Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Samenvatting

Perineurale invasie (PNI) is een veel voorkomend kenmerk van plaveiselcellencarcinoom in het hoofd-halsgebied (HNSCC), wat lagere overlevingspercentages tot gevolg heeft. De mechanismen ervan zijn slecht begrepen. Door gebruik te maken van neurites die gegenereerd zijn uit muisdorsale wortelganglia beperkt tot een semi-solide matrix, kunnen de paden die betrokken zijn bij de PNI van HNSCC-cellijnen worden onderzocht.

Samenvatting

Perineuraal invasie (PNI) wordt gevonden in ongeveer 40% van de plaveiselcarcinomen van het hoofd en de nek (HNSCC). Ondanks multimodaal behandelen met chirurgie, bestraling en chemotherapie, komen locoregionale recidieven en distante metastasen voor in hogere percentages, en de algehele overleving is met 40% verlaagd in vergelijking met HNSCC zonder PNI. In vitro studies van de paden die betrokken zijn bij HNSCC PNI zijn historisch gezien uitdagend geweest vanwege het ontbreken van een consistent, reproduceerbaar assay. Hier wordt de aanpassing van de dorsale wortelganglion (DRG) assay beschreven voor de onderzoeking van PNI in HNSCC. In dit model worden DRG geoogst uit de wervelkolom van een geslachte naakte muis en geplaatst binnen een semi-solide matrix. In de daaropvolgende dagen worden neurites gegenereerd en groeien in een radiaal patroon vanuit de cellichamen van de DRG. HNSCC cellijnen worden vervolgens perifeer rond de matrix geplaatst en dringen preferentieel langs de neurites naar de DRG binnen. Deze methode staat snelle evaluatie van meerdere behandelingsvoorwaarden toe, met zeer hoge assay succespercentages en reproduceerbaarheid.

Inleiding

Carcinoom van de kop en nek (plattecellig celcarcinoom, HNSCC) is de zesde meest voorkomende kanker in de VS, met 10.000 sterfgevallen per jaar in het land en 300.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd¹. De algemene prognose voor HNSCC is de afgelopen decennia onveranderd gebleven op 50%. Perineurale invasie (PNI) is een van de meest prominente pathologische kenmerken die een slechte prognose voorspellen bij patiënten met HNSCC. Helaas komt PNI vaak voor bij HNSCC en kan het bij maximaal 40% van de HNSCC-patiënten worden gevonden^2,3.

PNI is het proces waarbij kwaadaardige cellen zich langs zenuwen naar aangrenzende weefsels verspreiden, wat zorgt voor hogere percentages van lokale en distante verspreiding. Dienovereenkomstig hebben PNI-positieve HNSCC-tumoren hogere percentages van locoregionale recidieven en distante metastasen, wat resulteert in een lagere algehele overleving in vergelijking met HNSCC-patiënten zonder PNI^4-8.

Hoewel de behandeling van patiënten met PNI meestal wordt gemaximaliseerd door chirurgie, bestraling en chemotherapie, zijn de algemene overlevingspercentages van deze patiënten nog steeds verlaagd met maximaal 40% in vergelijking met patiënten zonder PNI^9-11. Het is dus duidelijk dat de huidige behandelingsmethoden voor HNSCC niet effectief zijn in het verbeteren van de ongunstige prognose die gepaard gaat met PNI. De aanpak van het ontwikkelen van gerichte therapie tegen PNI in HNSCC is gehinderd door het slechte begrip van de factoren die dit proces reguleren. Dit is deels een gevolg van het ontbreken van een consistent in vitro model voor de studie van PNI in HNSCC.

In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen een in vitro model gebruikt voor het bestuderen van PNI, voornamelijk bij pancreas- en prostaatkanker^12-19. Dit model gebruikt de neurites die worden gegenereerd uit dorsale wortelganglia geïsoleerd uit muizen of ratten als een surrogaat voor grote zenuwinvasie. De dorsale wortelganglia worden vastgelegd in een factor-gedepleteerd semisolid matrix, een gesolubiliseerde basement membraaneiwitmix die wordt uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis-sarcoomcellen. Deze matrix maakt de uitgroei van de neurites en het volgen van enkele kankercellen langs deze neurites mogelijk. Hier wordt de aanpassing van dit model voor de onderzoek naar PNI in HNSCC beschreven.

Protocol

1. Voorbereiding van Cultuur Medium en gerechten (10 min)

1. Voeg 100 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de putjes van een 96-well V-bodemplaat.
2. Verwijderen van een pre-hoeveelheden verdeeld-flesje van ongeveer 100 pi van halfvaste matrix van het 20 ° C vriezer en plaats deze direct op het ijs.
   LET OP: Doe dit voorafgaand aan de dorsale wortel ganglion (DRG) oogst, omdat de halfvaste matrix duurt ongeveer 30 minuten naar vloeibare toestand te bereiken op het ijs, die nodig zijn voor de volgende stappen is. Als u de halfvaste matrix op ijs te allen tijde te houden zal resulteren een slechte kwaliteit matrix druppel.
3. Label glazen bodem kweken platen met permanente inkt, het creëren van unieke identificatoren in elk van de vier hoeken op de onderzijde van de plaat. Leg de platen op de kop op het ijs op de plaat oppervlak te koelen.
   Opmerking: Elke muis opbrengst 32-40 DRG, zodat labelen van 1 tot 40. Het is niet nodig om vooraf chill pihuisdier tips, zoals gekoelde tips zal opwarmen in de loop van het plaatsen van de matrix druppeltjes, mogelijk invoering van verschillen in de matrix consistentie.

2. Dissectie van muizen-DRG (45 min)

1. Euthanize een athymische naakt muis volgens specifieke laboratoriumprotocollen, bijvoorbeeld door het gebruik van een CO ₂ kamer en een thoracotomie.
2. Stel de dissectie gebied en microscoop. Gebruik de schone, gesteriliseerd, en platte onderkant van polystyreen containers voor 15- of 50-ml conische buizen.
   OPMERKING: Bovendien zijn zij geschikt voor gebruik als het ontleden ondergrond, zodat zij goedkoop, wegwerpbaar, en zorgen voor fixatie van de wervelkolom via pinnen of naalden. Gebruik alleen gesteriliseerde instrumenten en naalden.
3. Onder natuurlijk zicht Maak een longitudinale incisie langs de wervelkolom van de wortel van de staart aan het hoofd van de muis met een paar rechte of gebogen fijne schaar.
4. Gebruik dezelfde schaar om dwars verdelen onder de sacral wervelkolom. Ontleden beide zijden van de wervelkolom helemaal tot aan de schedelbasis met de schaar. Op dit punt, opdat de cervicale wervelkolom craniaal wat wordt doorsneden mogelijk met een schaar.
5. Acht het cervicale uiteinde van de wervelkolom onder behandelmicroscoop gering vermogen. De witte ruggenmerg blijkt in het midden van een benige ring, die wordt omgeven door variabele hoeveelheden paraspinale spieren en zacht weefsel.
6. Splits de dorsale of hoger aspect van de eerste 2-3 wervels met microscopische voorjaar schaar. Met de veerwerking van de schaar, opent deze eerste bot snijden zodat het wervellichaam ontleding trad op de middellijn. Ga verder in kleine stappen in de richting van de sacrale wervelkolom, en dan halveren de ruggengraat door het invullen van de identieke bezuinigingen op het ventrale of inferieure aspect van de wervellichamen.
   Opmerking: Het niet zorgen voor de middellijn dissectie van de benige wervelkolom zal leiden tot een lagere opbrengst DRG.
7. bij this punt wordt de wervelkolom in twee helften verdeeld. Plaats een hemi-rug opzij, met het ruggenmerg op zijn plaats en naar beneden op een steriele plaat.
   Opmerking: Het verlaten van de ruggenmerg in plaats voorkomt de DRG uitdrogen, de DRG diep naar het ruggenmerg.
8. Secure beide uiteinden van de andere hemi-rug met twee 18-gauge naalden op de polystyreen ontleden platform. Vanaf het cervicale uiteinde (hetgeen blijkt doordat de wervelkolom is smaller, DRG dichter bij elkaar en er rib inserties) voorzichtig afpellen het ruggenmerg ongeveer 4 vertebrale niveaus.
9. Houd u aan de gevoelszenuwen (meestal twee) die de DRG. In het gebied waar de zenuwen te voegen aan de DRG, voorzichtig grijpen van de omliggende fascia met een microscopische pincet. Ontleden en trim dit fascia en andere zenuwweefsel met de microscopische veer schaar om vrij te maken van de DRG. Gentle terugtrekking zal de DRG uit zijn positie te brengen binnen de benige wervelkolom.
   LET OP: Het verhogen van demicroscoop vermogen bij deze stap is gunstig. Crush de DRG de groei van neurieten aanzienlijk beperken. Dit wordt voorkomen door de DRG nooit direct grijpen, maar door grijpen van de omringende fascia.
10. Snijd de perifere zenuw (DRG heeft over het algemeen een perifere zenuw, die diep ten opzichte van het ontleden weergave) met de microscopische veer schaar om de DRG vrij te geven.
    Opmerking: Het is het gemakkelijkst te bepalen waar de zenuwuiteinden en DRG begint tijdens spanning, dus waardoor deze verlaging zo dicht mogelijk bij de DRG op dit punt is ideaal. Zodra dit distale tak wordt gesneden, worden de proximale takken als goed getrimd.
11. Trim de DRG van elke verdwaalde zenuwvezels of fascial bijlagen met de microscopische voorjaar schaar. Na adequate isolatie, plaatst u de DRG in de kamertemperatuur medium binnen de 96-well V-bodemplaat.
    LET OP: Het plaatsen van een donkere achtergrond onder de plaat maakt het visualiseren van de sub-mm wit DRG gemakkelijker. Alleen plaats een DRG in each goed; Zo kunnen ze worden verwerkt gemakkelijker in de daaropvolgende stappen.
12. Herhaal dit proces helemaal naar beneden een hemi-wervelkolom en dan de andere. Elke kant levert 16-20 DRG's, in totaal 32-40.
    Opmerking: Als er minder dan DRG wordt de ontleding van de wervelkolom moet verder craniale en / of caudaal te voeren. De DRG's worden steeds minder goed gedefinieerd als een verloopt caudaal.

3. Voorbereiding van semisolid Matrix Droplets (<1 min per plaat)

1. Verwijder één glas goed bodemplaat van ijs en plaats het op een ijsblok onder de operationele microscoop. Controleer de hoeveelheid matrix blijft op ijs te allen tijde.
2. Plaats een 1,5-ul druppel matrix in elk van de vier hoeken van de glazen bodemplaat met 2-pl of 10 pl micropipet, waardoor een afstand tenminste zo groot als de druppel zich van de rand van het glas ook.
   1. Plaats de punt van de pipet rechtstreeks ophet glas in een hoek van 45 graden. pipet langzaam de matrix. af te stappen langzaam van de glazen bodem nadat de matrix is ​​actief op het bord.
      NB: De oppervlaktespanning tussen de matrix en glas zou een perfecte halve bol te creëren elke keer.
   2. Stoppen pipetteren net voor de tip leeg omdat onbedoelde injectie van lucht in de matrix druppel maakt de diameter van de druppel matrix veel groter en is moeilijk te verwijderen.
      LET OP: Het gebruik van een tweede hand om de pipetteren de hand te stabiliseren vergemakkelijkt meer nauwkeurige plaatsing.

4. Het inbrengen van DRG in semisolid Matrix Droplets (<2 min per plaat)

1. Laat de plaat met de matrix druppels kort bij kamertemperatuur (~ 1 min). Dit verstijft licht de matrix, waardoor het gemakkelijker voor de precieze plaatsing van de DRG.
2. Scoop (niet begrijpt) de DRG voorzichtig met gesloten microscopische pincet in de linkerhand. Nogmaals, een donkere achtergrond tegen de kleine, witteDRG faciliteert visualisatie. Breng de DRG aan het uiteinde van een 21-gauge naald in de rechterhand. Deze overdracht zal de resterende media laten op de tang.
3. Steek de DRG in het midden van de matrix druppel via een 21-gauge naald (figuur 1). De meeste van de tijd, zal de DRG gemakkelijk los in de matrix en dan kan centraal worden geplaatst met de naald.
   1. Als de DRG kleeft aan de naald, gebruik maken van de microscopische tang om de DRG te duwen off van de naald en in de matrix druppel. Wick overtollige papier uit de microscopische tang met een lab te vegen.
      OPMERKING: Invoering media aan de matrix zal de diameter, volume en consistentie van de test te veranderen. Een ijsblok met kleur of gekleurde schrijven geeft achtergrondinformatie contrast, waardoor visualisatie van deze delicate proces vergemakkelijkt.
4. Nadat de plaat vier DRG, voeren een eindcontrole zodat de DRG in het midden van de matrix druppel. aanpassingen makenals dat nodig is met de 21-gauge naald.
5. Breng de voltooide plaat om een ​​37 ° C incubator. Dit zal de halfvaste matrix stollen en bevestig de DRG in positie.
6. Herhaal dit proces voor alle DRG. Plaats lege matrix druppels zonder DRG als de negatieve controle.
7. Voeg 4 ml DMEM met 10% FBS media elke glazen bodemplaat na het voltooien van alle platen en bloot te stellen aan de 37 ° C incubator gedurende ten minste 3 min. Plaats de plaat onder een kleine hoek en voeg langzaam het medium, zodat het geleidelijk in contact komt met de matrix-DRG eenheden.
   OPMERKING: Als het medium te snel of krachtig wordt toegevoegd, de matrix en / of DRG kan verdreven worden.
8. Bewaar de assays in de 37 ° C incubator gedurende de volgende 48-72 uur.
   OPMERKING: Periodiek onderzoek van de assays zullen omtrek uitgroei van neurieten naar de matrix (figuur 2) tonen. Wanneer de neurieten groter zijn dan driekwart van de weg aan de matrix, tegeschikt is om de cellen te plaat.

5. Voorbereiding van de Head and Neck Cancer Cells

Opmerking uitzondering hoofd en hals plaveiselcel carcinoma cellen Cellijnen kunnen worden gebruikt in deze experimentele ontwerp.

1. Onderhouden plaveiselcelcarcinoom cellijnen in DMEM met 10% FBS bij voorkeur kolven of kweekschalen in een 37 ° C incubator. Om cellen voor experimenten, zuig al het medium uit de kolf of schotel te bereiden en was het twee keer met PBS. Suspendeer de cellen door toevoeging van een geschikte hoeveelheid van 0,025% trypsine gedurende 5 minuten, gevolgd door DMEM met 10% FBS. Pipetteer 4 ml van de cel en media mengsel in 6 ml kweekschalen.
   OPMERKING: Een 6-mL kweekplaat biedt meer dan genoeg cellen, zelfs wanneer er minder dan 50% confluent.
2. Blootstellen HNSCC cellijnen verschillende omstandigheden 24 uur voor kleuring en uitplaten op DRG assay. Re-dosis de toestand zodra de cellen worden bedekt om een ​​consistente environme behoudennt.
   OPMERKING: antilichamen, groeifactoren, cytokinen, of andere moleculen Naar de celkweekschalen 1-2 dagen na dissectie muis en implantatie van de DRG in de matrix.
3. Voeg fluorescerende cel vlekken 1 uur voor het uitplaten van de cellen (2-3 dagen na de oogst en DRG implantatie in de matrix).
   LET OP: De bijzondere vlekken die hier gebruikt passeren vrij door het celmembraan; echter, na een reactie met intracellulaire thiolgroepen, de vlek blijft in de cel en wordt doorgegeven aan dochtercellen. De kleuring aanzienlijk vergemakkelijkt visualisatie in de assays. Deze tijdelijke vlekken zijn ideaal voor deze testen omdat de fluorescentie aanwezig is 2 - 3 dagen, welke de looptijd van deze experimenten. Het maakt ook het gebruik van veel verschillende kleuren en ondervangt de behoefte bestaat fluorescerend eiwit getransfecteerde cellijnen.
   1. Bereid 10 uM kleurstofoplossing door het mengen van 2 pl van 10 mM stock cel vlekken in 2 ml serumvrij DMEMvoor elke cel staat. Warm deze tot 37 ° C alvorens het aan cellen.
   2. Verwijder het kweekmedium binnen de 6-mL plaat, waardoor de hechtende HNSCC cellen op het bord. Voeg 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en verwijder 2 ml van de 10 uM cel vlek / serumvrij DMEM toegevoegd aan elke plaat
   3. Zet de 6-mL cultuur plaat met de cel vlek op de 37 ° C incubator gedurende 40 minuten.
   4. Na 40 min, zuig het medium. Voeg 2 ml PBS en zuig het dan. Voeg 1 ml 0,025% trypsine aan elke plaat en vervangen in de 37 ° C incubator.
   5. Voeg 2 ml DMEM met 10% FBS na 3-5 minuten en breng de gesuspendeerde cellen een 15-ml conische buis. Draai de cellen opnieuw gesuspendeerd ze in 1 ml DMEM met 10% FBS.
   6. Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter, en vervolgens toevoegen DMEM 10% FBS tot een uiteindelijke celconcentratie van 300.000 cellen per ml te maken.

6. Plating Head en Neck kankercellen

1. Verwijder de glazen bodem platen met de matrix-DRG assays uit de incubator.
   OPMERKING: Ook zijn zij geschikt als neurieten ten minste 75% van de weg naar de rand van de matrix, die gewoonlijk plaatsvindt na 2-3 dagen. Dit is het beste te zien met behulp van ten minste een 10X objectief.
2. Zuig het medium binnen de glazen bodemplaat. Volledig zuig het medium binnen het glas goed zonder het verwijderen van de matrix-DRG-eenheden.
3. Opstellen 200 pi van de 300.000 cellen / ml medium met een 200-gl pipet. Plaats twee druppels van de cellen over elke matrix-DRG assay. Voer deze stap voor elke matrix druppel, het creëren van vier herhalingen van elke cel staat op een bord.
   OPMERKING: De halfronde vorm van de matrix kan de cellen zich in een ring langs de omtrek van de assay (figuur 3a, figuur 3b). Het vinden van een pipet met een gladde trekker maakt plaatsing van uniforme daalt veel gemakkelijker.
4. Bevestig soortgelijke cel aantallen en distribution van de verschillende cel voorwaarden 4X microscopie.
5. Plaats de glazen bodem platen in de 37 ° C incubator gedurende ongeveer 60 minuten. OPMERKING: Hoewel er slechts een klein volume van cellen en media (~ 150 pi) zijn de assays niet uitdrogen tot enkele uren incubator tijd is verstreken.
6. Na 60 min zachtjes voeg 4 ml DMEM met 10% FBS aan de zijwand van de glazen bodemplaat.
   OPMERKING: Over een periode van tijd, de cellen gedeeltelijk hechten aan de plaat bodem en de werkwijze van het toevoegen van het medium niet de cellen verstoren. Verschillende celtypen maken meer of minder tijd om te beginnen zich te houden aan de glazen bodemplaat.
7. Vervang exogene groeifactoren of geneesmiddelen op dit moment de vorige concentratie vast te houden.
8. Zet de assays voor de 37 ° C incubator, behalve wanneer zij microscopisch onderzocht. Kwantificeren van de resultaten van deze test door microscopische beeldvorming. In het kort, de telling van de strengen van perineurale invasie metin vier kwadranten met behulp van een afbeelding 4X microscopische.
   LET OP: Een microscoop met een 4X doelstelling en fluorescentie mogelijkheden is geschikt voor foto-documenteren van de testen. De grootte van de assays ligt goed binnen het gebied van een 4X doelstelling, die genoeg is om de afzonderlijke gebieden van perineurale invasie vangen is gedetailleerd. Perineurale invasie duidelijk na 24 uur, maar na 48 uur, de integriteit van de testen begint te verzwakken, omdat de tumorcellen te verdelen langs de omtrek van de matrix en binnenvallen. Dan 48 uur is er ook aanzienlijke uitstroming van fibroblasten van de DRG, die visualisatie verduistert behulp helderveld microscopie. Daarom is het raadzaam om foto-document de resultaten 4X microscopie ten minste twee keer het venster (bijvoorbeeld op 24 en 48 uur na het uitplaten van de tumorcellen). Wees ervan bewust dat deze 3-dimensionale assays, en het is moeilijk om volledig beeld de gehele test. Meest perineurale invasie plaatsvindt in een vlak van de bodem van de plaat, waarbij thij cellen zijn ingebed in de matrix iets boven de bodem van het schaaltje. Omdat dit vlak ligt vlakbij horizontaal, de meeste neurieten met tumorcellen opname één-niveau in 4X.

Resultaten

Na dissectie van de DRG en de plaatsing in de matrix druppel dient het uiterlijk van de assay lijken Figuur 1. Merk op dat de DRG niet perfect rond, maar het is gecentreerd in de matrix druppel. Dit maakt de uitgroei van neurieten in 360 graden, gedeeltelijk in figuur 2 getoond. Wees ervan bewust dat bepaalde delen van de DRG sturen neurieten sneller en in grotere aantallen dan andere, typisch aangeeft waar de efferente en afferente zenu...

Discussie

Kritische stappen in het protocol

De belangrijkste stappen in dit protocol zijn de precieze dissectie en extractie van de dorsale wortel ganglia. Goede doorsnijding van de wervelkolom en een middellijn-longitudinale tweedeling hemi-stekels zijn essentieel voor het verkrijgen van grote aantallen DRG. Bij de dissectie van individuele DRG, de ganglion nooit rechtstreeks behandeld, maar de omringende fascia worden vastgepakt met de microscopische pincet. Gebeurt dit niet resulte...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM/F-12 50/50 Mix met L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetaal bovien serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0,25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Fosfaat gebufferde Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Muis	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma bestraalde 35 mm glazen bodem kweekschalen	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operatiemicroscoop	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I lichtbron	Schott	A20500	Duitsland
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Naald 18 G en 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissectie Pincet	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fijne Standaard Operatieschaartjes	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Veerschaar	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymische naakte muizen (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME