseerd op scheikundig element imaging inschakelen de lokalisatie en de kwantificering van chemische samenstelling op cellulair niveau. Ze bieden nieuwe mogelijkheden voor de karakterisatie van levende systemen en zijn met name geschikt voor het detecteren, lokaliseren en kwantificeren van de aanwezigheid van metaaloxide nanodeeltjes zowel in biologische monsters en het milieu. Inderdaad, deze technieken die alle voldoen aan desbetreffende eisen wat betreft (i) gevoeligheid (van 1 tot 10 µg.g^-1 van droge massa), (ii) micrometer bereik ruimtelijke resolutie, en (iii) multi element detectie. Gegeven deze kenmerken, microbeam scheikundig element imaging kan krachtig aanvullen routine beeldvormingstechnieken zoals optische en fluorescentie microscopie. Dit protocol wordt beschreven hoe een nucleaire microprobe-analyses uit te voeren op gekweekte cellen (U2OS) blootgesteld aan titaandioxide nanodeeltjes. Cellen moeten groeien op en direct in een speciaal ontworpen monsterhouder gebruikt op de optische Microscoop en de nucleaire microprobe analyse fasen worden blootgesteld. Duik-freeze cryogene fixatie van de monsters behoudt de cellulaire organisatie zowel de chemische elementdistributie. Gelijktijdige nucleaire microprobe analyse (scanning transmissie ion microscopie, Rutherford backscattering spectrometrie en deeltje geïnduceerde X-ray emissie) uitgevoerd op het monster bevat informatie over de cellulaire dichtheid, de lokale distributie van de chemische elementen, evenals de cellulaire inhoud van nanodeeltjes. Er is een groeiende behoefte aan dergelijke analytische instrumenten binnen de biologie, met name in de nieuwe context van Nanotoxicologie en nanogeneeskunde waarvoor ons begrip van de interacties tussen nanodeeltjes en biologische monsters moet worden verdiept. In het bijzonder, zoals nucleaire microprobe analyse geen nanodeeltjes worden geëtiketteerd vereist, zijn nanoparticle abundanties kwantificeerbaar zodat ze tot op het niveau van de afzonderlijke cel in een celpopulatie, onafhankelijk van hun oppervlakte staat.

Inleiding

Cellulaire homeostase wordt bepaald door de controle van de opname, assimilatie en intracellulaire lokalisatie van verschillende sporenelementen (ionen, metalen, exogene anorganische verbindingen). Deze onderdelen zijn vaak in de vorm van sporen, maar toch een aanzienlijke impact kunnen hebben in de Fysiologie van het systeem. De studie van biochemie van de cel in zowel normale als pathologische/benadrukt situaties is dus een sleutel-stap op weg naar een allesomvattend begrip van cellulaire metabole mechanismen. Daarom wordt de ontwikkeling van beeldvorming en analytische technieken waardoor het onderzoek van intracellulaire chemische abundanties, structurele organisatie en hun bijbehorende metabolische functies nodig. Er zijn zeer weinig methoden kunnen bieden van een in situ kwantitatieve stuk van gegevens betreffende de algemene chemische aard van een monster. Naast het analyseren van monsters in de vorm van bulk, analyses- in situ overwegen biologische monsters in hun volledigheid zonder verlies van massale en structurele informatie, waardoor het behoud van hun samenstellende chemische stoffen (sporenelementen en ionen) en eiwitten. Daarnaast, aangezien de nanowetenschappen ontwikkelen blijven, verbeterde beeldvorming en analysemethoden voor milieubewaking cellulaire duurzaame zullen nodig zijn om te observeren en te kwantificeren van nano-object gedrag en interacties. ¹

Nanodeeltjes (NPs) zijn gedefinieerd als objecten tentoonstellen van ten minste één gezicht dimensie in het bereik 1 en 100 nm. ² vanwege hun specifieke fysisch-chemische eigenschappen, NPs worden uitgebreid gebruikt in de industrie. NPs werkzaam zijn in de bio-toepassingen en in de nanogeneeskunde. ^{3 , 4} ondanks de talrijke fysisch-chemische eigenschappen van de NPs, kunnen ze genereren sommige risico's van nadelige effecten op de menselijke gezondheid en milieu. Deze risico's kunnen worden veroorzaakt door zowel langdurige en herhaalde blootstelling op verschillende concentratieniveaus en dit is nog niet duidelijk vastgesteld. ^{5 , 6 , 7 , 8} In het bijzonder, het lot van NPs binnen cellen en de bijbehorende cellulaire reacties zijn, tot op heden niet volledig beschreven. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de schaarste van methoden waarmee de opsporing en kwantificering van verinnerlijkte NPs in één cel. ⁹

De klassieke analytische instrumenten gebruikt om te schatten de cellulaire dosis van nanodeeltjes zijn microscopies, massaspectrometrie (MS), met inductief gekoppeld plasma (ICP-MS) MS^10,11 en vloeistofchromatografie die MS (LC-MS), maar ze alleen bieden nuttige informatie op de macroscopische schaal. Geen enkel van hen kan een precieze evaluatie van de subcellular NPs-inhoud, noch de verdeling van de NPs zonder het gebruik van fractionering methoden aan. Een systematische evaluatie van de dosis-respons is dus onmogelijk met deze methoden, in tegenstelling tot methoden die gebaseerd zijn op atomaire spectroscopie zoals nucleaire microprobe analyse^12,13, synchrotron Röntgen fluorescentie microscopie¹⁴ , en secundaire Ion massaspectrometrie (SIMS). ^{15 , 16} deze methoden zijn bijzonder interessant, aangezien ze als aanvulling op de opmerkingen die zijn gemaakt met behulp van fluorescentie microscopie, vooral wanneer NPs niet kunnen worden aangeduid met fluorescerende moleculen en dus in hun oorspronkelijke staat worden bestudeerd. Tot op zekere hoogte zelfs wanneer NPs zijn geënt met fluorophores, blijft (i) kwantificering moeilijk omdat de tagging niveau per NP onbekend is en (ii) de chemische modificatie van het oppervlak van NP de cellulaire verdeling kan wijzigen.

In dit artikel, we concentreren op een methode gebaseerd op een combinatie van nucleaire microprobe technieken die gericht zijn op de morfologie en de elementaire samenstelling van biologische monsters in majeur, mineur, imaging en concentraties te traceren.

Nucleaire microprobe analyse blijkt te zijn met name geschikt voor het meten van chemische sporenelementen in biologische weefsels. Zowel de lichtbundel laterale resolutie (0.3-1 µm) en de gevoeligheid in scheikundig element detectie (van 1 tot 10 µg.g^-1 droge massa) zijn geschikt voor studies op cellulair niveau. Nucleaire microprobe technieken zijn gebaseerd op deeltjes detectie (fotonen, elektronen, ionen) uitgezonden nadat de ion beam (meestal uitgevoerd bij MeV energieën) met atomen aanwezig in het monster interageert. Het gaat hoofdzakelijk om interacties in cellen: 1) excitatie/ionisatie van atomen, gevolgd door een emissie van fotonen nadat atomen terug naar hun fundamentele staat; en 2) diffusie van inkomende deeltjes leiden tot veranderingen in hun energie en richting. De meting van allowsthe identificatie van de energie van de uitgestoten deeltjes van atomen betrokken bij de interactie. Voor het uitvoeren van elementen in kaart te brengen, is de ion-microbeam herhaaldelijk gescand over het monster oppervlak, vaak over een oppervlakte van ongeveer 100 per 100 µm-² met verschillende cellen. Uitgestoten deeltjes worden gedetecteerd en hun energie wordt vastgelegd voor de positie van elke balk. Sorteren van de deeltjes volgens het standpunt van de bundel, is dus het identificeren van de structuur die verantwoordelijk is voor de uitstoot van deze deeltjes het doel van gegevensverwerking. Hier beschrijven we juist een aanpak op basis van fluorescentie microscopie en nucleaire microprobe analyse om te ontdekken, alsmede te kwantificeren van exogene NPs op de cellulaire en sub cellulaire schalen, om te onderzoeken van de gevolgen van NP interacties met levende systemen. We zullen met name richten op de mogelijkheden van deze methode in termen van in situ kwantificering van titaandioxide nanodeeltjes (TiO₂ van NPs) aggregaten subcellular niveau.

Protocol

1. houder monstervoorbereiding

1. Monster houder ontwerp en voorbereiding
   1. Een monsterhouder vervaardigen door het boren van een 5 x 5 mm vierkant in een 1 mm dikke PEEK frame.
   2. Schoon door spoelen met ethanol 70% (v/v) en bewaar in steriele platen tot klaar voor gebruik.
      Opmerking. Een monsterhouder geschikt is voor de cultuur van de cel en de cel behandeling is vereist. Het moet worden ontworpen voor cel kweken, in vitro waarnemingen met optische microscopie, en nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze houder is gemaakt van een frame PEEK¹³.
2. Bereiding van de houder van de monsters
   1. Bereid de oplossing van de Formvar door de ontbinding van 1 mg van Formvar poeder in 100 mL chloroform.
   2. Rekken de polycarbonaat folie op een metalen frame, zodat het geen vouwen presenteert.
   3. Een steriele tip gebruiken om de oplossing van de Formvar rond het monster houder gat.
   4. Fijn de monsterhouder met lijm op de uitgerekte polycarbonaat folie (een 5 x 5 mm vierkant) neergezet.
   5. Herhaal de vorige reeks een monsterhouder om voor te bereiden elke repliceren.
      Opmerking. De film van polycarbonaat (PC) is biocompatibel, dik genoeg en resistent zijn tegen de verschillende protocollen en analytische beperkingen.
      Let op- Chloroform is giftig. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.
3. Monster houder sterilisatie
   1. Plaats het gemonteerde monsterhouder in een conische kolf van 50 mL ethanol 70% (v/v) bij agitatie bij 180 rpm en +37 ° C's nachts, met behulp van een incubator/roerder.
   2. Spoel de houder meerdere malen in steriel gedistilleerd water.
   3. Lucht droog ze onder steriele omstandigheden en hen blootstellen aan het ultraviolette licht (kiemdodende lamp van bioveiligheid Bank, klasse II) gedurende 30 minuten aan elke kant.
   4. Houd de monsters in steriele 12-Wells-platen (een monsterhouder per putje) tot klaar voor gebruik.
      Opmerking: Meerdere houders van de steekproef kunnen worden achtergelaten bij kamertemperatuur in steriele en droge 12-Wells-platen verzegeld met parafilm voor meerdere dagen.

2. groei van cellen in de passende monsterhouder.

Let op: Protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid laminaire flow bankje (klasse II) uit te sluiten van contaminerende micro-organismen. Omgaan met antibiotica (bijvoorbeeld penicilline, streptomycine) met handschoenen. Respecteren van beste praktijken bij de verwerking van biologische materialen (cellijnen, genetisch gemodificeerde afgeleid menselijke cellen).

Kritische: de cellijnen die gebruikt moeten worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat zij niet zijn besmet met Mycoplasma.

1. Transfect U2OS cellijn met plasmide rekening houdend met Matrix-roGFP ^17,18,19 met behulp van een methode van de transfectie in overeenstemming met protocol vastgesteld door fabrikant.
2. Om te bevestigen van transfectie met de plasmide-uitvoering de biosensor en plasmide om verlies te voorkomen, selecteer en handhaven van transfected cellen op de juiste voedingsbodem.
3. Visualiseer transfected cellen door fluorescentie microscopie om ervoor te zorgen dat de transfectie is opgetreden en om de uitdrukking van de fluorescentie en de weergave van een netwerk van reticulaire en tubulaire mitochondriale¹⁹te bevestigen.
   Punt onderbreken: Cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof voor meerdere jaren.
4. Gebruik de transfected celpopulatie door het kweken van de cellen in een geschikte voedingsbodem om sub confluente cel populaties. Het groeien van cellen bij 37 ° C, 5% (v/v) CO₂ in de sfeer van een verzadigde water.
5. Zaad cellen in een concentratie, zoals ze zijn aan 80% samenvloeiing de dag van fixatie. Typisch, kan een concentratie van 500 cellen per µL worden gebruikt. Oogsten van cellen met behulp van 400 µL trypsine-EDTA 0,25% (v/v) en houden gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Stop trypsine actie met 1 mL gestolde voedingsbodem. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min op 230 x g en + 4 ° C, dan de bovendrijvende vloeistof verwijderen, en voeg de gewenste hoeveelheid verse kweekmedium.
   Opmerking. Het protocol is van toepassing op alle cellulaire typen en het aantal cellen die uitgezaaid is afhankelijk van de grootte van de cel en van cel tijd te verdubbelen.
   Let op: Vermijd onderwerpen trypsine, antibiotica en serum aan herhaalde bevriezen-ontdooien cycli. Houd ze steriel. De stockoplossing in aliquots verdelen en bevriezen ze bij −20 ° C. Bewaren de aliquots tot de vervaldatum. Spoel zorgvuldig de pellet cel om de trypsine volledig te verwijderen. Sporen van residuele trypsine zal vertragen en afname van de efficiëntie van de beplating.
6. Cellen tellen en het uitvoeren van een verdunning met verse volledige kweekmedium bewaard bij 37 ° C om het verkrijgen van een celsuspensie met 500 cellen per µL.
   Opmerking: De concentratie van de celsuspensie moet worden aangepast als een functie van het celtype, om een daling van 40 µL plaat.
7. Een daling van de 40 µL in het midden van de folie van polycarbonaat plaat. Breng de monsterhoeveelheid 2 h bij +37 ° C, 5% (v/v) CO₂ zorgvuldig in de sfeer van een verzadigde water.
   Kritisch: Zodra het monster is geplaatst in de incubator, zo veel mogelijk mechanische beweging om het voordeel van snelle cel bijlage beperken. Volgens het celtype zou het nodig zijn om te broeden cellen langer dan 2 uur voor optimale platting efficiëntie. Controleer verzadigd dat de incubator sfeer goed is om te voorkomen dat druppels verdampen.
8. Controleer of de cellen goed aangesloten op de folie van polycarbonaat met behulp van een optische Microscoop zijn. Zachtjes, voeg 2 mL verse compleet medium en houden gedurende 24 uur.

3. nanodeeltjes voorbereiding en blootstelling

Opmerking: Fluorescerende kleurstof gemodificeerde TiO₂ NPs werden ontworpen, gesynthetiseerd en chemisch gewijzigd met tetramethyl rhodamine isothiocyanaat (TRITC). ^{20 , 21} deze oppervlakte wijziging kunt nanoparticle detectie, bijhouden en localisatie in situ en in gnudles in zowel bij levende als vaste cellen of in meercellige organismen. ^{12 , 13 , 18}

Let op: Nanomaterialen en nanodeeltjes moeten met zorg worden behandeld. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Voorkom verspreiding in lucht en worden nanodeeltjes bijgehouden in de oplossing (ultrazuiver water).

1. Maak een suspensie van 1 mg.mL⁻¹ van^TiO₂ NPs in ultrazuiver water. De TiO₂ NPs met behulp van intensieve 1-min ultrasoonapparaat pulsen op RT verspreiden (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) met behulp van een ultra klankbron en een toegewijde conische microprobe.
2. Verdun TiO₂ NPs op de gewenste concentratie in het kweekmedium teneinde een opschorting van de blootstelling van de 4 µg.cm⁻² (eindconcentratie). Medium vervangen door het juiste volume van middellange met NPs op cellen en meng zachtjes voor homogene verdeling van de TiO₂ NPs. voorbereiden cellen ook zonder de toevoeging van TiO₂ NPs.
3. Incubeer de cel bevolking gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% (v/v) CO₂ en de sfeer van een verzadigde water.

4. paraformaldehyde fixatie en fluorescentie microscopie.

1. Bereid een verse oplossing van paraformaldehyde oplossing (PFA, 4% w/v) is gebufferd in fosfaat Buffer zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
   1. Los 4 g PFA poeder in 100 mL PBS. Verwarm de oplossing tot 65 ° C tijdens het roeren met behulp van een magneet en een magneetroerder in een zuurkast. Het verhogen van de pH door toevoeging van 1 M NaOH één druppel tegelijk, totdat de oplossing heeft geleegd. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en breng de pH op 7.4. De vers bereide oplossing direct gebruiken of bij + 4 ° C houden en beschermen tegen licht.
      Opmerking: Pre-en-klare PFA oplossingen kunnen worden gebruikt maar een vuist voorbereiding van PFA betere fixatie kwaliteit en instandhouding op lange termijn van de vaste monsters garandeert.
      Let op: PFA is giftig; Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.
2. Eens, de incubatietijd is verstreken, verwijdert u de cel-kweekmedium dat de TiO₂ NPs. Rinse de cel populaties eenmaal met verse kweekmedium en een keer met PBS (2 mL). Verwijderen van PBS, snel afspoelen met een aliquoot gedeelte van het vers en koud PFA (4% w/v, + 4 ° C).
   1. Voeg PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Laat 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
   2. Verwijder de PFA, spoel de cellen met PBS (2 mL 3 keer, 5 min) onder agitatie.
      Punt onderbreken: Deze chemisch vaste monsters kunnen worden gebruikt voor de "duik-freeze" procedure na fluorescentie imaging (go om stap 5) of alleen gebruikt voor fluorescentie imaging (go om stap 4.3).
3. Vlek de kern met Hoechst³³³⁴² broeden de cellen gedurende 10 minuten in PBS. Hoescht³³³⁴² wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 500 nM. Na incubatie het verwijderen van de oplossing en spoel met PBS.
   Let op: Hoechst³³³⁴² cel permeant en kan worden giftig. Vermijd direct contact, en het gebruik van handschoenen tijdens het bereiden en gebruiken van Hoechst³³³⁴².
   Kritische: ervoor zorgen dat de Hoechst³³³⁴² kleurstofoplossing vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden.
4. Proces vaste monsters voor in situ en eencellige geschikt zijn met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1).

5. "duik-bevriezing" fixatie en uitdroging

1. Bereid een aluminiumplaat van de overdracht door het in vloeibare stikstof koeling. Winkel de plaat in een doos gevuld met vloeibare stikstof en handhaven van het oppervlak van de plaat boven de vloeistof in de koude stikstof damp.
   Opmerking: De overdracht plaat kan bestaan uit een metalen plaat (hier, wij gebruikten aluminium) dat kon worden afgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof, en die de freeze-dryer monsterkamer kunt invoeren.
   Kritisch: Het vak moet worden gehouden gesloten zo veel mogelijk om te voorkomen dat water vapor deposition op de koude plaat oppervlak. Het monster opgeslagen op de plaat tijdens de voorbereiding moet niet worden gedekt door de vloeibare stikstof.
2. Spoel cellen eenmaal in cultuurmedium en vervolgens tweemaal meer, kort, in steriele en ultrazuiver water om ontdoen van elk spoor van resterende extracellulaire zouten.
   Kritisch: Ervoor zorgen dat de media vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden. Alle media bij 37 ° C verhit voordat zij worden gebruikt. Het spoelen moet heel kort (enkele seconden) en de overmaat vloeistof op de monsters zo snel mogelijk verwijderd.
3. Duik-freeze de cellen bij-150 ° C in vloeibare stikstof-gekoelde 2-methylbutane tijdens 30 s en plaats ze op de aluminium plaat overbrengen. Opslaan van monsters hier tijdens de voorbereiding van alle overige monsters. Wanneer monsters zijn alle cryofixed, transfer all-at-once door het plaatsen van de plaat van de overdracht in een freeze-droger.
   Kritisch: Het totale proces van de Cryofixatie moet niet meer dan 20 minuten duren om te voorkomen dat structurele wijzigingen in de monsters tijdelijk opgeslagen in het vak van de overdracht wordt weergegeven.
4. Freeze-Dry van de monsters met behulp van de volgende reeksen: 1) het uitvoeren van een primaire uitdroging voor 12 tot 24 h (-99 ° C, 10^-3 mbar) bij lage druk en lage temperatuur, dan 2) Voer een secundaire uitdroging fase gedurende ten minste 24 uur, verhoging van de temperatuur van de plaat aan + 40 ° C terwijl de lage druk (+ 40 ° C, 10^-3 mbar).
   Let op: Vloeibare stikstof is extreem koude en kan leiden tot ernstige bevriezing of oog schade bij contact. Gebruik aangepast Bank top containers voor vervoer en veiligheidsuitrusting (cryogene handschoenen, bescherming van ogen en gezicht) dragen.
   Let op: 2-Methylbutane is zeer licht ontvlambaar. Een schadelijke vervuiling van de lucht kan vrij snel worden bereikt over de verdamping van deze stof bij + 20 ° C. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Ademhaling en oogbescherming en beschermende handschoenen gebruiken. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast. Kunnen worden opgeslagen bij + 4 ° C.
   Kritisch: Gebruik een geschikte thermometer (-150 ° C) om te controleren de 2-Methylbutane temperaturen tijdens de "Duik-freeze"-sessie. De 2-methylbutane moet cool in een vloeibare fase worden bewaard. Overdracht van cryofixed monsters naar de omringende atmosfeer kan veroorzaken cellulaire schade als gevolg van de temperatuurstijging of waterdamp condenserend op het oppervlak van de steekproef. Bijgevolg moet worden overgeboekt zo snel als redelijkerwijs mogelijk (30 s)
   Punt onderbreken: Na Cryofixatie, kunnen de monsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor meerdere dagen in steriele en droge omstandigheden (beschermd tegen stof en vocht). Zorgvuldig omgaan met de monsters met een fijne Tang en plaats ze in een steriele 12-well plaat verzegeld met parafilm. Droogmiddel kan worden gebruikt voor het drogen van de atmosfeer.

6. nucleaire Microprobe analyse

Opmerking: Nucleaire Microprobe-analyse werd uitgevoerd op de lijn van de microbeam van AIFIRA (toepassingen Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions nl Région Aquitaine) via de aanvullende ion beam analytische technieken Particle geïnduceerde X-ray emissie (µ- PIXE) en Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM). De faciliteit is gebaseerd op een 3,5 MV deeltjesversneller lichte ion balken leveren in het energiebereik MeV. ^{22 , 23}

Punt onderbreken: AIFIRA is een ion beam faciliteit gehost door de Universiteit van Bordeaux, dat een toegang tot nationale en internationale teams na wetenschappelijke evaluatie van het voorgestelde experiment biedt.

1. Monteer de PEEK monster houders op een apertured plaat met behulp van dubbelzijdige tape.
2. Plaats de plaat ter ondersteuning van monster in een verticaal vlak loodrecht op de richting van de lichtbundel.
3. Sluit de analyse kamer en Stofzuig de kamer van de analyse.
4. Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM)
   Opmerking: STIM wordt gebruikt voor het opnemen van oppervlaktedichtheid kaarten van cellen na de conversie van energieverlies tot cellulaire massa, profiteren van het feit dat het energieverlies evenredig aan de oppervlaktedichtheid van monster is (uitgedrukt in µg.cm^-2).
   1. Gebruik een 2 MeV Helium (He⁺) microbeam als een sonde met een grootte in het brandvlak van rond 300 nm in diameter en bij lage spreekvaardigheid (2000 ions.s^-1). Maatregel de energie van de verzonden ionen met een vlakke silicium-detector (pitten detector, 25 mm², 11 keV energie resolutie @ 5.4 MeV), achter het monster in de as van de lichtbundel is geplaatst.
5. Deeltje geïnduceerde X-ray emissie (µ-PIXE) en Rutherford Backscattering spectrometrie (µ-RBS).
   Opmerking: µ-Pixe en µ-RBS analyses bieden de ruimtelijke verdeling en kwantificering van chemische elementen met een resolutie van sub micrometer.
   1. Gebruik een 1.5 MeV proton (H⁺) microbeam (50-150 pA), gericht tot een diameter van 1 µm en scan over dezelfde cellen van belang gespot door STIM van 4 tot 8 uur en ongeveer 100 x 100 µm².
   2. Geïnduceerde X-ray fotonen uitgezonden van atomen aanwezig in het monster (zwaarder dan nb) door een hoge resolutie Si(Li) solid-state detector (145 eV energie resolutie, @Mn-Kα) geplaatst op 45 ° uit de inkomende as van de lichtbundel te verzamelen. Gebruik de gedetecteerde foton-energie om de aard van de vervuilers (bijvoorbeeld Z van element) en X-ray intensiteit te bepalen van de concentratie van het element te identificeren.
   3. Achterwaarts-verstrooid protonen bij-135 ° gelijktijdig te verzamelen met een silicium-detector (gedeeltelijk verarmd detector, 25 mm², 11 keV FWHM @ 5.4 MeV) voor het meten van het totale aantal inkomende deeltjes en om te normaliseren X-ray intensiteiten.
      Kritisch: Een collectie van gecertificeerde kalibratie normen voor de kwantificering van de atomaire concentratie wordt gebruikt om het kalibreren van de detectorresponsie X-ray. Referentiematerialen zijn een collectie van dun atomaire films gestort op 6.3 µm dik Mylar-folie. X-Ray energieën variëren van 0.6 (Li, K line) tot 20,2 uitgestoten keV (Rh, K-lijn).

7. de gegevensanalyse

1. Chemische elemental kaarten met behulp van de IBA-J-plugin voor ImageJreconstrueren. ²⁴
   Opmerking: Speciale software in de vorm van een plugin voor ImageJ is ontwikkeld om ruwe nucleaire microprobe analysegegevens te verwerken. Ruwe gegevens komen overeen met een lijst van evenementen die voortvloeien uit de particle beam interactie met cellen die samen met de positie van de bundel als een chronologische volgorde zijn opgenomen.
   1. Gebruik de IBA-J plugin om gebeurtenissen volgens hun type sorteren: ion energie (STIM) overgebracht, terugverstrooide ion energie (RBS) of X-ray foton-energie (PIXE). Vervolgens verwerken afzonderlijk elk type gegevens.
   2. Berekenen van de dichtheid van de STIM selecteur
   3. Berekent gemiddelde X-ray foton energie spectra en definiëren voor elk scheikundig element van belang een energie-venster om op te halen van de ruimtelijke elementdistributie.
   4. Definiëren van de regio's van belang (ROI) (bijvoorbeeld afzonderlijke cellen, dichte structuur, aggregaten, enz.) en bereken de bijbehorende x-ray spectra.
2. De overeenkomstige RBS spectra analyseren om te berekenen van het totale aantal incident deeltjes²⁵.
3. Passen X-ray spectra met behulp van de Gupix software²⁶ om te bepalen van de concentratie van het element voor elke ROI.
   Opmerking: Typische detectiegrens (LOD) voor de methode is in het bereik 1 tot en met 10 µg.g^-1 in drooggewicht afhankelijk van het atoomnummer van elementen (LOD afneemt met Z).

Resultaten

Celkweek en fluorescentie beeldvorming van fluorescently geëtiketteerde TiO ₂ NPs

We ontwierpen een monsterhouder aangepast voor cultuur van de cel, cel behandeling alsmede multimodale analyse. Het was in het bijzonder belangrijk dat de houder routine optische microscopie toegestaan als goed als nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze monsterhouder is gebas...

Discussie

Beschrijven we een methode verstrekken van nuttige informatie dan wat mogelijk met andere beeldvormingstechnieken, met name op de subcellular niveau is. Naast haar imaging vermogen biedt nucleaire microprobe analyse ook mogelijkheden voor kwantificering van chemische elementen in te voeren in de samenstelling van een biologische steekproef. In het huidige werk, we onderzocht menselijke cel populaties en gericht tot de analyse van een gekozen gebied van belang op basis van een enkele cel blootgesteld aan TiO₂ N...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuur
U2OS	ATCC, LGC STANDARDS	ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A zonder L-Glutamine	Dominique DUTSCHER	L0211-500
FBS 500 mL	Dominique DUTSCHER	500105U
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	11548876
L-Glutamine 200 mM, 100 mL	Invitrogen	25030024
Geneticin,  20 mL	ThermoFisher Scientific	10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL	ThermoFisher Scientific	11570626
Viromer Red	Lipocalyx	VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid	AddGene	#49437
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Voorzichtig handelen
NP's voorbereiding
TiO2 P25 AEROXIDE	Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)	SIGMA-ALDRICH	T3163	Oppervlaktemodificatie van NP's
Steekproefvoorbereiding
Polycarbonaat folie	Goodfellow	CT301020
Polyether ether ketone ondersteuning (PEEK)	Matechplast	A-239-4047
Ethanol, ACS absoluut	SIGMA-ALDRICH	02860-6x1L
Chlorvorm, Anhydrous, 99%	SIGMA-ALDRICH	372978-1L	Let op giftig
Formvar 100 g	Agar Scientific	AGR1201	Schadelijk. Gebruik in een concentratie van 10 µg per mL chloroform
NaOH	SIGMA-ALDRICH	S5881-500G
Steekproeffixatie
Poeder, 95% Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500G	Let op giftig. Gebruik als een 4% oplossing in PBS
PBS (pH 7.4, zonder Ca2+ en Mg2+)	ThermoFisher Scientific	11503387
Prolong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific	P36934
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	93443	Schadelijk
Steekproef cryofixatie
Vloeibaar stikstof	air liquids sante		Schadelijk
Methylbutaan >=99%	SIGMA-ALDRICH	M32631-1L	Let op giftig
Aluminium overdrachtsplaat	Home-made
Gedistilleerd en gedeïoniseerd water	Home-made		Geproduceerd in het laboratorium met behulp van het Barnstead Smart2Pure-systeem
Parafilm	VWR	52858-000
Apparatuur
Barnstead Smart2Pure	ThermoFisher Scientific	50129870
Bioveiligheidsbench, klasse II	ThermoFisher Scientific	MSC-Advantage
TC20 geautomatiseerde celteller	Biorad	145-0102SP
Tellende glijbanen 2 welzen	Biorad	1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energieresolutie @5.5 MeV	Canberra	PD25-12-100AM
Hoge resolutie Si (Li) vaste-toestanddetector, 145-eV energieresolutie, @Mn-Kα	Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secundaire elektronendetector (SED)	Orsay Physics	1-SED
XRF kalibratie standaard natrium of Chloor als NaCl	Micromatter	34381
XRF kalibratie standaard Magnesium als MgF2	Micromatter	34382
XRF kalibratie standaard Aluminium als Al metaal	Micromatter	34383
XRF kalibratie standaard Silicium als SiO	Micromatter	34384
XRF kalibratie standaard Zwavel als CuSx	Micromatter	34385
XRF kalibratie standaard Calcium als CaF2	Micromatter	34387
XRF kalibratie standaard Titanium als Ti metaal	Micromatter	34388
XRF kalibratie standaard IJzer als Fe metaal	Micromatter	34389
Sonicator 750W	Sonics Materials	11743619
3MM microprobe	Bioblock scientific	220-05
Lyophilisator in vacuüm	Elexience	EK3147
Optische microscoop Zeiss AxioObserver Z1	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	431006-9901
Gemotoriseerde stage xy	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objectief	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objectief	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420781-9910
Zeiss filterset 02	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	488002-9901
Zeiss filterset 38HE	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	489038-9901
Zeiss filterset 31	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	000000-1031-350
Chemische dampkap	Erlab	Captair SD321
Deeltjesversneller	HVEE	singletron
Software
ImageJ software	National